Les thiopurines sont des médicaments cytotoxiques et immunosuppresseurs largement prescrits, notamment dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ils représentent l’un des meilleurs exemples d’application clinique de la pharmacogénétique avec le dépistage du déficit en thiopurine S-méthyltransférase (TPMT), enzyme clé du métabolisme des thiopurines. La variabilité interindividuelle de la réponse à ces médicaments rend nécessaire leur optimisation thérapeutique. Ce travail de thèse a d’une part, analysé les relations entre activité TPMT et concentrations des métabolites thiopuriniques, et d’autre part, recherché des facteurs associés à la résistance aux thiopurines. A l’aide d’une base de données pharmacogénétiques hospitalière et d’une étude « PheWAS » à partir d’un entrepôt de données cliniques, nous avons analysé la distribution et la corrélation génotype-phénotype pour la TPMT, en lien avec les concentrations des métabolites thiopuriniques. Nous avons observé qu’une activité TPMT très élevée (phénotype « ultra-rapide ») était associée à des paramètres clinico-biologiques reflétant une maladie évolutive et un traitement inefficace dans les MICI. De plus, une étude clinique rétrospective dans les MICI pédiatriques a permis d’identifier des facteurs associés à la lymphopénie observée sous thiopurines. Enfin, à partir d’un modèle in vitro fondé sur des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) sélectionnées, nous avons établi une signature transcriptomique, incluant 32 gènes, prédictive de la résistance aux thiopurines. Une analyse fonctionnelle bioinformatique a abouti à l’identification de voies métaboliques liées à la protéine p53 et au cycle cellulaire, ainsi que des mécanismes moléculaires associés à la résistance aux thiopurines. En conclusion, ce travail de thèse, qui a exploré la variabilité de réponse aux thiopurines et tout particulièrement la résistance à ces médicaments, propose des hypothèses pour l’individualisation et l’optimisation thérapeutique des thiopurines. / Thiopurines are cytotoxic and immunosuppressive drugs widely prescribed, mainly in inflammatory bowel disease (IBD). They constitute one of the best success story of pharmacogenetic implementation into clinical practice based on the screening of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) deficiency, a key enzyme in thiopurine metabolism. Optimization of thiopurine response is challenging because of its large interindividual variability such as inefficacy and toxicities. This thesis has explored, on one hand, the relationships between TPMT activity and metabolite concentrations, and on the other hand, factors associated with thiopurine inefficacy. Using a primary care pharmacogenetic database, we first analyzed TPMT distribution and genotype-phenotype correlation, in relation with thiopurine metabolites in a large population. Using a PheWAS study based on a clinical data warehouse we then reported that a very high TPMT activity (“ultra-rapid” phenotype) was associated with parameters of active IBD and poor response to thiopurines. Furthermore, a retrospective study in pediatric IBD identified factors predicting the occurrence of lymphopenia during thiopurine therapy. Finally, using a lymphoblastoid cell line (LCL) in vitro model, we established a transcriptomic signature, including 32 genes predicting thiopurine cellular resistance. A bioinformatic functional analysis identified metabolic pathways in relation with p53 and cell cycle, as well as molecular mechanisms associated with thiopurine resistance. To conclude, this research work, focusing on the variability of thiopurine response and mainly therapeutic resistance, provides new hypotheses to individualize and optimize therapeutic response to thiopurines.

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The thesis deals with the natural substances in context with the cancer disease. The natural substances have a positive effect on the human organism and they are able to influence the viability and the growth of the cancer cells. The main mechanical device is to influence the mechanisms needed to start the apoptosis of the cancer cells and stopping further proliferation. The cancer cell lines utilization in the cancer disease is discussed in the thesis too. The thesis states common methods of determining the natural substances cytotoxicity. For the experimental part of the thesis it was chosen the MTT test method and the xCELLigence system for monitoring in real time. The mechanical device of the tested substance capsaicin in application on the prostate cell lines, tumorous PC3 and nontumorous PNT1A influence will be observed within the experimental part of the thesis.

MSc (Microbiology) / Department of Microbiology / Background: The medicinal value of plants lies in some chemical substances that produce a definite physiological action in the human body. The secondary metabolites help the plants to survive hash conditions and could be used by humans as supplements of their health, as foods additives or for medicinal purposes. This bioactive compounds are not always beneficial to human beings, and some of this plants bioactive compounds can be toxic or genotoxic to human cells. This study used several methods to evaluate of phytochemical constituents and mutagenic properties of Coccinia rehmanni and Jatropha zeyheri plant extracts. Methodology: Methanol was used for extraction of the bioactive compounds from the two selected plants, filtered with Whatman filter paper and evaporated with rotary evaporator. The extracts were fractionated using open column chromatography. Chemical and TLC methods were used to determine phytochemicals of the study plants extracts and fractions. The plants extracts and fractions were tested against Vero cell lines in order to evaluate cytotoxicity and genotoxicity of the plants. NucRed and LTR Hoechst 33342 dyes were used for cytotoxicity and genotoxicity respectively. For the evaluation of cytotoxicity and genotoxicity Quantification of live and dead cells for the screening assay was performed using the ImageXpress Micro XLS Widefield Microscope and acquired images analyses using the MetaXpress software and Multi-Wavelength Cell Scoring Application Module. Antimutagenicity of plants extracts was observed using PARP universal colorimetric assay kit. Acquired data was transferred to an EXCEL spreadsheet and data was analyzed. Results and discussion: C. rehmanni (12.03%) yielded more extract than J. Zeyheri (8.20%). the two plants had different compound composition and were in different stages of maturity. The study revealed the domination of Terpenoids, Cardiac glycosides, Phenolic and tannis. With an exception of two fraction fractions all the fractions was found to be toxic to an extent were genotoxicity of such fraction could not be concluded. The reason for such extreme toxicity could be due to the influence of the retained alcohol during rotary evaporation. xvi | P a g e Conclusion: this study provides and add to existing knowledge on the phytochemicals mutagenicity and anti-mutagenicity of C. rehmanni and J. Zeyheri medicinal plants. The study serves as scientific proof that extensive use of this plant in traditional medicine for treatment of various ailments may lead to some irreversible damages. / NRF

Despite advances in cancer diagnosis and therapy, cancer is the second leading cause of death globally. The improvements of cancer treatment are the major challenge in this research. The aim of the thesis was studying of effects of two anticancer drugs ellipticine (Elli) and doxorubicin (DOX) on some cancer and healthy cell lines. Specific consideration was given to expand current knowledge about the metabolism and cytostatic effects of Elli in neuroblastoma cell lines. Another part of this study was focused on mechanisms contributing to the development of ellipticine-resistance in cancer cells and influence of histone deacetylase inhibitors on anticancer therapy was investigated. Moreover, the aim was to develop apoferritin (Apo) nanocarrier suitable for the active transport of cytostatics to cancer cells. Several essential data were found in this doctoral thesis. Anticancer efficiency of Elli depends on the CYP3A4-mediated metabolism in cancer. The CYP3A4 enzyme encapsulated into two nanoparticle forms, liposomes and SupersomesTM , was tested to activate ellipticine to its reactive species forming covalent DNA adducts. The formation of adducts seems to be dependent on concentrations of CYP3A4 in nanoparticle systems. A higher effectiveness of CYP3A4 in SupersomesTM than in liposomes to form...

Cytokinins are a large group of phytohormones. Since their discovery in the 1950s, they have shown to play a pivotal role in plant physiology. Most studies so far focused on cytokinin action mechanisms and their metabolic regulation. Identification of AtABCG14 and AtPUP14 as cytokinin-specific membrane carriers brought researchers' attention to cytokinin membrane transport, too. In this thesis, we performed experiments with radio-labelled cytokinin tracers. We show that trans-zeatin and isopentenyladenine, two major biologically active cytokinins, are readily transported across the plasma membrane in tobacco BY-2 cell suspension. Making use of mathematical modelling, we show that BY-2 cells possess a membrane transport system with an affinity toward cytokinins. Next, we show that atabcg14 and atpup14 mutations affect cytokinin metabolism in Arabidopsis thaliana plants. Keywords: cytokinin, Arabidopsis thaliana, tobacco BY-2 cell lines, membrane transport, purine permease, ATP-binding cassette, radio-labelling

Das Harnblasenkarzinom (BCa) ist die zweithäufigste bösartige urologische Tumorerkrankung sowie die siebthäufigste tumorbedingte Todesursache bei Männern. Zur Senkung des erheblichen Rezidiv- und Progressionsrisikos oberflächlicher BCa kommen lokale Immun- oder Chemotherapeutika zum Einsatz, die jedoch starke Nebenwirkungen verursachen können bzw. ungenügende langfristige Effekte bewirken. Eine neuartige Therapieoption besteht in der gezielten Expressionshemmung von Genen, die den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil vermitteln. Hierfür eignen sich besonders synthetische Nukleinsäuren wie Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) und small interfering RNAs (siRNAs). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expressionshemmung des potenziellen Targetgens hTERT (humane Telomerase Reverse Transkriptase) mit AS-ODN und siRNAs in BCa-Zellen untersucht. Die Tumorspezifität der hTERT-mRNA-Expression konnte zunächst an tumor- und tumorfreien Gewebeproben von BCa-Patienten gezeigt werden. Die verwendeten AS-ODN reduzierten die hTERT-mRNA-Expression auf bis zu 40%, womit eine Verringerung der Telomeraseaktivität einherging. Die AS-ODN-Behandlung bewirkte des Weiteren eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion verschiedener BCa-Zelllinien sowie eine verminderte Zellkoloniebildungsrate. Diese antiproliferativen Effekte waren auf eine Apoptoseinduktion zurückzuführen. Durch eine Vorbehandlung von vier BCa-Zelllinien mit hTERT-AS-ODN konnten die zytotoxischen Effekte der für das BCa relevanten Chemotherapeutika Cisplatin, Mitomycin C und Gemcitabin signifikant verstärkt werden. Nach Untersuchung der AS-ODN-Wirkung in vitro erfolgte die Etablierung eines subkutanen Xenotransplantantmodells der Nacktmaus. Die Eignung einer intraperitonealen Applikation wurde mit fluoreszenzmarkierten AS-ODN belegt. In weiteren Zellkulturexperimenten kamen hTERT-siRNAs, als alternative Methode der Geninhibition, zum Einsatz. Die Reduktion der hTERT-mRNA-Expression auf 50% war mit der durch AS-ODN bewirkten Inhibition vergleichbar. Im Gegensatz zur AS-ODN-Behandlung induzierten siRNAs keine unmittelbare Apoptose. Eine Kombination der siRNAs mit Cisplatin und Mitomycin C bewirkte jedoch eine Verdopplung der Apoptoserate. Um die molekularen Mechanismen der Wirkung der nukleinsäurebasierten hTERT-Inhibitoren und den Einfluss targetunabhängiger Effekte zu untersuchen, wurden transkriptomweite Expressionsanalysen mittels Oligonukleotid-Microarrays durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die AS-ODN-Behandlung vorwiegend zu einer gesteigerten Expression von Genen führte, die mit einer zellulären Stressantwort assoziiert sind (u.a. ATF3, EGR1, GADD45). Diese Expressionsmuster stimmten in hohem Maße mit denen überein, die durch Transfektion mit AS-ODN gegen andere Targets erhalten wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine, zumindest teilweise, durch off-Targeteffekte ausgelöste Wachstumshemmung hin. Die siRNA-Behandlungen gegen unterschiedliche Targets zeigten relativ geringe Übereinstimmungen in den Expressionsmustern und somit eine höhere Spezifität. Außerdem wurde erstmalig gezeigt, dass eine hTERT-Inhibition mit siRNAs zur trankriptionellen Hemmung der Onkogene EGFR und FOSL1 führt. Diese Daten sowie die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen deuten auf einen wechselseitigen Zusammenhang zwischen hTERT und EGFR in der Regulation der EGFR-stimulierten Proliferation von BCa-Zellen hin. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass hTERT als tumorspezifisch exprimierter und funktionell relevanter Faktor ein hervorragendes Target für eine nukleinsäurebasierte BCa-Therapieoption darstellt. Im Vergleich zu AS-ODN wirken siRNAs grundsätzlich targetspezifischer. Die therapeutische Wertigkeit der lokal applizierten Inhibitoren, insbesondere in Kombination mit herkömmlichen Chemotherapeutika, sollte in nachfolgenden Experimenten im Rahmen eines orthotopen BCa-Xenotransplantatmodells untersucht werden.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) hat aufgrund seines aggressiven Wachstums, seiner frühen Metastasierung und seiner fehlenden Frühsymptome eine sehr schlechte Prognose und ist daher die vierthäufigste Krebstodesursache bei Männern und Frauen in Deutschland. Ein weiteres Charakteristikum von PDAC ist die starke desmoplas-tische Reaktion. Eine Funktion für stromale pankreatische Sternzellen (PSCs) bei der Förderung des Wachstums, der Proliferation und der Metastasierung des Tumors konnte bereits nachgewiesen werden. Für die Beantwortung der Frage, welche molekularen Ursachen einen funktionellen Zusammenhang zwischen Tumoraggressivität und Stroma-zellen herstellen könnten, wurden bereits im Vorfeld dieser Arbeit differentielle Genex-pressionsanalysen durchgeführt. Dabei fiel u.a. auf, dass das sezernierte Glykoprotein secreted Frizzled-related protein 1 (SFRP1), im Vergleich zum entsprechenden nicht-tumorigenen Pankreasgewebe, im Stroma von PDAC-Patienten transkriptionell herunterreguliert war. SFRP1 ist bereits bekannt als Tumorsuppressorgen. In den meisten Fällen wird seine Wirkung auf die Hemmung des β-Catenin-abhängigen (kanonischen) Wnt-Signalweges zurückgeführt. Es wurde bereits sehr häufig beobachtet, dass SFRP1 durch eine Hypermethylierung seiner Promotorregion in einer Vielzahl von humanen Tumoren, darunter auch PDAC sowie PDAC-Vorstufen, herunterreguliert ist. Mit dem Abschalten der SFRP1-Expression wurden erhöhte Proliferation sowie verringerte Apoptose bei den betroffenen Zellen, Merkmale des aktivierten kanonischen Wnt-Signalweges, festgestellt. SFRP1 ist jedoch auch in der Lage nichtkanonische Wnt-Signalwege zu modulieren. Das Ziel dieser von der Deutschen Gesellschaft für Forschung geförderten Arbeit war es, die stromale SFRP1-Expression auf Proteinebene in Proben von PDAC-Patienten mit der von Patienten mit chronischer Pankreatitis zu vergleichen bzw. mit deren Überleben zu korrelieren. Ein möglicher Unterschied sollte mithilfe eines Zellkultur-modells auf einen funktionellen Effekt hin untersucht werden. Dafür sollten stabil und regulierbar SFRP1-überexprimierende Zelllinien aus PDAC- bzw. PSC-Zellen für die Einbindung in Migrationsassays etabliert werden. Für die Ergründung der Mechanismen, die zur Herunterregulierung der stromalen SFRP1-Expression führen könnten, sollte der Methylierungstatus der SFRP1-Promotorregion in PSC- sowie vergleichsweise in PDAC-Zellen mittels methylierungsspezifischer PCR und Bisulfitsequenzierung analysiert werden. Desweiteren sollten diese Zellen mit Hilfe eines Reportergenassays auf eine Mikro-RNA-bedingte Modulation der SFRP1-Expression hin untersucht werden. Die immunhistochemische SFRP1-Färbung von PDAC-Patientenproben auf Tissue-Microarrays (TMAs) ergab eine signifikante Reduktion der stromalen SFRP1-Färbung im Vergleich zur entsprechenden Expression im Stroma von Patienten mit chronischer Pankreatitis (CP). Die Ergebnisse der differentiellen Genexpressionsanalyse konnten also auf Proteinexpressionsebene bestätigt werden. Bei der Korrelation der stromalen SFRP1-Färbung mit dem Überleben der entsprechenden Patienten mit R1-Resektionsstatus zeigte sich ein leichter Überlebensvorteil für die Patienten mit positiver SFRP1-Färbung. Bei der Analyse der SFRP1-Expression auf RNA- und Proteinebene in Zellkulturmodellen von PDAC zeigte sich, dass zwei von vier PDAC-Zelllinien sowie die PSCs und normale Pankreasgangzellen SFRP1-RNA exprimierten. Auch bei anderen untersuchten Tumor- oder murinen PDAC-Zelllinien war das Verhältnis zwischen Linien mit SFRP1-RNA und Linien ohne SFRP1-RNA eher gemischt. Keine dieser Zelllinien jedoch exprimierte SFRP1-Protein bis auf eine murine Fibroblastenzelllinie (3T3). Um zu ergründen, wodurch die Diskrepanz zwischen SFRP1-RNA- und fehlender -Proteinexpression zustande kam, wurden Methylierungsanalysen durchgeführt. Dabei ergaben sich individuelle Methylierungsmuster für die verschiedenen DNAs, die eine fehlende Proteinexpression bei nur einem Teil der Zelllinien erklären würden. Daher wurde eine weitere Möglichkeit der Genexpressionsregulation in eukaryontischen Zellen als Ursache in Betracht gezogen, die Hemmung der Translation von SFRP1-mRNA in Protein durch miRNAs. Hierbei konnte mittels Reportergenassays nachgewiesen werden, dass miRNAs in PSCs und PDAC-Zellen eine kleine Stelle in der 3’-untranslatierten Region sowie Stellen in der kodierenden Sequenz von SFRP1 erkennen, daran binden und translational herunterregulieren konnten. Da keine endogene Proteinexpression festgestellt werden konnte, wurden drei PDAC-Zelllinien (PANC-1, AsPC1 und MIA PaCa-2) sowie eine PSC-Zelllinie (Klon2.2) für die stabile Transfektion mit humanem SFRP1 auf einem regulierbaren Vektor ausgewählt. Mithilfe der Lipofektion gelang es jedoch nur bei MIA PaCa-2 und Klon2.2-Zellen, stabile Einzelzellklone anzuziehen, jedoch mit relativ variablen SFRP1-Expressionen und -Regulierbarkeiten. Um noch mehr PDAC-Zelllinien in funktionellen Tests untersuchen zu können, wurden alle vier Zelllinien noch einmal mit einer weiteren Gentransfermethode, der retroviralen Transduktion, in stabil SFRP1-exprimierende Zelllinien umgewandelt. Um zu untersuchen, inwiefern das in den Patienten verlorengegangene SFRP1 das migratorische Verhalten von PDAC- und PSC-Zellen beeinflussen könnte, wurden Scratch- und Invasions- (Migrations) -Assays mit diesen Zellen durchgeführt und mit den Ergebnissen der entsprechenden Leerkontrollen verglichen. Dabei ergab sich für MIA PaCa-2 sowohl mit den durch Lipofektion als auch mit den durch retrovirale Transduktion generierten Klonen/Zelllinien ein signifikant hemmender Einfluss der SFRP1-Überexpression auf das Migrationsverhalten im Scratch-Assay. PANC-1-Zellen schienen mit Lipofektions-SFRP1-Überständen signifikant schlechter durch Membranen zu migrieren und zeigten ebenfalls eine signifikante Migrationshemmung als retroviral transduzierte Zelllinie in Scatch- und Invasionsassay mit endogener SFRP1-Expression. Für PSCs zeigte sich eine SFRP1-abhängige Migrationshemmung im Scratch-Assay und in den Invasionsassays (mit endogener SFRP1-Überexpression und mit SFRP1-Anwesenheit im Überstand), allerdings nur mit Lipofektionsklonen. Es konnte also ein hemmender Einfluss von SFRP1 auf die Migration von PDAC- und PSC-Zellen nachgewiesen werden. Dieser würde theoretisch wegfallen, wenn SFRP1, wie im Tumorstroma von PDAC-Patienten nachgewiesen, herunterreguliert werden würde. Bei der Untersuchung eines Einflusses von SFRP1 auf die Expression weiterer Gene ergab sich, dass SFRP1 bei PDAC-Zellen keine Hemmung des kanonischen Wnt-Signalweges verursacht. Vielmehr scheint seine Überexpression einen positiven Effekt auf die Expression von Mitgliedern des nichtkanonischen planaren Zellpolaritätssignalweges (PCP) zu haben. Die Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen ist, dass ein Wegfall von SFRP1 im Stroma von PDAC in sehr frühen Phasen (und auch in den Tumorzellen selbst) durch miRNAs oder, im Falle der Tumorzellen, durch Hypermethylierung ausgelöst werden könnte. Sezernierte, tumorsupprimierende, parakrine Signale aus dem Stroma und autokrine Signale von den Tumorzellen selbst würden damit wegfallen und die planare Zellpolarität wäre nicht mehr aufrechterhaltbar. Damit würden sich die Polarität und die Migrationsbereitschaft der Tumorzellen so verändern, dass sie ungerichtet wandern könnten, wodurch das Risiko zur Metastasierung zunehmen könnte. Auf diese Weise könnte die stromale Herunterregulierung von SFRP1 bei der Aufrechterhaltung und Progression des PDAC eine Rolle spielen.

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Проведено исследование цитотоксического действия синтезированных препаратов платины на нормальные клетки человека и различные линии опухолевых клеток. Выполнена оценка фрагментации ДНК методом электрофореза. Исследована целостность цитоплазматической мембраны клеток, подверженных действию препаратов платины. Выявлено наиболее перспективное соединение платины как возможный субстрат для разработки фармацевтических препаратов для лечения онкологических заболеваний. / Within the framework of this work, reviews of the literature on tumor cells and methods of combating malignant neoplasms, including those using platinum preparations, are collected. A study was made of the cytotoxic effect of the synthesized platinum preparations on normal human cells and various tumor cell lines. DNA fragmentation was studied by electrophoresis. A study was made of the integrity of the cytoplasmic membrane of cells exposed to platinum preparations. The most promising platinum compound has been identified as a possible substrate for the development of pharmaceutical preparations for the treatment of oncological diseases.