Cai, Ganhui. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2013. / Includes bibliographical references (leaves 160-192). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des outils puissants pour explorer la genèse des différents tissus de l’organisme, notamment le tissu hématopoïétique. Dans le but d’obtenir des types cellulaires cliniquement utiles, la majorité des travaux se sont concentrés sur l’obtention des cellules hématopoïétiques terminales, notamment des cellules lymphoïdes (lymphocytes B, lymphocyte T et cellules NK), à partir des cellules souches pluripotentes humaines. En revanche, le rendement des cellules hématopoïétiques obtenues dans ce modèle reste faible. D’autre part, les étapes précoces de l’hématopoïèse, notamment l’identification de la cellule souche hématopoïétique (CSH), des progéniteurs myéloïdes et lymphoïdes à partir des cellules souches pluripotentes, sont encore très peu définies. Nous nous sommes intéressés aux étapes précoces de la lymphopoïèse dans le modèle des CSEh. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de l’homéoprotéine HOXB4 dans l’expansion des progéniteurs NK dérivés des CSEh. Nous avons montré que l’exposition des cellules des corps embryonnaires (EB pour Embryoid Body), dérivées de la différenciation des CSEh, à la lignée MS-5/SP-HOXB4, une lignée modifiée qui exprime constitutivement HOXB4, induit une expansion des progéniteurs NK dérivées des CSEh. De plus, les cellules NK qui en dérivent sont matures et fonctionnelles, de part leur activité cytolytique vis-à-vis d’une lignée érythro-leucémique (K562). Outre l’effet de HOXB4 sur l’expansion des progéniteurs NK, cette étude a permis de démontrer en particulier le rôle de la lignée stromale MS-5 dans l’induction de la spécification lymphoïde à partir des CSEh. Dans un deuxième temps, nous avons analysé plus précisément les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine à partir des CSEh. En effet, nous avons montré, au cours de la première partie, que la coculture des cellules dérivées des EB avec MS-5 induit l’expression en surface du CD45RA, un marqueur de spécification lymphoïde, au sein des progéniteurs hématopoïétiques CD34+. Ainsi, sur la base de ces données et des données antérieurs concernant les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine fœtale et adulte, nous avons identifié et caractérisé in vitro à partir des CSEh deux populations originales de progéniteurs lymphoïdes précoces multipotents (MELP pour Myeloid Early Lymphoid Progenitor): La progéniteur CD34+CD45RA+CD7+ dont le potentiel de différenciation est biaisé vers le lignage T et NK ; et le progéniteur CD34+CD45RA+CD7- a un potentiel de différenciation biaisé vers les lymphocytes B. Cette étude a un intérêt dans la compréhension du processus de la lymphopoïèse humaine dans le modèle des cellules souches pluripotentes. En perspective, ces données pourraient avoir également un intérêt dans la modélisation de maladie de défauts génétiques de développement du système lymphoïde. / Human embryonic stem cells (hESC) are powerful tools to explore tissue genesis of the organism, especially hematopoietic tissue. In order to obtain cellular types clinically useful, the majority of works have been focalised on final output of hematopoietic cells, especially lymphoid cells (lymphocyte B, lymphocyte T and NK cells), from human pluripotent stem cells. However, the obtained hematopoietic cells yield is very poor. In the other hand, initial steps of hematopoiesis, especially the identification of the hematopoietic stem cell, myeloid and lymphoid progenitors, from pluripotent stem cells, are poorly defined. We were interested to early steps of lymphopoisis in the hESC model. Initially, we studied the role of HOXB4 homeprotein on CSEh-derived NK progenitor. We showed that exposure of embryoid body (EB), derived from hESC, to the modified line that express constitutively HOXB4 “MS-5/SP-HOXB4”, induce hESC-derived NK progenitor expansion. Furthermore, the derived NK cells are mature and fonctionnal, by cytolytic activity on erythro-leucemic line K562. Furthermore the effect of HOXB4 on NK progenitor expansion, this study demonstrated, particularly the role of MS-5 line on the lymphoid specification from hESC.Secondly, we analysed more precisely the early steps of human lymphopoiesis from hESC. We showed, in the first part, that MS-5 coculture of the EB-derived cells induce surface expression of CD45RA (marker of lymphoid specification) on hematopoietic progenitor CD34+. Thus, on the basis of these data and previous data concerning the initial steps of fetal and adult lymphopoiesis, we identified and characterized in vitro from hESC, two populations of multipotent early lymphoid progenitor (MELP): the CD34+CD45RA+CD7+ progenitor whose the differentiation potential is biased to T and NK lineage, and the CD34+CD45RA+CD7- progenitor has differentiation potential biased to B lineage. This study is essential in understanding of normal and pathological lymphopoisis process in pluripotent stem cells model. Additionally, this study paves the way for the modeling of genetic disorders of lymphoid system.

A proteína eIF5A apresenta um resíduo exclusivo de aminoácido chamado hipusina formado por modificação pós-traducional envolvendo espermidina como substrato. Neste estudo, observamos que a expressão de eIF5A é intensificada ao longo da diferenciação de células-tronco progenitoras de fibras musculares (células satélites) e que a inibição da hipusinação com GC7 bloqueia a diferenciação. Associado a esse bloqueio encontramos aumento do consumo de glicose e produção de lactato, diminuição da descarboxilação de glicose e palmitato, redução da proliferação celular e alteração do perfil traducional, efeitos que podem estar envolvidos na inibição do programa de diferenciação. Em seguida, o músculo tibial anterior de ratos foram criolesados e após severa supressão da expressão de eIF5A (período agudo de lesão) a mesma foi retomada ao longo da regeneração, chegando a quantidades superiores ao encontrado em músculos não lesados. Verificamos que a L-arginina, um supressor parcial do fenótipo distrófico e precursor de espermidina, reverte parcialmente o efeito de GC7. / eIF5A protein contains an exclusive amino acid residue named hypusine produced by a post-translational modification involving spermidine as substrate. In this study, we observed that eIF5A expression is raised during muscle fiber stem cells (satellite cells) differentiation and the hypusination inhibition by GC7 abolished the differentiation process. In association with this blockage, an increase in glucose consumption and lactate production, a decrease in glucose and palmitate decarboxylation, a reduction in cell proliferation and an alteration in translational profile were observed. These changes may be involved in the inhibition of the differentiation induced by GC7. The rat tibialis anterior muscle was injured and a marked reduction of eIF5A expression (acute injury period) was found. The expression of eIF5A was reestablished during regeneration, reaching higher levels than that observed in non injured muscle. We also verified that L-arginine, a partial suppressor of muscle dystrophic phenotype condition and precursor of spermidine, partially abolished the GC7 effects.

Network densification has become a dominant theme for capacity enhancement in cellular networks. However, it increases the operational complexity and expenditure for mobile network operators. Consequently, the essential features of Self-Organising Networks (SON) are considered to ensure the economic viability of the emerging cellular networks. This thesis focuses on quantifying the benefits of self-organisation in Cloud Radio Access Network (C-RAN) by proposing a flexible, energy efficient, and capacity optimised system. The Base Band Unit (BBU) and Remote Radio Head (RRH) map is formulated as an optimisation problem. A self-optimised C-RAN (SOCRAN) is proposed which hosts Genetic Algorithm (GA) and Discrete-Particle-Swarm-Optimisation algorithm (DPSO), developed for optimisation. Computational results based on different network scenarios demonstrate that DPSO delivers excellent performances for the key performance indicators compared to GA. The percentage of blocked users is reduced from 10.523% to 0.409% in a medium sized network scenario and 5.394% to 0.56% in a vast network scenario. Furthermore, an efficient resource utilisation scheme is proposed based on the concept of Cell Differentiation and Integration (CDI). The two-stage CDI scheme semi-statically scales the number of BBUs and RRHs to serve an offered load and dynamically defines the optimum BBU-RRH mapping to avoid unbalanced network scenarios. Computational results demonstrate significant throughput improvement in a CDI-enabled C-RAN compared to a fixed C-RAN, i.e., an average throughput increase of 45.53% and an average blocked users decrease of 23.149% is experienced. A power model is proposed to estimate the overall power consumption of C-RAN. Approximately 16% power reduction is calculated in a CDI-enabled C-RAN when compared to a fixed C-RAN, both serving the same geographical area. Moreover, a Divide-and-Sort load balancing scheme is proposed and compared to the SOCRAN scheme. Results show excellent performances by the Divide-and-Sort algorithm in small networks when compared to SOCRAN and K-mean clustering algorithm.

Os genes homeobox são responsáveis por codificar proteínas nucleares que agem como fatores de transcrição durante o desenvolvimento embrionário, regulando proliferação e diferenciação celular. A expressão alterada do gene homeobox PROX1 já foi identificado em diferentes neoplasias, incluindo mama, esôfago, fígado, sistema biliar, linfomas e cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da superexpressão do gene PROX1 em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide bucal nos mecanismos de proliferação e diferenciação celular, apoptose e perfil global de expressão gênica. Após a superexpressão deste gene na linhagem celular SCC-9, foi realizada a análise de proliferação por meio dos ensaios de curva de proliferação celular, citometria de fluxo, índice de incorporação de BrdU ao DNA e expressão de Ki67. A diferenciação celular foi verificada por meio de reações imunocitoquímicas para as citoqueratinas 1, 10, 13, 14, 16, 18 e 19 e a apoptose foi avaliada por meio de células positivas para anexina-V e iodeto de propídeo. O ensaio de microarray foi realizado para avaliação do perfil global de expressão gênica na linhagem celular SCC9 com superexpressão do gene PROX1. Observou-se que a superexpressão do gene PROX1 promove redução da proliferação celular, bem como reduz a expressão das citoqueratinas 1, 13, 18 e 19. Não houve alteração na taxa de apoptose entre as células com superexpressão do gene PROX1 e controles. Os resultados do microarray revelaram a expressão diferencial significante de genes envolvidos com os processos de desenvolvimento, adesão e invasão celular. Desta maneira, estes resultados são fortemente sugestivos de que o gene PROX1 inibe a proliferação celular e contribui para a diferenciação do carcinoma epidermóide bucal. / Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Altered expression of PROX1 homeobox gene is related to many cancers, including those of the breast, esophagus, liver, billiary system and lymphomas. The aim of this study was evaluate the effects of PROX1 overexpression, in an oral squamous cell carcinoma cell line, on cellular proliferation and differentiation, apoptosis as well as gene expression prolfile. After overexpression of PROX1 gene in SCC9 cell line, proliferation was assessed by proliferation curve, flow citometry, BrdU incorporation to DNA and Ki67 expression. Cell differentiation was verified by immunocytochemistry to cytokeratins 1, 10, 13, 14, 16, 18 and 19 and apoptosis was measured by annexin V positive cells. Gene expression profile was analyzed by microarray in PROX1-overexpressing cells and control. PROX1-overexpressing cells showed a statistically significant decrease in proliferation as well cytokeratin 1, 13, 18 and 19 expression. No significant differences from controls and PROX1- overexpressing cells were observed in apoptosis. Microarray analyses showed differential expression of genes related to development, cellular adhesion an invasion. Our results strongly suggest that overexpression of PROX1 inhibit cell proliferation and contributes to differentiation of oral squamous cell carcinoma.

Os genes homeobox são responsáveis por codificar proteínas nucleares que agem como fatores de transcrição durante o desenvolvimento embrionário, regulando proliferação e diferenciação celular. A expressão alterada do gene homeobox PROX1 já foi identificado em diferentes neoplasias, incluindo mama, esôfago, fígado, sistema biliar, linfomas e cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da superexpressão do gene PROX1 em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide bucal nos mecanismos de proliferação e diferenciação celular, apoptose e perfil global de expressão gênica. Após a superexpressão deste gene na linhagem celular SCC-9, foi realizada a análise de proliferação por meio dos ensaios de curva de proliferação celular, citometria de fluxo, índice de incorporação de BrdU ao DNA e expressão de Ki67. A diferenciação celular foi verificada por meio de reações imunocitoquímicas para as citoqueratinas 1, 10, 13, 14, 16, 18 e 19 e a apoptose foi avaliada por meio de células positivas para anexina-V e iodeto de propídeo. O ensaio de microarray foi realizado para avaliação do perfil global de expressão gênica na linhagem celular SCC9 com superexpressão do gene PROX1. Observou-se que a superexpressão do gene PROX1 promove redução da proliferação celular, bem como reduz a expressão das citoqueratinas 1, 13, 18 e 19. Não houve alteração na taxa de apoptose entre as células com superexpressão do gene PROX1 e controles. Os resultados do microarray revelaram a expressão diferencial significante de genes envolvidos com os processos de desenvolvimento, adesão e invasão celular. Desta maneira, estes resultados são fortemente sugestivos de que o gene PROX1 inibe a proliferação celular e contribui para a diferenciação do carcinoma epidermóide bucal. / Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Altered expression of PROX1 homeobox gene is related to many cancers, including those of the breast, esophagus, liver, billiary system and lymphomas. The aim of this study was evaluate the effects of PROX1 overexpression, in an oral squamous cell carcinoma cell line, on cellular proliferation and differentiation, apoptosis as well as gene expression prolfile. After overexpression of PROX1 gene in SCC9 cell line, proliferation was assessed by proliferation curve, flow citometry, BrdU incorporation to DNA and Ki67 expression. Cell differentiation was verified by immunocytochemistry to cytokeratins 1, 10, 13, 14, 16, 18 and 19 and apoptosis was measured by annexin V positive cells. Gene expression profile was analyzed by microarray in PROX1-overexpressing cells and control. PROX1-overexpressing cells showed a statistically significant decrease in proliferation as well cytokeratin 1, 13, 18 and 19 expression. No significant differences from controls and PROX1- overexpressing cells were observed in apoptosis. Microarray analyses showed differential expression of genes related to development, cellular adhesion an invasion. Our results strongly suggest that overexpression of PROX1 inhibit cell proliferation and contributes to differentiation of oral squamous cell carcinoma.

O Proepicárdio (PE) é uma estrutura transitória que dá origem aos componentes dos vasos coronários. Para avaliar seu potencial vascular em sítio adulto, transplantamos um coração neonatal para o pavilhão auricular de um animal adulto. Duas semanas depois, 2 PEs de embriões GFP+ foram transferidos para a superfície deste coração. Em outro grupo, transferimos os PEs diretamente para o pavilhão auricular. Para avaliar a incorporação de células GFP, e investigar sua diferenciação realizamos ensaios de imunofluorescência (IF) para GFP em combinação com outros marcadores. A adição do PE em sítio adulto teve como resultado a participação deste em processos de vasculogênese, iniciando a formação de novos vasos sanguíneos via formação de ilhotas sanguíneas e em um processo angiogênico, diferenciando-se em células endoteliais que se incorporaram aos vasos já existentes. Baseados nisso podemos afirmar que o PE possui potencial vasculogênico/angiogênico em sítio adulto, podendo ser exploradas como modelo para revascularização cardíaca e recuperação de tecidos vasculares. / The Proepicárdio (PE) is a transient structure giving rise to all components of the coronary vessels. To evaluate the vasculogenic potential of the PE in an adult site, a neonatal heart was transplanted into the subcutaneous of an adult ear Later, two PE from GFP-transgenic mice were transferred to the surface of this heart. In another group, we transferred the PEs directly into the ear pinna. To evaluate the incorporation of GFP cells derived from the PE, and to investigate their possible differentiation, we performed immunofluorescence (IF) for GFP in combination with other markers. The addition of PE in an adult site resulted in its participation in a vasculogenic and in an angiogenic processes. Based on this we conclude that PE cells can differentiate and likely participate in a neovascularization process when transplanted to adult sites. These findings demonstrate that the vasculogenic potential of the PE cells is conserved in an adult site and our model is adequate to study the mechanisms involved in the development and regeneration of vasculature.

As fraturas e perdas ósseas representam altos riscos para o Sistema público de Saúde (SUS), além de afetar a qualidade de vida do paciente, portanto é necessário o entendimento das bases moleculares que envolvem os mecanismos de reparo ósseo. Citocinas secretadas por células do sistema imune presentes no local da inflamação, como as IL-6, IL-10 e TNFα atuam como fatores quimiotáticos para células mesenquimais, que proliferam e se diferenciam em osteoblastos pela ação autócrina e parácrina de Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs), principalmente a BMP2. Embora seja conhecido que a ação de BMP2 ocorra através de sua ligação nos receptores ActRI/BMPR, que ativam proteínas SMADS 1/5/8 efetoras, pouco se sabe sobre os mecanismos intracelulares que participam do processo de diferenciação osteoblástico. Neste estudo propôs-se analisar as diferenças no conteúdo de proteínas totais e de proteínas fosforiladas em células mesenquimais de pele induzidas à osteogênese pelo tratamento com BMP2 por diferentes períodos de tempo, utilizando-se de Isótopos Estáveis de Dimetila acoplado ao LC/MS. A partir de 150µg de material inicial, foi possível identificar 2.264 proteínas, as quais foram quantificadas nos diferentes pontos de indução, sendo que 235 são fosforiladas. Análise de motivos de quinases mostrou que diversos substratos possuem sítios fosforilados correspondentes àqueles dos motivos de fosforilação das quinases Casein Kinase, p38, CDK e JNK. A análise da ontologia gênica mostrou um aumento de processos biológicos relacionados com sinalização e diferenciação após a primeira hora de indução com rhBMP2. Além disso, proteínas envolvidas com o rearranjo do citoesqueleto e com vias de sinalização Wnt e Ras foram encontradas como tendo fosforilação diferencial durante todos os períodos estudados. Os dados revelaram novos substratos intracelulares que são fosforilados nos primeiros momentos do comprometimento com a diferenciação osteoblástica mediada pelo tratamento com rhBMP2 em células mesenquimais derivadas da pele. Além disso, clones celulares que superexpressam as proteínas recombinantes humanas BMP2 e BMP4 foram gerados, e sua atividade verificada in vitro. Paralelamente, a rhBMP7, obtida anteriormente, foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando-se uma coluna de Heparina-Sepharose, que foi posteriormente utilizada para ensaios in vitro e in vivo, nos quais se mostrou capaz de gerar osteoblastos e tecido ósseo, respectivamente, o que abre novas possibilidades para o uso destas proteínas como biofármacos no Brasil. / Bone fractures and loss represent significant costs for the public health system and often affect the patients quality of life, therefore, understanding the molecular basis for bone regeneration is essential. Cytokines, such as IL-6, IL-10 and TNFα, secreted by inflammatory cells at the lesion site, at the very beginning of the repair process, act as chemotactic factors for mesenchymal stem cells, which proliferate and differentiate into osteoblasts through the autocrine and paracrine action of bone morphogenetic proteins (BMPs), mainly BMP-2. Although it is known that BMP-2 binds to ActRI/BMPR and activates the SMAD 1/5/8 downstream effectors, little is known about the intracellular mechanisms participating in osteoblastic differentiation. We assessed differences in the phosphorylation status of different cellular proteins upon BMP-2 osteogenic induction of isolated human skin mesenchymal stem cells using Triplex Stable Isotope Dimethyl Labeling coupled with LC/MS. From 150 µg of starting material, 2,264 proteins containing two or more peptides were identified and quantified at five different time points, 235 of which are differentially phosphorylated. Kinase motif analysis showed that several substrates display phosphorylation sites for Casein Kinase, p38, CDK and JNK. Gene ontology analysis showed an increase in biological processes related with signaling and differentiation at early time points after BMP2 induction. Moreover, proteins involved in cytoskeleton rearrangement, Wnt and Ras pathways were found to be differentially phosphorylated during all timepoints studied. Taken together, these data, allow new insights on the intracellular substrates which are phosphorylated early on during commitment to BMP2-driven osteoblastic differentiation of skin-derived mesenchymal stem cells. Cell clones overexpressing the human BMP 2 and 4 recombinant proteins were also generated, and their biological activity was confirmed in vitro. In parallel, chromatography-affinity purified rhBMP7, obtained using heparin-Sepharose columns, was used for in vivo and in vitro assays to evaluate the ability of this purified protein to generate osteoblasts and bone tissue, respectively, opening new avenues for the use of these proteins as biopharmaceuticals in Brazil.

As proteínas de choque frio pertencem a uma família de proteínas com um domínio altamente conservado, denominado domínio de choque frio (CSD). Estão envolvidas em vários processos celulares, incluindo adaptação a baixas temperaturas, estresse nutricional e fase estacionária. Em C. crescentus, uma <font face=\"Symbol\">&#945;-proteobacteria não patogênica, as proteínas CspC e CspD apresentam dois CSDs e seus níveis aumentam apenas durante a fase estacionária. Este trabalho tem como objetivo determinar os fatores de transcrição e sinais celulares envolvidos na regulação do gene cspC em C. crescentus. No presente trabalho, foi realizada a varredura de uma biblioteca de 4000 clones mutados pela inserção do transposon Tn5, onde foram identificados sete mutantes com expressão reduzida de cspC: CCNA03569 (proteína hipotética); CCNA02510 (deacetilase de oligossacarídeos); CCNA01594 (metiltransferase da proteína ribossomal L11); CCNA02186 (pequena subunidade da acetato lactato sintase); CCNA00084 (fosforibosil aminoimidazol carboxamida formiltransferase/ IMP ciclohidrase); CCNA03616 (sulfito redutase dependente de NADPH) e CCNA01448 (frutose-1,6-bisfosfatase). Através de ensaios de expressão na presença de um meio condicionado, verificou-se que cspC e cspD aparentemente não são induzidos em resposta ao aumento de densidade populacional. O fenótipo do mutante cspC na fase estacionária foi avaliado em relação a sua resistência a estresse oxidativo, e vimos que a linhagem <font face=\"Symbol\">DcspC é altamente sensível ao peróxido de hidrogênio e a superóxidos, mas não é sensível a hidroperóxido orgânico. A ausência de cspC provavelmente é compensada por dps, já que a expressão deste gene aumenta no mutante <font face=\"Symbol\">DcspC. Por outro lado, a transcrição de katG diminui, mas as atividades de KatG e SodB não são afetadas no mutante cspC. Em condições de estresses provocados por peróxido de hidrogênio, sacarose e sal a expressão de cspC não é afetada. Os fatores sigmas SigT e SigU e o regulador de transcrição Fur não estão envolvidos na regulação de cspC, mas no mutante <font face=\"Symbol\">DsigJ a expressão de cspC aumenta, e no mutante <font face=\"Symbol\">DoxyR ela é diminuída. Foi verificado também que cspC apresenta uma autoregulação positiva, que pode se dar por meio de estabilização de seu próprio mRNA. / The cold shock proteins belong to a family of proteins presenting a highly conserved domain, called cold shock domain (CSD). They are involved in various cellular processes, including adaptation to low temperature, nutritional stress, cell growth and stationary phase. In C. crescentus, a non-pathogenic <font face=\"Symbol\">&#945;-proteobacteria, the cold shock proteins CspC and CspD have two CSDs and they are induced during stationary phase. This study aims to determine the transcription factors and cellular signals involved in cspC gene regulation in C. crescentus. In the present study we scanned a library of 4000 mutant clones with the Tn5 transposon, from which seven mutants were identified presenting reduced expression of cspC: CCNA03569 (hypothetical protein); CCNA02510 (polysaccharide deacetylase); CCNA01594 (ribosomal protein L11 methyltransferase); CCNA02186 (acetolactate synthase 3 regulatory subunit); CCNA00084 (bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase); CCNA03616 (sulfite reductase (NADPH)) e CCNA01448 (fructose 1,6-bisphosphatase II). Expression assays in the presence of a conditioned medium, showed that cspC and cspD are apparently not induced in response to increased cell density. The phenotype of the mutant cspC was evaluated as to oxidative stress resistance in the stationary phase. The results showed that the <font face=\"Symbol\">DcspC strain is highly sensitive to hydrogen peroxide and superoxide but is not sensitive to organic hydroperoxide. The absence of cspC probably is compensated by dps, since the expression of this gene is increased in <font face=\"Symbol\">DcspC strain. In contrast, the transcritpion of katG is decreased, but the activities of KatG and SodB are not affected in the cspC mutant. Under conditions of stress caused by hydrogen peroxide, sucrose or salt, cspC expression is not affected. The sigma factors sigmas SigT and SigU and transcription regulator Fur are not involved in the regulation of cspC, but cspC expression is increased in <font face=\"Symbol\">DsigJ and decreased in <font face=\"Symbol\">DoxyR strains, respectively. It was also determined that cspC shows a positive autoregulation, which may occur via stabilization of its own mRNA.