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Le réflexe naturel d’une cellule eucaryote, soumise à un stress (ex : radiations, drogues anti-cancers…), est d’activer des mécanismes de défense afin de s’adapter aux conditions extrêmes imposées, leur permettant de survivre. Un des mécanismes activé en condition de stress est l’inhibition de l’initiation de la traduction menant à la formation de granules de stress (GS). Les GS sont des corps cytoplasmiques dynamiques renfermant des facteurs d’initiation de la traduction, des ARNms, des protéines de liaison à l’ARN ainsi que des molécules de signalisation impliquées dans les voies de mort cellulaire. La formation des GS fut identifiée comme un évènement clé inactivant les voies de mort cellulaire, constituant donc un mécanisme majeur de survie, qui dans le cas du cancer peut engendrer une chimiorésistance. Nous avons précédemment conduit un criblage des facteurs d’initiations de la traduction impliqués dans la formation des GS. Ces travaux (Mazroui et al, 2006 ; Mokas et al, 2009) ont permis d’identifier plusieurs facteurs dont l’inactivation induit la formation des GS. Par contre, l’inactivation du facteur eIF4E, qui est responsable de la reconnaissance des ARNms lors de l’initiation de la traduction, n’induit pas la formation des GS. Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence un nouveau rôle du facteur d’initiation de la traduction eIF4E ainsi que son partenaire eIF4GI dans la formation des GS induites par le traitement chimiothérapeutique Bortezomib. Ce rôle est stimulé par la voie oncogénique mTORC1, qui est la voie de signalisation responsable de l’interaction eIF4E-eIF4GI. De plus, notre étude a démontré que l’inhibition spécifique d’eIF4E, d’eIF4GI ou l’inactivation de mTORC1 empêche l’activation des voies anti-apoptotiques associées au GS, sensibilisant ainsi les cellules cancéreuses aux traitements chimiothérapeutiques. Néanmoins, la formation des GS n’est pas restreinte au Bortezomib. En effet, notre criblage des drogues chimiothérapeutiques a identifié le Sorafenib (Nevaxar®) et le Lapatinib (Tykerb/Tyverb®) comme deux puissants inducteurs des GS au sein des cellules cancéreuses. En conclusion, ces travaux ont mis en lumière un nouveau mécanisme de formation des GS ainsi que deux potentiels inducteurs d’assemblage de ces granules. / The natural reflex of a eukaryotic cell under stress (e.g.: radiation, anti-cancer drugs, thermal or oxidative stress) is to activate defense mechanisms to adapt to extreme conditions imposed, allowing them to survive. One mechanism activated under stress conditions is the inhibition of translation initiation leading to the formation of stress granules (SG). SG are dynamic cytoplasmic body containing translation initiation factors, mRNAs, RNA binding proteins and signaling molecules involved in cell death pathways. SG formation was identified as a key event inactivating cell death pathways, thus establishing a major survival mechanism, which in the case of cancer can lead to drug resistance. We previously conducted a screening of the translation initiation factors involved in the SG formation. These works (Mazroui et al, 2006; Mochas et al, 2009) have identified several factors that inactivation induces the formation of GS. For cons, the inactivation of factor eIF4E, which is responsible for the recognition of mRNAs during translation initiation, does not induce the formation of SG. My thesis has highlighted a new role for the translation initiation factors eIF4E and its partner eIF4GI in the SG formation induced by chemotherapeutic drug Bortezomib. This role is stimulated by oncogenic mTORC1 pathway, which is the key regulator of the eIF4E-eIF4GI interaction. In addition, our study demonstrated that specific inhibition of eIF4E, eIF4GI or the inactivation of mTORC1 prevents anti-apoptotic pathways associated with SG and sensitizing cancer cells to chemotherapeutic treatments. The SG formation is not restricted to Bortezomib. Indeed, our screening of chemotherapeutic drugs has identified Sorafenib (Nevaxar ®) and Lapatinib (Tykerb / Tyverb ®) as two potent inducers of SG in cancer cells. Our results indicate that the mechanism of action of these two drugs appears to be similar to Bortezomib and they induce the formation of SG by inhibiting translation initiation. In addition, the formation of SG induced by Sorafenib or Lapatinib also seems to depend on the eIF4E-eIF4GI complex formation. Therefore, my work provides a general role of eIF4E-eIF4GI interaction in the assembly of SG and the cancer cells resistance to chemotherapy.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2015-2016 / Src régule le remodelage du cytosquelette d’actine et les propriétés invasives des cellules. Une régulation spatio-temporelle du transport endosomal polarisé est nécessaire pour ces fonctions et le rétromère, un substrat de Src, est un élément crucial de ce trafic. Nous avons postulé que le rétromère pourrait moduler le transport requis pour le remodelage cellulaire et la migration induits par Src. Nous montrons qu’une perte de fonction du rétromère dans des cellules épithéliales exprimant v-Src mène à la formation d’invadosomes désorganisés et anormalement stables, mais toujours aptes à dégrader la matrice extracellulaire. Dans un modèle de cellules cancéreuses, une perte de fonction du rétromère diminue la migration en affectant la polarisation et la directionalité des cellules, mais augmente la migration trans-endothéliale. Nos résultats suggèrent un rôle pour le rétromère en aval de Src dans le remodelage de l’actine, la polarité, la migration cellulaire et l’invasion, possiblement par la phosphorylation du rétromère. / Src-family kinases (Src) modulate actin cytoskeleton remodeling and tumor cell invasive properties. Directional endosomal trafficking needs to be regulated in time and space to support these processes, but little is known on the mechanisms involved. The retromer, a Src kinase target, is emerging as a key player of endosomal recycling. We postulated that the retromer could modulate the polarized trafficking of endosomes required to support Src-induced cell remodeling and migration. We show that retromer loss of function caused the assembly of disorganized, more stable invadosomes in epithelial cells expressing v-Src, which were nevertheless able to degrade extracellular matrix. In a cancer cell model, inhibition of retromer function reduced cell migration by affecting polarization and directionality of cells, but promoted transendothelial cancer cell migration. The results thus suggest the existence of a phosphorylation-regulated function for the retromer downstream of Src in actin remodeling, cell polarity, cell migration and invasion.

Les arylchloroéthyle urées touchent plusieurs protéines clés de la cancérogenèse. Les récentes recherches démontrent qu'une nouvelle cible thérapeutique pourrait émerger d'une nouvelle classe de ACEUs qui bloque la division cellulaire en phase S. Par conséquent, 46 nouveaux composés ont été synthétisés afin d'évaluer leurs propriétés biologiques, soit leur activité antiproliferative sur des cellules humaines et leur effet sur le cycle cellulaire. La détermination d'une partie du mécanisme d'action a révélé l'effet des ACEUs sur la phosphorylation de l'histone H2AX. De plus, l'évaluation du potentiel thérapeutique in vivo sur des cellules humaines cancéreuses (HT-1080) déposées sur la membrane chorioallantoïque (CAM) d'embryons de poulet a démontré de bonnes propriétés antitumorales, en plus de faibles toxicités. Parallèlement, la conversion de la portion imidazolidone (initialement obtenue par la cyclisation de la portion V-phényle-V-(2-chloroéthyle) urée des ACEUs) en portion imidazolidinethione a conduit à la synthèse de six nouveaux bioisostères. L'évaluation des propriétés biologiques a révélé une perte d'activité antiproliferative. Toutefois, l'activité antitumorale et la toxicité des bioisostères sont similaires indiquant que la modification des propriétés physicochimiques permettrait d'obtenir de meilleures propriétés biopharmaceutiques et pharmacocinétiques.

L'activation de cathepsines et la présence de cellules cancéreuses dites souches (CSC) participeraient à l'évolution métastatique du cancer colorectal. L'effet d'inhibiteurs intracellulaire (CA-074 ME) et extracellulaire (CA-074) de la cathepsine B a été analysé dans un système de culture tridimensionnelle (3-D) reproduisant le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du côlon. Le CA-074 ME a été le seul à inhiber de façon significative le processus métastatique. Pour l'étude des CSC, le marquage immunohistochimique de CD 133, CD44 et CD24 a été évalué qualitativement et quantitativement dans la culture 3-D et dans des spécimens histologiques provenant de patients porteurs de cancer du côlon. L'expression de ces marqueurs dans les cellules cultivées en 3-D était variable. Par contre, le marqueur CD 133 était fortement exprimé dans les métastases hépatiques associées à des ganglions lymphatiques envahis, tel que démontré en combinaison avec une coloration fluorescente des noyaux. La conclusion reflète les corrélations possibles de ces résultats.

Les cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSCs) ont été conçues pour la première fois en 2007 par l’équipe du Docteur Yamanaka, au Japon. Ce sont des cellules somatiques reprogrammées par un virus permettant, par exemple, la différenciation neuronale à des fins d'étude de maladies neuro-développementales telle que la Schizophrénie. Le prélèvement des cellules somatiques se fait aujourd'hui majoritairement par des méthodes assez invasives, notamment les biopsies de peau ou prélèvements sanguins. Ceci peut représenter un frein à leur utilisation notamment chez les enfants et surtout les enfants malades. La différenciation neuronale privilégiée est la voie dopaminergique (DA) car c'est ce type cellulaire qui est principalement atteint chez les schizophrènes. C'est pourquoi on priorise pour ce projet l'utilisation de cellules contenues dans l'urine, qui seront reprogrammées via un virus non-intégratif, le virus de Sendaï (SeV). La différenciation neuronale nous permettra d'obtenir des neurones DA fonctionnels, caractérisés par électrophysiologie. Les expériences ont montré une très grande efficacité de reprogrammation cellulaire au niveau des cellules d'urine, ainsi qu'un grand potentiel de différenciation neuronale, malgré quelques différences observées entre les lignées saines et schizophréniques. Grâce à ce projet, la réalisation d'un modèle cellulaire pour la Schizophrénie a pu être établie. Les différences notées entre les lignées pendant la différenciation ouvrent une nouvelle voie pour approfondir l'étude de la maladie au niveau cellulaire et moléculaire. / Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) were conceived for the first time in 2007 in Japan, by Doctor Yamanaka’s team. These are somatic cells reprogrammed thanks to a retrovirus allowing, for example, neuronal differentiation for the purpose of neurodevelopmental disorders studies such as Schizophrenia. Today, the removal of somatic cells is mainly made by enough invasive methods, including skin and blood biopsies. This can represent a brake in their use predominantly children, mainly sick children. The preferred neuronal differentiation is the dopaminergic (DA) way because it's the mostly cell type affected in schizophrenics. That's why we prioritize the use of urine cells for this project, reprogrammed via a non integrative virus, the Sendai virus (SeV). The neuronal differentiation enables us to get functional DA neurons characterized by electrophysiology. Experimentations show a huge efficiency of urine cells reprogramming as well as a great potential of neuronal differentiation despite some distinctions between the two lines. Thanks to this project, the achievement of a cellular model for Schizophrenia could be established. The differences noticed between the two lines during the differentiation open up a new way to make cellular and molecular studies of this disease deeper.

Durant le développement et la progression d'un cancer, l'activation locale des protéines de la cascade de coagulation module la croissance et la migration des cellules tumorales et stromales (muscle lisse et endothélium vasculaire). L'objectif principal de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes de progression tumorale dépendants du facteur tissulaire (TF) et ce, à l'aide de lignées cellulaires tumorales qui surexpriment le TF et le TF tronqué de sa queue cytoplasmique (TFAC). Les tumeurs formées in vivo avec les cellules transfectées avec le TF ou le TFAC sont plus petites comparées au groupe témoin, alors que des sphéroïdes formés in vitro avec ces mêmes cellules sont plus gros. Aussi, les expériences réalisées avec les tumeurs formées in vivo et in vitro à partir de ces cellules ont montré que la surexpression du TF, avec ou sans sa queue cytoplasmique, permet la maturation des vaisseaux sanguins associés à la tumeur par le recrutement de cellules musculaires lisses (CML). Des essais de migration ont montré que l'activité protéolytique du TF stimule la migration des CML.

L’environnement pulmonaire est en contact constant avec des agressions extérieures qui peuvent causer une inflammation pulmonaire. Cette inflammation peut être aigüe ou chronique et elle est caractérisée par plusieurs types de cellules immunitaires. Ces cellules expriment à leur surface plusieurs molécules qui sont essentielles à leur fonctionnement. Les rôles de certaines molécules dont le CD103 et le CD34 demeurent très peu étudiés. Les cellules dendritiques (DCs) CD103+ résident au poumon et y exercent plusieurs fonctions régulatrices et inflammatoires. Notre équipe a démontré que la présence de lipopolysaccharide ou de facteur de nécrose tumorale (TNF) empêche l’augmentation du CD103 par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages. Toutefois, l’impact de la modulation de l’expression du CD103 sur les fonctions des DCs demeure inconnu. L’asthme est caractérisé par une hyperréactivité bronchique (HRB) qui consiste en une réactivité exagérée du système respiratoire en réponse à divers broncho-constricteurs. Les mastocytes et éosinophiles sont centraux dans le développement de l’asthme. Le CD34 est exprimée par ces cellules et il est impliqué dans la pathologie de l’asthme puisque les souris Cd34-/- démontrent une perte d’HRB en contexte d’asthme. Cependant, l’impact du CD34 sur la fonction de dégranulation des mastocytes et des éosinophiles dans l’asthme reste inconnu. Les objectifs principaux de ce projet étaient de déterminer l’impact de la modulation de l’expression du CD103 sur certaines fonctions des DCs dans l’immunité innée et de déterminer l’influence de l’expression du CD34 sur certaines fonctions des mastocytes et des éosinophiles dans l’immunité de l’asthme. Des marqueurs de fonctions ont été analysés par cytométrie en flux à la suite de la modulation du CD103. Les fonctions qui ont été analysées sont la capacité d’activer les lymphocytes T, la migration et l’adhésion à l’épithélium. La modulation du CD103 altère l’expression de l’E-Cadhérine ce qui favorise une population activée et non adhérente. L’impact du CD34 sur la dégranulation des mastocytes et des éosinophiles a été étudié à l’aide de souris Cd34-/- et de cultures dérivées de la moelle osseuse. Le CD34 influence la dégranulation des mastocytes et semble affecter la production de certains lipides. En conclusion, l’impact de la modulation du CD103 sur l’adhésion des DCs pourra être utilisé dans différents contextes comme les infections et le cancer et le CD34 semble une cible intéressante dans le traitement de l’asthme puisqu’il est impliqué dans plusieurs composantes de l’asthme, dont l’hyperréactivité et l’inflammation chronique.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / 5 vidéos en format mp4. MovieS1: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics formed on a typical MRC-5 cell adhering ; Movie S2A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, Untreated MRC-5 cell adhering ; MovieS2B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, MRC-5 cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS3A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, Untreated HeLa cell adhering ; MovieS3B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, HeLa cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS4: Time-lapse cell imaging of SIC inhibition and increased spreading of newly adhering MRC-5 cell treated with Y27632 (ROCK inhibitor). / La majorité des cancers proviennent du tissu épithélial. Lors de l'évolution d'une tumeur, les cellules cancéreuses épithéliales subissent une transition épithéliale à mésenchymateuse afin d'amorcer la progression tumorale. La migration et l'adhésion cellulaire sont des processus biologiques essentiels à l'établissement de métastases, qui sont la principale cause de décès associés au cancer. Ainsi, cibler l'un ou l'autre de ces processus et affecter la progression tumorale pourrait potentiellement améliorer le pronostic. Mon projet de doctorat s'est donc penché sur les mécanismes de régulation de l'initiation de l'adhésion spécifiques aux cellules ayant subi une transition épithéliale-mésenchymateuse. L'étude de l'initiation de l'adhésion a mis en lumière une structure impliquée dans la maturation des adhésions focales, les spreading initiation centers (SICs). Les SICs se situent au-dessus de futurs sites de formation d'adhésions focales et sont composés de complexes ribonucléoprotéiques confinés sous une gaine d'actine. Parmi les protéines faisant partie des SICs, on retrouve plusieurs protéines impliquées dans l'adhésion, mais également plusieurs protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous avons montré que les RBPs ainsi que les ARNm sont présents de façon enrichie dans les SICs, suggérant une traduction localisée. En effet, l'inhibition de la traduction freine l'adhésion spécifiquement chez les cellules de types mésenchymateuses et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse. Nous avons mis en lumière une régulation spatiotemporelle de la traduction, spécifique aux cellules mésenchymateuses. Au fil de l'adhésion, la machinerie traductionnelle est tout d'abord inhibée puis stimulée. Cette régulation spatiotemporelle permet une reprogrammation de la traduction vers une traduction localisée et spécifique de protéines impliquées dans la formation des adhésions focales. Nous avons montré que la régulation temporelle de la traduction est assurée par la phosphorylation de la sous-unité alpha de l'EIF2. L'inhibition de la traduction est donc un moyen direct d'étudier les différences dans l'initiation de l'adhésion entre les cellules épithéliales et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse lors de la progression tumorale. / Most cancers originate in epithelial tissue. Epithelial cancer cells then undergo an epithelial to mesenchymal transition to initiate tumor progression. Cell migration and adhesion are essential biological processes for metastasis formation. Metastases are the leading cause of cancer-associated deaths, so targeting any of these processes would greatly affect tumor progression, which could lead to a better prognosis. My doctoral project therefore centered on the mechanisms of regulation of adhesion initiation specific to cells that have undergone an epithelial to mesenchymal transition. The study of adhesion initiation has highlighted a structure involved in the maturation of focal adhesions called spreading initiation center (SIC). This structure has been shown to localize above the formation sites of focal adhesions and to be composed of ribonucleoprotein complexes confined under an actin sheath. Among the proteins identified as part of the SICs are several proteins involved in adhesion and several RNA binding proteins. We have shown that RNA binding proteins and mRNA are enriched within SICs, suggesting the presence of translational activity. We subsequently confirmed an enrichment in translation in the SICs during the initial phase of adhesion. Indeed, inhibiting translation only inhibits cellular adhesion in mesenchymal cells and in epithelial cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition. By further studying the translation dynamics during adhesion, we have highlighted a spatiotemporal regulation specific to mesenchymal cells. The translational machinery is first inhibited, after which there is an upsurge in translation. This spatiotemporal regulation allows a reprogramming of the translatome, inducing the specific translation of proteins involved in the formation of focal adhesions. We have shown that the temporal regulation of translation is regulated by the phosphorylation of the alpha subunit of eIF2. The initiation of translation is therefore an interesting target to study the differences between the adhesion initiation of epithelial cells and that of cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition during tumor progression.

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.