Th.--Biol. hum.--Paris 6--Pitié-Salpêtrière, 1977. N°: 1.

Th.--Sci. nat.--Lille 1, 1977. N°: 378. / Rés. de la th.

Th.--Méd.--Reims, 1980. N°: 68.

Th.--Sci.--Aix-Marseille 2, 1981. / Extr. en partie de Immunogenetics, 2, 1975, 449-463 ; 465-483 ; 3, 1976 ; 29-40 ; 41-51 ; 703, 1981, 1-28 ; de Scandinavian journal of immunology, 6, 1977, 481-484 ; des Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des sciences de Paris, Série D, 283 , 1976, 663-666 ; de European journal of immunology, 6, 1976, 12, 913-916 ; 9, 1979, 723-730 ; de Tissue antigens, 15, 1980, 297-312 ; 458-466 et de Journal of immunogenetics, 5, 1978, 383-395.

Le thymus est un organe permettant le développement des lymphocytes T, partie intégrante du système immunitaire. Ces cellules sont communément associées au système immunitaire adaptatif, bien que certaines populations, dont les lymphocytes iNKT et T©tm, soient associées au système immunitaire inné. De manière générale, ces lymphocytes « innés » sont capables de répondre très rapidement à différents signaux d’activation, par la production rapide et massive d’IL‐4, d’IFN‐© et d’IL‐17. Notre laboratoire a mis en évidence l’existence de deux sous‐populations de lymphocytes iNKT, iNKT conventionnels et iNKT17, ayant deux voies de différenciation thymique bien distinctes, mais dont les mécanismes de détermination sont encore inconnus. Il a été montré que « SLAM‐associated protein » (SAP) est indispensable au développement des lymphocytes iNKT, puisqu’ils sont absents chez les souris déficientes en SAP. D’autre part, ces mêmes souris montrent également une déficience de la réponse Th2. Nous avons alors émis l’hypothèse que SAP pourrait être impliqué dans la production d’IL‐4 par les lymphocytes iNKT, et dans la détermination des deux sous‐populations de lymphocytes iNKT conventionnel ou producteur d’IL‐17. Dans une première partie, nous avons utilisé des souris triple mutantes Sap‐/‐ V©14Tg‐ROR(©t)‐Egfp, permettant l’étude des sous‐populations de lymphocytes iNKT malgré la déficience en SAP. Nous avons ainsi montré que SAP est indispensable à l’acquisition thymique de la capacité de production d’IL‐4 par les lymphocytes iNKT conventionnels. Chez ces souris déficientes en SAP, nous avons observé une augmentation de la fréquence des lymphocytes iNKT17 ROR©tpos producteurs d’IL‐17, ce qui montre clairement que SAP n’est pas nécessaire pour l’acquisition des propriétés fonctionnelles des lymphocytes iNKT17. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction de SAP dans le développement thymique des cellules iNKT productrices d’IL‐4. De plus, nos résultats montrent que SAP est un point de contrôle obligatoire déterminant l’orientation de la différenciation thymique des cellules iNKT vers les cellules iNKT17 ou vers les cellules iNKT conventionnelles. En parallèle des lymphocytes iNKT17 présents dans le thymus, nous avons également analysé une autre population T particulière : des thymocytes TCR©posCD4pos matures et producteurs d’IL‐17, les lymphocytes Th17 naturels. Nous avons mis en évidence que ces lymphocytes expriment le facteur de transcription ROR©t. Ces lymphocytes T CD4posCD8negCD44hiROR©tpos sont capables de produire rapidement et massivement de l’IL‐17, mais requièrent l’IL‐23 pour co‐produire l’IL‐22. De plus, ils se distinguent des lymphocytes Th17 induits, ou conventionnels, par l’expression du facteur de transcription PLZF et par leur capacité à répondre très rapidement à des stimuli pro‐inflammatoires, nommément l’IL‐23 associé à l’IL‐1©et un agoniste TLR4. Les résultats obtenus durant cette thèse ouvrent donc de nombreuses perspectives de recherches fondamentale et thérapeutique, domaine dans lequel l’IL‐17 est devenu une cible privilégiée pour le traitement des maladies auto‐immunes / Pas de résumé en anglais

Les cellules souches neurales (CSNs) persistent dans la zone sous ventriculaire dans le cerveau adulte. Elles transitent d’un état quiescent à un état prolifératif afin de produire de nouveaux neurones. Les mécanismes régulant cette transition restent cependant méconnus. Les CSNs adultes étant enrichies en gènes calciques, nous avons déterminé si la transition d’un état quiescent vers un état de prolifération était calcium-dépendant. Pour ce faire, nous avons utilisé des mini-endoscopes miniatures pour observer la division cellulaire et sa régulation par la signalisation calcique chez la souris en mouvement libre. Nos données révèlent différents dynamiques calciques et niveaux intracellulaires calciques lors de la division des CSNs. Les expériences pharmacologiques et la technique d’édition génomique CRISPR-Cas9 montrent que les réserves intracellulaires calciques IP3-dépendant et les régulateurs à la protéine G régulent la transition d’un état quiescent vers l’état prolifératif. Nous avons aussi utilisé une approche optogénétique in vivo afin de mimer la dynamique calcique des CSNsquies centes pour maintenir les CSNs dans un état de quiescence et bloquer son activation vers un stade prolifératif. Nos résultats démontrent que les dynamiques calciques et le niveau intracellulaire calcique jouent un rôle important dans l’activation des CSNs. Ensuite, nous avons investigué le microenvironnement des CSNs notamment les vaisseaux sanguins et leur rôle dans la physiologie des CSNs. Les CSNs étendent un long prolongement basal et contactent les vaisseaux sanguins. Le contact direct et la libération de facteurs par les cellules endothéliales influencent le comportement des CSNs. Ici, nous avons utilisé des souris transgéniques pour altérer la communication entre les vaisseaux sanguins et les CSNs. Comme la signalisation Notch joue un rôle clé dans la signalisation des vaisseaux sanguins, nous avons inhibé in vivo la signalisation Notch spécifiquement dans les cellules endothéliales. Nous avons trouvé que l’inhibition de la signalisation Notch dans les cellules endothéliales à des stades précoces (P0) ou à des stades tardifs (P30) augmentait le nombre de CSNs. L’analyse morphologique des vaisseaux sanguins révèle aucune altération quand Notch est inhibé à des stades tardifs (P30). Ces résultats montrent que l’inhibition de la signalisation Notch maintient lesCSNs dans un état de quiescence. / Neural stem cells (NSCs) persist in the subventricular zone of adult brain and transit from the quiescent to the proliferative states to produce new neurons. The mechanisms regulating the transition froma quiescent to a proliferative state remain unclear. Since adult NSCs are enriched in genes associated with Ca2+ signalling pathways, we aimed to determine whether the transition from quiescence to aproliferative state is Ca2+ dependent. Here, we used miniature endoscopes (mini-endoscopes) to monitor NSC division and their regulation by Ca2+ signalling in freely behaving mice. Our data revealeddifferent Ca2+ dynamics and steady-state Ca2+ intracellular levels during NSC division. Pharmacological and in vivo CRISPR-Cas9 gene editing showed that IP3-sensitive intracellular stores and G-proteins regulators regulate the transition from quiescence to proliferation. We further used in vivo optogenetics to mimic Ca2+ dynamics of quiescence state to maintain NSCs in this state and prevent NSCsto transit into proliferative state. Our results demonstrate that Ca2+ dynamics and Ca2+ intracellularlevels play an important role in NSC activation. Next, we investigated NSCs microenvironmentmainly blood vessel and their role in their physiology. The NSCs contact the blood vessels by extending their basal processes. Direct cell-cell contact and the release of factors such as VEGF (vascularendothelial growth factor) by endothelial cells (EC) influence the NSC behaviour. As Notch pathwayis a key player in vasculature signalling, we inhibit in vivo the Notch signalling specifically in EC.We found that inhibition of Notch signalling in EC at early stage (P0) or later stage (P30) increasesNSC number. Morphological analysis of blood vessel reveals no alteration when Notch signalling isinhibited at later stages (P30). These finding showed that inhibition of Notch signalling in EC maintains NSC in quiescence state.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle essentiel dans le contrôle du développement des animaux et des maladies. Parmi les mécanismes de régulation posttranscriptionnelle identifiés à ce jour, les microARNs jouent un rôle central. Ils constituent une large classe de courts ARNs régulateurs qui ont été découverts chez le nématode C. elegans et ont été répertoriés chez tous les métazoaires. Les microARN sont transcrits par l'ARN polymérase II sous forme d'un long transcrit primaire et vont subir deux étapes de clivage successives pour former le microARN mature. Le microARN mature est pris en charge par une protéine Argonaute pour former un complexe effecteur, le miRISC. Les microARN s’associent avec la région 3' non traduite de leurs ARNm cibles pour réprimer leur traduction et/ou initier leur dégradation. L'orchestration dynamique de ces processus n'est pas bien comprise, mais on pense actuellement qu'elle dépend en grande partie d'un partenaire clé des Argonautes, GW182. Les cellules germinales sont la source d’ARNm maternels dont la régulation est essentielle aux premières étapes de l’embryogénèse. Le maintien de la stabilité de ces transcrits est assuré par des mécanismes posttranscriptionnels. Les microARNs sont abondants dans la lignée germinale et donc pourraient potentiellement participer à cette régulation. C’est ce qui nous amène à étudier la fonction des microARNs dans les cellules germinales. L’objectif de mon doctorat a été de comparer les mécanismes moléculaires utilisés par les microARN dans les cellules germinales et somatiques afin de mieux comprendre comment ils régulent l’expression des gènes. Grâce à une combinaison d’analyses protéomiques et de rapporteurs de l’activité des microARN in vivo, nous avons pu disséquer la composition et la fonction des miRISC germinaux et somatiques. Nous avons découvert un mécanisme de répression indépendant de GW182 qui réprime et stabilise les cibles de microARN. De façon intéressante, nous démontrons que des sites de liaison des miARN sont suffisants pour localiser un transcrit germinal à la région périnucléaire. Finalement, nous identifions GLH-1, une composante des granules P germinaux, comme étant un cofacteur de la fonction des microARN germinaux. Collectivement, mes travaux de doctorat nous ont permis de contribuer à améliorer les connaissances des mécanismes de la régulation des gènes par les microARN. / Post-transcriptional regulation plays a key role in controlling animal development and diseases. Among all post-transcriptional regulatory mechanisms identified to date, microRNAs play a central role. They constitute a large class of short non-coding RNAs that were discovered in C. elegans and have been reported in all metazoans. MicroRNAs are transcribed by RNA polymerase II as a long primary transcript that will undergo two successive cleavage steps to form the mature microRNA. The mature microRNA is the loaded onto an Argonaute protein to form an effector complex, the miRISC. MicroRNAs associate with the 3' untranslated region of their target mRNAs to repress their translation and/or initiate their degradation. The dynamic orchestration of these processes is not well understood, but at the moment is thought to be largely dependent on a key Argonaute partner, GW182. In developmental contexts such as oogenesis and early embryogenesis, the expression of maternally supplied mRNAs is tightly controlled. In oocytes, translational repression rather than irreversible mRNA decay, is preferred to accumulate and maintain a pool of maternal mRNAs whose timely expression is critical later in development. MicroRNAs are abundant in the germ line and therefore could potentially participate in this regulation. This leads us to study the function of microRNAs in germ cells. The aim of my PhD was to compare the molecular mechanisms used by microRNAs in germline and somatic cells to better understand how they regulate gene expression. Using a combination of proteomic analyzes and in vivo microRNA activity reporters, we were able to dissect the composition and function of germline and somatic miRISCs. We uncover a GW182- independent silencing mechanism used by germline miRNAs to both repress and unexpectedly stabilize their target mRNA. Interestingly, miRNA binding sites are sufficient to localize a germline reporter transcript to the perinuclear region. Finally, we identify GLH-1, a germline P granule component, as an miRISC cofactor involved in the repression of germline microRNA targets. Collectively, my doctoral work helps us gain new insights about the mechanisms used by microRNAs to regulate gene expression.

Lors de la revascularisation d'un tissu lésé, les (myo)fibroblastes et les cellules endothéliales sont recrutés concomitamment au site de la lésion. Ce projet étudie les interactions existant entre ces deux types cellulaires lors de la cicatrisation normale et hypertrophique à partir de deux modèles : derme reconstruit par auto-assemblage et gel de fibrine. La détection par immunofluorescence (collagène IV) a démontré un développement plus important du réseau pseudo-angiogénique lorsque les cellules endothéliales microvasculaires étaient en présence de myofibroblastes du tissu de granulation dans le modèle de gel de fibrine, comparé à la présence des myofibroblastes pathologiques ou des fibroblastes. Aussi, le dépôt de protéines matricielles variait en fonction du type et de l'origine des cellules mésenchymateuses ainsi que de la présence des cellules endothéliales. Ceci suggère que les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules fibroblastiques sont importantes dans le processus d'angiogenèse lors de la cicatrisation normale et pathologique.

La maladie d’Huntington (HD) est un désordre neurodégénératif autosomal dominant qui se manifeste suite à une mutation du gène huntingtin. La maladie est caractérisée par une panoplie de signes cliniques qui incluent des problèmes psychiatriques, cognitifs ainsi que des incapacités motrices, en grande partie des mouvements choréiformes. D’un point vue neuropathologique, les cerveaux des patients touchés par la maladie présentent une atrophie majeure du cortex et du striatum où des pertes cellulaires massives sont observées. Il n’existe aucune cure ni traitements efficaces pour cette maladie, et pour ces raisons, plusieurs efforts sont actuellement déployés afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques telle, entre autre, la transplantation cellulaire. Ma thèse de Doctorat a donc porté, en grande partie, sur l’analyse de cerveaux de patients huntingtoniens recrutés pour l’essai clinique de l’University of South Florida. Ces patients, décédés entre 9 et 12 ans post-transplantation, ont reçus des greffes de tissu dérivé de l’éminence ganglionic latérale de fœtus humains âgés entre 8 et 9 semaines post-conception. Des travaux antérieurs menés dans le laboratoire du Dre Ciccheti ont montré que la survie des greffes est compromise à long terme chez ces patients. L’objectif de mon projet était de mieux comprendre les mécanismes responsables de la survie suboptimale des greffes. Nous avons donc formulé l’hypothèse que 1) la faible vascularisation des greffes, 2) la méthode de transplantation (des morceaux de tissu entier vs. des cellules mécaniquement dissociées) ainsi que 3) la présence de la protéine huntingtin mutée (mHtt) au sein du tissu greffé pouvaient contribuer à la dégénérescence des greffes. En effet, nous avons observé que les éléments de l’unité neurovasculaire étaient largement absents au sein des greffes. Les greffes présentaient une plus faible densité de capillaires et l’absence de larges vaisseaux sanguins, comparativement au cerveau hôte. Nous avons de plus observé un nombre réduit d’astrocytes au sein des greffes et une interaction limitée de ces cellules avec les vaisseaux sanguins, suggérant une défaillance des éléments de la barrière hémato-encéphalique. L’absence d’astrocytes était accompagnée par une carence de la sous-unité connexin 43 des gap junctions, importante pour les interactions greffe-hôte. Nous avons ensuite démontré que lorsque des cellules dissociées étaient transplantées dans le striatum de souris YAC128, un modèle murin de la maladie d’Huntington, la survie de la greffe était excellente et ni la vascularisation ou ni l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux était altérée. Finalement, nous avons fait l’extraordinaire découverte d’agrégats de la mHtt au sein du tissu greffé. Nous avons observé ces agrégats exclusivement dans la matrice extracellulaire de la greffe dans les tissus humains tandis qu’ils étaient présents au sein des neurones, de leurs dendrites, de la lame basale des vaisseaux sanguins et de la matrice extracellulaire dans le cerveau du patient. Dans son ensemble, cette thèse met en lumière de nouveaux mécanismes pouvant contribuer à la faible survie des greffes chez les patients souffrant de HD à long-terme. Ces résultats seront fort utiles afin d’améliorer cette approche thérapeutique et aideront à une meilleure compréhension des processus pathologiques de la maladie d’Huntington. / Huntington’s disease (HD) is a devastating autosomal dominant neurodegenerative disorder which manifests because of a mutation in the huntingtin gene. It is characterized by a variety of clinical signs which include psychiatric and cognitive problems as well as motor disabilities, in large part choreiform movements. Neuropathologically, the brains of patients afflicted with this disease present with a major atrophy of the cortex and striatum where massive cell losses are observed. To this day, cures remain unavailable and for this reason, an enormous amount of energy has been put into the development of experimental approaches, and for example into embryonic neuronal cell transplantation, which aims to replace lost cells. A few clinical trials have thus been initiated to evaluate whether such methodologies would be beneficial to patients. My PhD thesis focused, in large part, on the analysis of a number of brains from patients recruited for the University of South Florida trial and who eventually came to autopsy. These patients (4 analyzed post-mortem) received solid pieces of fetal striatal tissue and died between 9 and 12 years post-transplantation. Previous work carried out in Dr. Cicchetti’s laboratory has shown that graft survival is compromised in these patients long-term. The aim of my project was to further understand the mechanisms underlying this suboptimal graft survival. We hypothesized that 1) poor vascularization of the graft, 2) the method of transplantation (solid tissue vs. suspension cells) and 3) the potential presence of mutant huntingtin (mHtt) within the grafted tissue may all contribute to graft demise. Indeed, elements of the neurovascular unit were largely absent within the solid grafts. Grafts presented a lower density of capillaries and absence of large blood vessels compared to the host brain. Moreover, we observed a reduced number of astrocytes within the grafts and a limited interaction of these cells with blood vessels, suggesting impairment in blood brain barrier elements. The absence of astrocytes was accompanied by the lack of the gap junction subunit connexin 43, important for graft-host integration. Interestingly, when dissociated cells were transplanted in the striatum of YAC128 mice, a murine model of HD graft survival was excellent and neither the graft vascularization nor the interaction between astrocytes and vessels was altered. Finally, we describe for the first time the presence of mHtt inclusions within the grafted tissue. In the HD transplanted cases, aggregates were detected only in the extracellular matrix of the graft while in the host brain they co-localized with neurons or other cellular elements, such as the basal lamina of blood vessels. Taken together, this thesis sheds new light onto potential mechanisms contributing to poor long-term graft survival in HD patients. These results will help improve such therapies as well as to better understand disease process in HD.