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Le système de communication SCF/KIT est impliqué dans le développement et l’homéostasie de plusieurs lignages cellulaires. Des dysfonctionnements de la voie sont à l’origine de pathologies affectant ces compartiments. En particulier, des mutations gain-de-fonction, qui entraînent l’activation constitutive du récepteur à activité tyrosine kinase KIT, sont responsables de néoplasies chez l’homme.L’objectif des travaux réalisés durant cette thèse était d’étudier certaines spécificités de la signalisation de formes oncogéniques de KIT, ceci dans le modèle du mastocyte transformé par l’oncogène KIT-D816V. Cette étude a été menée au niveau proximal sur le récepteur lui-même ainsi qu’au niveau distal sur la voie STAT ,une des voies de signalisation spécifiquement activée de manière constitutive par le récepteur mutant.Au niveau proximal, nous avons pu montrer que le motif dityrosine Y568-Y570situé dans le domaine juxtamembranaire de hKIT est une plateforme majeure de recrutement des effecteurs de la signalisation intracellulaire avec au moins 15partenaires différents recrutées. Par ailleurs l’étude de modèles cellulaires dans des analyses liées aux fonctions physiologiques du récepteur réalisés in vitro et in vivo ont révélé que le site est impliqué dans la régulation négative du signal transformant issu de l’oncogène KIT-D816.Au niveau distal, nous avons analysé les mécanismes de phosphorylation des protéines STAT1, -3 et -5 ainsi que l’importance fonctionnelle de leur activation dans la transformation dépendante de KIT-D816. Nous avons ainsi étudié la contribution de différentes kinases dans les phosphorylations activatrices des STATs sur tyrosine et serine. Nos résultats suggèrent que seul STAT5 a une activité transcriptionnelle dans nos modèles suggérant une implication potentielle non canonique des STAT1et -3 dans la transformation dépendante de KIT-D816.L’ensemble de nos travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de l’oncogenèse dépendante de KIT-D816, un point critique dans le développement raisonné de thérapeutiques anticancéreuses ciblées. / The receptor tyrosine kinase KIT and its ligand, the stem cell factor (SCF), are implicated both in the development and the homeostasis of multiple cell lineages. Dysfunctions in the KIT/SCF pathway are involved in several pathologies affecting these compartments. In particular, gain-of-function mutations that lead to constitutive activation of the receptor KIT are found in human neoplasia.The purpose of this thesis project was to investigate some differences between normal and oncogenic signalling of KIT receptor using mast cells transformed by the KIT-D816 oncogene as a model. This question was analysed at aproximal level on the oncogenic receptor itself and at a more distal level on the STAT signal transduction pathway, which is specifically and constitutively activated by theKIT-D816 mutant.At the proximal level, we show that the juxtamembrane dityrosine motif Y568-Y570 of KIT is the major platform of recruitment of intracellular signalling partnerswith more than 15 interactors found in mast cells. Furthermore, the analysis ofcellular models in both in vitro and in vivo assays related to KIT physiological functions has revealed the negative role of the motif in KIT-D816-mediated cell transformation. At the distal level, we have analysed the mechanisms of phosphorylation ofSTAT1, -3 and -5 proteins and the functional relevance of their activation in KITD816-mediated transformation. We describe the contribution of different kinases inthe phosphorylation of STATs on both serine and tyrosine residues. Our results suggest that only STAT5 is transcriptionaly active whereas STAT1 and STAT3 are not, suggesting a non conventional implication of their activation in celltransformation. Our work contributes to a better understanding of the mechanisms of KITD816-mediated oncogenesis and could be used to improve the rational developmentof new targeted cancer therapies

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Les cancers sont un groupe de maladies diverses et complexes responsables de millions de décès chaque année à travers le monde. Ces maladies sont multicausales et peuvent être engendrées par de nombreux facteurs génétiques ou environnementaux. Parmi les facteurs susceptibles de déclencher l’oncogénèse, les agents infectieux (virus, bactéries et parasites) sont à l’origine de plus de 16 % des cancers. Parmi les virus, l’étude de la famille des Retroviridae a permis de comprendre les mécanismes de l’oncogénèse virale. Certains rétrovirus portent des oncogènes d’origine cellulaire, d’autres activent des oncogènes cellulaires lors de leur insertion dans le génome de l’hôte et d’autres enfin portent des protéines virales oncogènes. Parmi ces derniers, le rétrovirus JSRV (Jaagsiekte Sheep Retrovirus) est responsable de l’adénocarcinome pulmonaire ovin chez les petits ruminants. JSRV transforme des cellules épithéliales alvéolaires et bronchiolaires via sa protéine d’enveloppe (Env) qui dérégule des voies de signalisation cellulaire contrôlant la prolifération, dont la voie Akt/mTOR (Phosphatidylinositol 3-kinase Alpha serine-Threonine-protein Kinase/ mammalian Target Of Rapamycin). Nous avons identifié la protéine cellulaire RALBP1 (RalA Binding Protein 1) comme un partenaire de Env et analysé les effets de cette interaction sur la transformation induite par JSRV. Nous avons confirmé la formation de complexes protéiques RALBP1/ Env dans les cellules de mammifères. Par inhibition de l'expression de RALBP1 avec des siRNA spécifiques, nous avons montré que la protéine cellulaire est impliquée dans le processus de transformation cellulaire induite par l’enveloppe et dans la modulation de la voie mTOR /p70S6K. Nous avons mis en évidence la sous-expression de RALBP1 dans les cellules exprimant Env in vitro, mais aussi ex vivo dans les cellules primaires tumorales et in vivo dans les tissus tumoraux. Nous avons déterminé que CDC42, un activateur de p70S6K dont l’activité est négativement régulée par RALBP1, interagit avec l’enveloppe de JSRV. Nous avons posé l’hypothèse que la diminution de RALBP1 provoquée par l’Env activerait CDC42 ce qui conduirait à l’activation p70S6K. CDC42 étant impliqué dans l’organisation du cytosquelette d’actine, nous nous sommes intéressés à l’effet de l’enveloppe sur le cytosquelette d’actine. Nous avons mis en évidence une désorganisation du cytosquelette d’actine et une perte de la polarisation des cellules exprimant l’enveloppe de JSRV. Comme de nombreux autres virus, JSRV pourrait moduler le cytosquelette d’actine des cellules épithéliales qu’il infecte afin de désorganiser l’épithélium et ainsi affecter son hôte plus efficacement / Worldwide, cancers are a group of diverse and complex diseases responsible for millions of deaths every year. These diseases are multicausal and associated with various genetic and environmental factors. Infectious agents (viruses, bacteria and parasites) are at the origin of more than 16 % of cancers. Among viruses, the study of the Retroviridae family allowed us to understand the mechanisms of viral oncogenesis. They transform cells by carrying oncogenes, by the activation of cellular oncogenes after their integration into the host genomes or by the oncogenic properties of some of their proteins. Among the later, JSRV (Jaagsiekte Sheep Retrovirus) is responsible for ovine lung adenocarcinoma in small ruminants. It transforms alveolar and bronchiolar epithelial cells via its envelope protein (Env). Env expression deregulates pathways involved in the control of cellular proliferation, such as the Akt/mTOR (Phosphatidylinositol 3-kinase Alpha serine-Threonine-protein Kinase/ mammalian Target Of Rapamycin) pathway. We identified RALBP1 (RalA Binding Protein 1) as a cellular partner of Env and analyzed the effects of these interaction on the JSRV induced transformation. We confirmed the formation of RALBP1/Env complexes in cells. By inhibition of RALBP1 expression with specific siRNA, we showed that RALBP1 is involved in Env mediated transformation and in the modulation of the mTOR/p70S6K pathway. We demonstrated the down expression of RALBP1 in vitro in cell lines expressing Env, and importantly ex vivo in primary cells derived from tumoral lungs and in vivo in tumoral lungs. We determined that CDC42, an activator of p70S6K whose activity is negatively regulated by RALBP1, interacts with the envelope of JSRV. We make the hypothesis that the activation of CDC42, following the Env-mediated decrease of RALBP1, would lead to the activation of p70S6K. As CDC42 is involved in the organization of the actin cytoskeleton, we were interested in the effect of Env on actin cytoskeleton. We showed the disorganization of actin cytoskeleton and the loss of polarization in cells expressing Env JSRV. As many viruses, JSRV could modulate the actin cytoskeleton in epithelial cells via its envelope in order to disrupt the epithelium and affect its host more efficiently

La modification post-traductionnelle par SUMO régule des mécanismes essentiels des fonctions protéiques comme leurs interactions avec des protéines ou des acides nucléiques, leurs localisations subcellulaires, leurs stabilités ou encore leurs activités enzymatiques. La SUMOylation est un processus réversible qui fait intervenir des enzymes spécifiques. À l’aide de modèles murins génétiquement modifiés déficient pour l’enzyme unique E2, UBC9, nous avons pu caractériser les conséquences de l’hypoSUMOylation sur la transformation des cellules et l’oncogenèse colorectal. Les résultats obtenus in vitro montrent qu’une perte totale de la SUMOylation n’a pas d’effet significatif sur la survie des cellules primaires mais affecte très fortement celle des cellules transformées. De manière surprenante, la réduction de moitié de la quantité d’UBC9 augmente la prolifération des cellules transformées mais n’a aucun effet sur la prolifération des cellules primaires. Dans les modèles animaux des résultats contradictoires ont été obtenus. En effet, la réduction de moitié de la quantité d’UBC9 augmente le nombre de polypes intestinaux dans un modèle murin de cancer colorectale induit génétiquement (APC). Par contre, dans un modèle chimio-induite en présence d’un agent inflammatoire (AOM-DSS), la réduction de la quantité d’UBC9 réduit le nombre de polypes dans les colons des souris. Ces résultats permettent d’affiner nos connaissances sur le rôle de la SUMOylation et d’envisager que des inhibiteurs de la SUMOylation pourraient être utilisées en thérapeutique. Néanmoins, le niveau de SUMOylation devra alors être très strictement et finement contrôlé en fonction du type de cancers. / The post-translational modification by the Small Ubiquitin-like MOdifier (SUMO) is an essential regulatory mechanism of protein function affecting the interactions of its substrates with their protein and nucleic acid partners, their localization, stability or enzymatic activity. SUMOylation is a reversible process involving specific enzymes. Using genetically modified models deficient for the unique E2 enzyme, UBC9, we characterized the consequences of hypoSUMOylation in cellular transformation and colorectal cancer. The results obtained in vitro demonstrate that a total loss of SUMOylation does not have significant effects in the survival of primary cells but strongly affects the survival of transformed cells. Surprisingly however, the reduction in half of the quantity of UBC9 increased the proliferation of transformed cells but had no effect in the proliferation of primary cells. In animal models, contradictory results were obtained. More specifically, the reduction in half of the quantity of UBC9 increased the number of intestinal polyps in a murine model of genetically induced colorectal carcinogenesis (APC). On the contrary, in a chemical model consisting of mutagenic and an inflammatory agent (AOM-DSS), the reduction in half of UBC9 decreases the number of polyps in the colon of the mice. On the whole, these results allow us to increase our knowledge of SUMOylation and to envisage a possible use of SUMOylation inhibitors for cancer therapy, however the level of SUMOylation would have to be strictly and finely controlled depending on the type of cancer.

Chick embryo fibroblasts and rat kidney cells infected in vitro with Rous Sarcoma viruses were treated with 3-deazaguanine (3-DG). The findings revealed that 3-DG inhibited virus-induced cellular transformation. Degree of inhibition is dependent on concentration and frequency of media change. 3-DG at the concentrations tested will not reverse transformed cells to the untransformed state and does not have marked effect on replication of viruses. Upon removal of 3-DG, its effect was shown to be reversible. Cell growth was generally retarded in medium containing 3-DG. When xanthosine and inosine were added to the medium, cell growth was unaffected, but it increased in guanosine.

Chez les mammifères, les cellules apoptotiques peuvent être complètement dégradées par des cellules phagocytaires spécialisées ou servir de vecteur d'ADN Le transfert d'oncogènes via les cellules apoptotiques aboutit à la transformation des cellules receveuses uniquement si celles-ci sont déficientes en p53. Sachant que Fniicogène E6 des papillomavirus humains (HPV) à haut risque induit la dégradation de p53, il est concevable que son transfert par la cellule apoptotique soit à l'origine d'un mécanisme alternatif de carcinogenèse associée aux HPV. Afin de confirmer cette hypothèse, l'apoptose de cellules dérivées de cancer du col de l'utérus, abriiam ou non des séquences d'HPV, a été induite. En collaboration avec l'équipe de Patrick Sandoz du laboratoire d'optique de FEMTO-ST, nous avons adapté leur inicr;système référencé en position à l'observation automatisée de Finternalisation des cellules apoptotiques. Nous avons aussi déterminé que les cellules apoptotiques son! phagocytées par les fîbroblastes quel que soit leur statut virologique. Seules les cellules apoptotiques dérivées de cellules abritant de l'ADN d'HPV transforment les cellules receveuses. L'expression de l'ADN viral, dont E6, dans les fîbroblastes transformés ainsi que la perte d'expression des protéines p53 et p21 suggère que les oncogènes d'HPV pourraient être à l'origine de la transformation. Les résultats présentés dans ces travaux mettent en évidence un nouveau mécanisme de carcinogenèse associée aux HPV via la phagocytose des cellules apoptotiques, potentiellement impliqué dans la transformation de cellules primaires et la progression des tumeurs associées aux HPV. / Apoptotic cells in mammals may be completely degraded by specialized phagocytic cells or serve as a DNA vector. The oncogene transfer via apoptotic cells leads to the transformation of récipient cells but only when they are p53 deficient. As the E6 oncogene of high-risk human papillomavirus (HPV) leads to p53 dégradation, its transfer from apoptotic cells may be the cause of an alternative mechanism of HPV-associated carcinogenesis. To confirm this hypothesis, we induced apoptosis of cervical cancer cells that may harbor HPV sequences. In collaboration with Patrick Sandoz's team at the FEMTO-ST optical laboratory, we used their position-referenced microsystem for the automated observation of apoptotic cell internalization. We also found that apoptotic cells are phagocytized by fibroblasts regardless of their virological status. Only apoptotic cells from cells harboring HPV DNA transform recipient cells. Viral DNA expression, including E6, in transformed fibroblasts and the loss of p53 and p21 protein expression suggest that HPV oncogènes may cause transformation. These results highlight a new mechanism of HPV-associated carcinogenesis via apoptotic cell phagocytosis. This mechanism may be involved in thé transformation of primary cells and the progression of HPV-associated tumors.