Les changements dans la forme des cellules sont essentiels à de nombreux processus qui déterminent le destin de la cellule, notamment la division cellulaire. Ils sont orchestrés par le remodelage de structures mécanosensibles à base d’actine contrôlant la tension cellulaire. Les évidences récentes laissent croire que le contrôle de qualité des protéines pourrait contribuer à la régulation spatiotemporelle du remodelage des structures d’actine par des mécanismes de séquestration, de recyclage et de dégradation protéiques. Les chaperons moléculaires de la famille des HSPB apparaissent comme des modulateurs des structures à base d’actine en conditions physiologiques. Durant un stress protéotoxique, ces protéines séquestrent des composantes cellulaires endommagées afin de prévenir leur agrégation. Bien que leur implicationdans différentes pathologies soit démontrée, le mode d’action des HSPB demeure encore peu compris. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse adressent l’hypothèse centrale que le complexe chaperon formé d’HSPB8 et de son co-chaperon BAG3 régule le remodelage des structures à base d’actine qui dirigent la division cellulaire. Nos travaux ont établi que lors de la mitose, BAG3, d’une manière dépendante de son association avec HSPB8, facilite l’arrondissement mitotique requis pour le positionnement du fuseau et la ségrégation adéquate des chromosomes. Nous montrons que la réduction des niveaux d’HSPB8 ou de BAG3 interfère également avec le désassemblage de l’anneau contractile d’actomyosine et l’abscission des cellules filles lors de la cytokinèse. Cet effet est corrélé avec une augmentation de la prévalence de cellules multi-nucléées, laquelle est restaurée à des niveaux contrôles par des drogues qui normalisent la dynamique de l’actine dans les cellules déplétées en HSPB8. Ceci établit un lien de cause à effet entre la dérégulation de la dynamique de l’actine et les défauts de division cellulaire observés dans ces cellules. De plus, l’inhibition du désassemblage de l’anneau d’actomyosine est corrigée par la rapamycine, une drogue qui active la dégradation par autophagie. Inversement, ce phénotype est reproduit par les cellules contrôles traitées avec des drogues qui réduisent le flux autophagique. Ces observations suggèrent que la régulation de la morphodynamique mitotique par HSPB8-BAG3 impliquerait sa fonction dans l’autophagie sélective. En outre, pendant la mitose et la cytokinèse, HSPB8-BAG3 limiterait la polymérisation de l’actine branchée. Notamment, HSPB8-BAG3 semble faciliter l’arrondissement mitotique et la dynamique d’un réseau sous-cortical d’actine qui dépend d’Arp2/3, en modulant la déacétylase HDAC6 et son substrat la cortactine, tous deux intervenants dans les processus d’autophagie sélective. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite les transitions dans la forme des cellules qui contrôlent des fonctions essentielles, notamment la division cellulaire. Ils identifient de nouvelles cibles cellulaires du complexe chaperon impliquées dans le remodelage des structures à base d’actine, lesquelles pourraient contribuer au développement de pathologies associées avec une dérégulation du complexe, notamment à la progression tumorale. / Changes in cell shape are essential to key cellular processes that determine the cell fate, including cell division. They are orchestrated by the remodeling of mechanosensitive actin-based structures guiding cellular tension. Recent data suggest that protein quality control may contribute to the spatiotemporal remodeling of actin-based structures through protein sequestration, recycling and degradation mechanisms. Incidentally, the molecular chaperones of the HSPB family appearas modulatorof actin-based structures under physiological processes. These proteins are known to sequester damaged cellular constituents to prevent their toxic aggregation during proteotoxic stress. Whilst their implications in human pathologies have been clearly established, their mode of action is still poorly understood. The work presented in this thesis addresses the central hypothesis that the chaperone complex formed by HSPB8 and its co-chaperone BAG3 would facilitate the remodeling of actin-based structures, which is deemed instrumental for proper mitotic progression. We have shown that during mitosis, BAG3, in a manner requiring its association with HSPB8, facilitates mitotic rounding, spindle positioning and accurate chromosomes segregation. We further showed that depletion of HSPB8 or BAG3 silencing also interferes with disassembly of the contractile actomyosin ringduring cytokinesis, thereby impairing daughter cells abscission. Such an effect is correlated with accumulation of multinucleated cells, a defect which is corrected by drugs that normalize actin dynamics in HSPB8-depleted cells. These results established a cause-effect relationship between deregulation of actin dynamics and the cell division defects induced by HSPB8 silencing. Further, we found that such a phenotypecan be rescued by rapamycin, a drug that stimulates autophagy, while itis recapitulated in control cells by inhibitors of autophagic degradation. These results, and others presented in this thesis, suggest that the regulation of cell shape remodellingby HSPB8-BAG3 may involve their function in the selective targeting of proteins for autophagic degradation. Finally, evidence was obtained that during mitosis, like during cytokinesis, HSPB8-BAG3 would act by limiting branched actin polymerization. We found that HSPB8-BAG3 can modulate mitotic rounding and the dynamics of an Arp2/3-dependent subcortical actin pool that contributes to spindle positionning, by restrictingthe activity of HDAC6 deacetylase maybe on its target cortactin, both having a role in selective autophagy processes. Together, this work contributed to a better understanding of the mechanisms by which the chaperone complex HSPB8-BAG3 would facilitate transitions in cellshape during cell division and uncovered novel targets of HSPB8-BAG3 that may be implicated in the development of human disorders associated with deregulation of the chaperon complex, notably cancer.

Exprimé dans les macrophages et les cellules vasculaires musculaires lisses, le récepteur nucléaire hépatique X (LXR) a un rôle méconnu sur la survie ou la mort des cellules vasculaires musculaires lisses humaines, et ce, malgré une découverte récente de son implication dans la survie des macrophages de souris. L'objectif de mon étude est de comparer Peffet du ligand synthétique T0901317 des LXRs sur la viabilité cellulaire et la déstabilisation lysosomale des macrophages et des cellules vasculaires musculaires lisses humaines en présence de cholestérol ou de 27-hydroxycholestérol (27-OH) et de vérifier si la voie de survie Akt est impliquée. Les macrophages humains U937 et les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) ont été incubés en présence ou non de cholestérol ou de 27-OH, suivie ou non d'un traitement avec le ligand T0901317. Nous avons également étudié les effets du ligand synthétique GW101516 du récepteur activé par les proliférateurs des péroxisomes-β/? (PPAR β/?) et du ligand synthétique T090 1317 des LXRs sur la viabilité cellulaire des macrophages seulement en présence ou non de différents oxystérols comme le 7β-hydroxycholestérol (7β-OH), le 7α-hydroxycholestérol (7α-OH), le 7-kétocholestérol (7KC) et le 5β-6β-époxycholestérol (β-Epox). La proportion relative des cellules viables ou mortes ainsi que des cellules présentant une déstabilisation de leurs membranes lysosomales ont été mesurées simultanément par cytométrie à flux. Les résultats nous montrent que dans les macrophages 0937, le cholestérol stimule la survie cellulaire tandis que le 27-OH induit soit la survie (faible concentration) soit une mort cellulaire sans présence de déstabilisation lysosomale (concentration élevée), suggérant une mort par apoptose. Comparativement à l'effet du T090 1317 seul, son effet sur la viabilité en présence de cholestérol ou de 27 -OH est négligeable. Dans les HASMC, le cholestérol induit une mort cellulaire par apoptose sans effet additionnel du T090 1317. Par contre, le 27-OH additionné de T0901317 permet de prévenir l'apoptose. L'induction de la voie de survie dans les macrophages par le cholestérol est associée à la phosphorylation d'Akt sur le résidu Thr308. Aussi, la survie cellulaire induite par LXR est altérée en présence de cholestérol ou en présence de concentration élevée de 27-0H dans les macrophages U937, ce qui n'est pas observé dans les HASMCs. Le 7KC démontre un effet plus fort que les 7β-OH, le 7α-OH ou le p-Epox sur l'induction de la mort cellulaire. L'induction de la survie par les ligands de LXR et de PPAR β/? ne semble pas être inhibée lorsque le macrophage est incubé en présence d' oxystérols autres que le 27-OH.

Lors de la revascularisation d'un tissu lésé, les (myo)fibroblastes et les cellules endothéliales sont recrutés concomitamment au site de la lésion. Ce projet étudie les interactions existant entre ces deux types cellulaires lors de la cicatrisation normale et hypertrophique à partir de deux modèles : derme reconstruit par auto-assemblage et gel de fibrine. La détection par immunofluorescence (collagène IV) a démontré un développement plus important du réseau pseudo-angiogénique lorsque les cellules endothéliales microvasculaires étaient en présence de myofibroblastes du tissu de granulation dans le modèle de gel de fibrine, comparé à la présence des myofibroblastes pathologiques ou des fibroblastes. Aussi, le dépôt de protéines matricielles variait en fonction du type et de l'origine des cellules mésenchymateuses ainsi que de la présence des cellules endothéliales. Ceci suggère que les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules fibroblastiques sont importantes dans le processus d'angiogenèse lors de la cicatrisation normale et pathologique.

Les cellules souches neurales (CSNs) persistent dans la zone sous ventriculaire dans le cerveau adulte. Elles transitent d’un état quiescent à un état prolifératif afin de produire de nouveaux neurones. Les mécanismes régulant cette transition restent cependant méconnus. Les CSNs adultes étant enrichies en gènes calciques, nous avons déterminé si la transition d’un état quiescent vers un état de prolifération était calcium-dépendant. Pour ce faire, nous avons utilisé des mini-endoscopes miniatures pour observer la division cellulaire et sa régulation par la signalisation calcique chez la souris en mouvement libre. Nos données révèlent différents dynamiques calciques et niveaux intracellulaires calciques lors de la division des CSNs. Les expériences pharmacologiques et la technique d’édition génomique CRISPR-Cas9 montrent que les réserves intracellulaires calciques IP3-dépendant et les régulateurs à la protéine G régulent la transition d’un état quiescent vers l’état prolifératif. Nous avons aussi utilisé une approche optogénétique in vivo afin de mimer la dynamique calcique des CSNsquies centes pour maintenir les CSNs dans un état de quiescence et bloquer son activation vers un stade prolifératif. Nos résultats démontrent que les dynamiques calciques et le niveau intracellulaire calcique jouent un rôle important dans l’activation des CSNs. Ensuite, nous avons investigué le microenvironnement des CSNs notamment les vaisseaux sanguins et leur rôle dans la physiologie des CSNs. Les CSNs étendent un long prolongement basal et contactent les vaisseaux sanguins. Le contact direct et la libération de facteurs par les cellules endothéliales influencent le comportement des CSNs. Ici, nous avons utilisé des souris transgéniques pour altérer la communication entre les vaisseaux sanguins et les CSNs. Comme la signalisation Notch joue un rôle clé dans la signalisation des vaisseaux sanguins, nous avons inhibé in vivo la signalisation Notch spécifiquement dans les cellules endothéliales. Nous avons trouvé que l’inhibition de la signalisation Notch dans les cellules endothéliales à des stades précoces (P0) ou à des stades tardifs (P30) augmentait le nombre de CSNs. L’analyse morphologique des vaisseaux sanguins révèle aucune altération quand Notch est inhibé à des stades tardifs (P30). Ces résultats montrent que l’inhibition de la signalisation Notch maintient lesCSNs dans un état de quiescence. / Neural stem cells (NSCs) persist in the subventricular zone of adult brain and transit from the quiescent to the proliferative states to produce new neurons. The mechanisms regulating the transition froma quiescent to a proliferative state remain unclear. Since adult NSCs are enriched in genes associated with Ca2+ signalling pathways, we aimed to determine whether the transition from quiescence to aproliferative state is Ca2+ dependent. Here, we used miniature endoscopes (mini-endoscopes) to monitor NSC division and their regulation by Ca2+ signalling in freely behaving mice. Our data revealeddifferent Ca2+ dynamics and steady-state Ca2+ intracellular levels during NSC division. Pharmacological and in vivo CRISPR-Cas9 gene editing showed that IP3-sensitive intracellular stores and G-proteins regulators regulate the transition from quiescence to proliferation. We further used in vivo optogenetics to mimic Ca2+ dynamics of quiescence state to maintain NSCs in this state and prevent NSCsto transit into proliferative state. Our results demonstrate that Ca2+ dynamics and Ca2+ intracellularlevels play an important role in NSC activation. Next, we investigated NSCs microenvironmentmainly blood vessel and their role in their physiology. The NSCs contact the blood vessels by extending their basal processes. Direct cell-cell contact and the release of factors such as VEGF (vascularendothelial growth factor) by endothelial cells (EC) influence the NSC behaviour. As Notch pathwayis a key player in vasculature signalling, we inhibit in vivo the Notch signalling specifically in EC.We found that inhibition of Notch signalling in EC at early stage (P0) or later stage (P30) increasesNSC number. Morphological analysis of blood vessel reveals no alteration when Notch signalling isinhibited at later stages (P30). These finding showed that inhibition of Notch signalling in EC maintains NSC in quiescence state.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Les plaquettes sanguines contiennent une quantité abondante et diversifiée de microARN, qui sont de petits ARN non-codants d’une vingtaine de nucléotides de long capables de réguler l’expression des gènes de manière post-transcriptionnelle et séquence spécifique. Suite à leur activation, les plaquettes libèrent des microparticules (MPs), qui contiennent du matériel génétique issu de leur cellule d’origine et susceptible d’être transmis à une autre cellule afin d’y exécuter une fonction biologique. Durant mes travaux de thèse, j’ai étudié le rôle extra-plaquettaire des microARN et la capacité des MPs de plaquettes à participer aux communications intercellulaires. Les résultats que j’ai obtenus démontrent que les plaquettes activées à la thrombine libèrent la majorité de leur contenu en microARN dans les MPs, notamment miR-223. Les MPs sont internalisées par les cellules endothéliales HUVEC, et y délivrent leur contenu en miR-223. De plus, les MPs contiennent des complexes effecteurs Argonaute 2 (Ago2)•miR-223 fonctionnels et capables de réguler l’expression d’un gène rapporteur dans les cellules cibles endothéliales. Enfin, miR-223 provenant des MPs est capable de réguler l’expression de deux gènes endogènes prédits pour être ciblés par miR-223 et présents dans les HUVEC, à la fois au niveau de l’ARN messager (ARNm) et de la protéine. Dans une deuxième étude, j’ai démontré que ce phénomène n’est pas exclusif aux cellules endothéliales et qu’il peut également se produire avec les macrophages primaires humains. Les MPs sont effectivement internalisées par les macrophages et y délivrent leur contenu en miR-126-3p, qui y est fonctionnel et y régule l’expression d’un gène rapporteur et de gènes endogènes. De plus, l’internalisation des MPs induit une modification du transcriptome des macrophages receveurs, avec 66 microARN et 653 ARN codants ou non codants dont les profils d’expression sont modifiés. Ces changements sont accompagnés d’une diminution de la sécrétion de cytokines et de chimiokines, et d’une augmentation de la capacité de phagocytose par les macrophages. Mes travaux de doctorat démontrent que les microARN véhiculés par les MPs plaquettaires sont impliqués dans la reprogrammation de l’expression des gènes et des fonctions des cellules les internalisant, reflétant ainsi la complexité des communications intercellulaires. / Blood platelets contain an abundant and diverse array of microRNAs, which are small non-coding RNAs of ~20 nucleotides involved in post-transcriptional regulation of gene expression in a sequence-specific manner. Upon activation, platelets release microparticles (MPs) containing genetic materials from their parental cells that may be transferred to, and exert potent biological effects in, recipient cells. During my PhD thesis, I studied the extra-platelet role of microRNAs, and the ability of platelet-derived MPs to mediate cell-to-cell communications. The results that I obtained demonstrate that thrombin-activated platelets preferentially release their microRNA content in MPs, including miR-223. MPs can be internalized by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), to which they transfer their miR-223 content. Moreover, platelet MPs contain functional effector Argonaute 2 (Ago2)•miR-223 complexes that are capable of regulating expression of a reporter gene in recipient HUVEC. Finally, platelet MP-derived miR-223 could regulate expression of two endogenous genes in recipient HUVEC, both at the mRNA and protein levels. In a second study, I demonstrated that this process is not exclusive to endothelial cells, and could take place also in primary human macrophages. Following their internalization by macrophages, MPs deliver functional miR-126-3p, which regulated expression of both a reporter gene and endogenous genes. Furthermore, MP internalization modified the transcriptome of recipient macrophages, with 66 microRNAs and 464 coding and non-coding RNAs that are differentially expressed. These changes are associated with a reduced secretion of cytokines and chemokines, and a marked increase in the phagocytic capacity of macrophages. My doctoral work demonstrate that platelet-derived microRNAs transfered by MPs are involved in reprograming recipient cells’ gene expression and functions, which illustrate the growing complexity of cell-to-cell communications.

Titre de l'écran-titre (visionné le 11 septembre 2023) / Dans le testicule, il existe deux populations distinctes de cellules de Leydig, les cellules fœtales (FLC) et adultes (ALC). Elles produisent deux hormones, testostérone et INSL3 (Insulin-like 3) essentielles à la différenciation sexuelle masculine, fertilité et santé osseuse. Les mécanismes régulant la différenciation et la fonction des cellules de Leydig demeurent méconnus en raison de l'absence de modèle de souris exprimant la recombinase Cre afin de cibler exclusivement ces cellules. Puisque le gène Insl3 est exprimé uniquement dans les FLC et ALC, l'approche CRISPR/Cas9 a été utilisée pour insérer le transgène Cre recombinase améliorée (iCre) ou le transgène TdTomato dans le locus Insl3. Cependant la caractérisation de ces lignées de souris et l'expression exclusive du transgène dans les cellules de Leydig restaient à démontrer. Mon objectif était de caractériser certaines des nouvelles lignées de souris et en particulier, Insl3[exposant iCre]. Cette lignée a été croisée avec une souris rapporteuse Rosa26[exposant LoxSTOPLox-TdTomato] et la progéniture mâle issue de ces croisements a été sacrifiée à différents âges embryonnaires et postnataux. Les testicules ont été récoltés, congelés et coupés au cryostat. Des expériences d'immunofluorescence ont été réalisées. Chez la progéniture mâle, la protéine fluorescente rouge, TdTomato, a été observée dans les FLC et ALC (colocalisation avec CYP17A1, un marqueur spécifique des cellules de Leydig) aux âges fœtaux et postnataux examinés. La protéine TdTomato a été détectée dans les FLC dès E13.0, et dès P5 dans les ALC, corrélant avec le premier moment de la différenciation fonctionnelle des FLC et ALC, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée dans d'autres tissus examinés. Cette nouvelle lignée iCre exclusive aux cellules de Leydig représente une avancée majeure dans le domaine de l'andrologie et permettra d'aborder des questions fondamentales sur la biologie et la fonction des gènes dans les cellules de Leydig qui sont restées sans réponse pendant des décennies. / In the testis there are two populations of Leydig cells, fetal (FLC) and adult (ALC) Leydig cells. They produce two hormones, testosterone and INSL3 (Insulin-like 3) that are essential for male sex differentiation, fertility, and bone health. Our knowledge of mechanisms regulating differentiation and function of Leydig cells have remained incomplete because of the absence of a mouse model expressing Cre recombinase to exclusively target Leydig cells. Since INSL3 is uniquely expressed in both FLCs and ALCs, a CRISPR/Cas9 approach was used to knock-in the improved Cre recombinase (iCre) or TdTomato transgene into the Insl3 locus. However, the tissue and cell-specific transgene expression of the resulting mouse lines remained to be studied. My objective was therefore to characterize some of the new mice lines, particularly, Insl3[superscript iCre]. This mouse line was crossed with a Rosa26[superscript Lox-STOP-Lox-TdTomato] reporter mouse line and male off spring resulting from these crosses were euthanized at different embryonic and postnatal ages and the testes were harvested, frozen and cut in cryosections. Immunofluorescence experiments were subsequently performed. In male off spring, TdTomato red fluorescence was detected in both FLCs and ALCs at fetal and postnatal ages examined, as confirmed by immunofluorescence for CYP17A1, a marker of Leydig cells. The TdTomato protein was observed in FLCs as early as E13.0 while it was detected as early as P5 in ALCs, correlating with the earliest times of FLC and ALC differentiation, respectively. No fluorescence was observed in any other fetal or adult tissue examined. The Leydig cell-exclusive iCre line will be invaluable for generating Leydig cell-exclusive gene knockouts. These new genetic tools represent a major advance to the field of andrology that will allow us to address fundamental questions about the biology and gene function of Leydig cells that have remained unanswered for decades.

La maladie d’Huntington (HD) est un désordre neurodégénératif autosomal dominant qui se manifeste suite à une mutation du gène huntingtin. La maladie est caractérisée par une panoplie de signes cliniques qui incluent des problèmes psychiatriques, cognitifs ainsi que des incapacités motrices, en grande partie des mouvements choréiformes. D’un point vue neuropathologique, les cerveaux des patients touchés par la maladie présentent une atrophie majeure du cortex et du striatum où des pertes cellulaires massives sont observées. Il n’existe aucune cure ni traitements efficaces pour cette maladie, et pour ces raisons, plusieurs efforts sont actuellement déployés afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques telle, entre autre, la transplantation cellulaire. Ma thèse de Doctorat a donc porté, en grande partie, sur l’analyse de cerveaux de patients huntingtoniens recrutés pour l’essai clinique de l’University of South Florida. Ces patients, décédés entre 9 et 12 ans post-transplantation, ont reçus des greffes de tissu dérivé de l’éminence ganglionic latérale de fœtus humains âgés entre 8 et 9 semaines post-conception. Des travaux antérieurs menés dans le laboratoire du Dre Ciccheti ont montré que la survie des greffes est compromise à long terme chez ces patients. L’objectif de mon projet était de mieux comprendre les mécanismes responsables de la survie suboptimale des greffes. Nous avons donc formulé l’hypothèse que 1) la faible vascularisation des greffes, 2) la méthode de transplantation (des morceaux de tissu entier vs. des cellules mécaniquement dissociées) ainsi que 3) la présence de la protéine huntingtin mutée (mHtt) au sein du tissu greffé pouvaient contribuer à la dégénérescence des greffes. En effet, nous avons observé que les éléments de l’unité neurovasculaire étaient largement absents au sein des greffes. Les greffes présentaient une plus faible densité de capillaires et l’absence de larges vaisseaux sanguins, comparativement au cerveau hôte. Nous avons de plus observé un nombre réduit d’astrocytes au sein des greffes et une interaction limitée de ces cellules avec les vaisseaux sanguins, suggérant une défaillance des éléments de la barrière hémato-encéphalique. L’absence d’astrocytes était accompagnée par une carence de la sous-unité connexin 43 des gap junctions, importante pour les interactions greffe-hôte. Nous avons ensuite démontré que lorsque des cellules dissociées étaient transplantées dans le striatum de souris YAC128, un modèle murin de la maladie d’Huntington, la survie de la greffe était excellente et ni la vascularisation ou ni l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux était altérée. Finalement, nous avons fait l’extraordinaire découverte d’agrégats de la mHtt au sein du tissu greffé. Nous avons observé ces agrégats exclusivement dans la matrice extracellulaire de la greffe dans les tissus humains tandis qu’ils étaient présents au sein des neurones, de leurs dendrites, de la lame basale des vaisseaux sanguins et de la matrice extracellulaire dans le cerveau du patient. Dans son ensemble, cette thèse met en lumière de nouveaux mécanismes pouvant contribuer à la faible survie des greffes chez les patients souffrant de HD à long-terme. Ces résultats seront fort utiles afin d’améliorer cette approche thérapeutique et aideront à une meilleure compréhension des processus pathologiques de la maladie d’Huntington. / Huntington’s disease (HD) is a devastating autosomal dominant neurodegenerative disorder which manifests because of a mutation in the huntingtin gene. It is characterized by a variety of clinical signs which include psychiatric and cognitive problems as well as motor disabilities, in large part choreiform movements. Neuropathologically, the brains of patients afflicted with this disease present with a major atrophy of the cortex and striatum where massive cell losses are observed. To this day, cures remain unavailable and for this reason, an enormous amount of energy has been put into the development of experimental approaches, and for example into embryonic neuronal cell transplantation, which aims to replace lost cells. A few clinical trials have thus been initiated to evaluate whether such methodologies would be beneficial to patients. My PhD thesis focused, in large part, on the analysis of a number of brains from patients recruited for the University of South Florida trial and who eventually came to autopsy. These patients (4 analyzed post-mortem) received solid pieces of fetal striatal tissue and died between 9 and 12 years post-transplantation. Previous work carried out in Dr. Cicchetti’s laboratory has shown that graft survival is compromised in these patients long-term. The aim of my project was to further understand the mechanisms underlying this suboptimal graft survival. We hypothesized that 1) poor vascularization of the graft, 2) the method of transplantation (solid tissue vs. suspension cells) and 3) the potential presence of mutant huntingtin (mHtt) within the grafted tissue may all contribute to graft demise. Indeed, elements of the neurovascular unit were largely absent within the solid grafts. Grafts presented a lower density of capillaries and absence of large blood vessels compared to the host brain. Moreover, we observed a reduced number of astrocytes within the grafts and a limited interaction of these cells with blood vessels, suggesting impairment in blood brain barrier elements. The absence of astrocytes was accompanied by the lack of the gap junction subunit connexin 43, important for graft-host integration. Interestingly, when dissociated cells were transplanted in the striatum of YAC128 mice, a murine model of HD graft survival was excellent and neither the graft vascularization nor the interaction between astrocytes and vessels was altered. Finally, we describe for the first time the presence of mHtt inclusions within the grafted tissue. In the HD transplanted cases, aggregates were detected only in the extracellular matrix of the graft while in the host brain they co-localized with neurons or other cellular elements, such as the basal lamina of blood vessels. Taken together, this thesis sheds new light onto potential mechanisms contributing to poor long-term graft survival in HD patients. These results will help improve such therapies as well as to better understand disease process in HD.

Le développement embryonnaire est un processus complexe finement régulé spatio-temporellement par de nombreux acteurs, qu’ils soient ADN, ARN ou protéines. De récents résultats suggèrent un rôle clef dans le développement et les maladies pour une sous-catégorie des ARNs impliqués dans ces mécanismes, les longs ARNs non-codants (lncRNAs). Caractérisés par leur incapacité à produire des protéines, ils sont difficiles à étudier par leur manque de conservation en séquence et leur expression tissu-spécifique. Ici, nous étudions un lncRNA conservé, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), nécessaire au maintien de l’état pluripotent des cellules souches et essentiel à leur différenciation en neurones. Toutefois, les mécanismes dans lesquels cet ARN est impliqué restent inconnus. Pour y répondre, nous avons analysé des données de séquençage d’ARN de différenciation neuronale d’ESCs murines. Nous avons identifié deux nouvelles isoformes spécifiquement exprimées dans les ESCs, sht.Tuna et alt.Tuna. Cette dernière est le résultat de l’épissage alternatif de l’exon 1 de Tuna. Cet épissage alternatif est également observé chez l’humain, démontrant une conservation du traitement de l’ARN entre la souris et l’Homme. Ces deux isoformes sont plus courtes d’environ 1,5kb à l’extrémité 3’ que le transcrit prédit de Tuna (full.Tuna). En effet, l’isoforme full. Tuna n’a pas pu être détectée dans les ESCs, et la surexpression de sht.Tuna a permis d’améliorer la reprogrammation vers l’état pluripotent. Ceci suggère que le rôle de Tuna est mécanistiquement différent dans les ESCs et les neurones. D’autre part, Tuna présente une région hautement conservée (~200bp) contenant un potentiel cadre de lecture pour un peptide de 48 acides aminés, détectable par surexpression de constructions tagguées FLAG. La mutation du codon AUG de cette séquence codante a abrogé l’effet de l’ARN sur la reprogrammation. Ceci implique un rôle du peptide dans l’acquisition de la pluripotence. Par ailleurs, Tuna a été détecté dans les fractions poly-ribosomales et cytoplasmiques d’ARN, supportant son éventuel potentiel codant. Ensemble, ces résultats démontrent que l’épissage alternatif et le potentiel codant d’un locus propre à un lncRNA est complexe et que cet ARN pourrait avoir de multiples fonctions dépendantes de l’état cellulaire / Embryonic development is a complex process finely regulated in time and place by numerous actors such as DNA, RNA, and proteins. Emerging evidence suggests a key role in development and disease for a subcategory of RNAs implicated in those mechanisms, the long non-coding RNAs (lncRNAs). Characterized by their incapacity to produce proteins, they have proven to be challenging to study due to the lack of sequence conservation and their tissue-specific expression. Here, we focus on a conserved lncRNA, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), that is required for maintaining embryonic stem cells (ESCs) in an undifferentiated state but is also essential for their differentiation towards a neuronal cell fate. However, the mechanism behind this dual role remains largely unknown. To address this, we analyzed available RNA-seq data on mouse ESC differentiation towards neurons. We identified two novel isoforms specifically expressed in ESCs, sht.Tuna and alt.Tuna. The latter isoform was the result of alternative splicing of the exon 1 of Tuna. This alternative splicing was also observed in human ESCs demonstrating a conserved processing of the RNA between mouse and human cells. Both new isoforms were ~1.5kb shorter at the 3'-end than the predicted full transcript of Tuna (full.Tuna). In fact, we failed to detect the full.Tuna isoform in ESCs, and overexpression of sht.Tuna isoform enhanced reprogramming to a pluripotent stem cell state. This suggests that the role of Tuna is mechanistically different in ESCs than in neurons. Besides, Tuna also contains a highly conserved region (~200bp) harboring a predicted 48-amino-acids coding sequence that is detectable upon overexpression if FLAG-tagged. Mutating the start codon of this peptide's coding sequence abrogated the enhanced reprogramming effect. This infers a role for the peptide in the acquisition of a pluripotent state. Moreover, Tuna was detected in poly-ribosomal and cytoplasmic RNA fractions further supporting a peptide coding potential. Taken together, our results demonstrate that alternative splicing and coding potential of a particular lncRNA locus is complex and that a lncRNA may have multiple functionality depending on cell state.

Le cancer du poumon demeure le cancer le plus meurtrier et le plus souvent diagnostiqué. Le taux de survie à 5 ans est de moins de 20%, malgré les avancées en immunothérapie de la dernière décennie. Les inhibiteurs de point de contrôle immuns (ICI), plus particulièrement l'anti-PD-1, ont récemment connu des progrès dans le traitement du cancer du poumon. Toutefois, une résistance à ce traitement est présente chez une partie des patients. Le développement de tumeurs pulmonaires réduit les proportions de cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) (CD103⁺chez la souris et CD141⁺, chez l'humain), cellules importantes dans l'activation de la réponse immune anticancer, ce qui pourrait en partie expliquer la résistance. Ces cellules, également présentes chez l'humain (DC1 CD141⁺) sont spécialisées dans la présentation croisée des antigènes tumoraux, permettant l'activation des lymphocytes T cytotoxiques qui sont responsables d'éliminer les cellules tumorales. Les cDC1 sont aussi spécialisées dans la production d'Interleukine (IL)-12, cytokine déterminante dans la réponse anticancer. En contexte de cancer du poumon, cette population de cDC1 anticancer est réduite, ce qui pourrait expliquer partiellement l'inefficacité de la thérapie utilisant l'anti-PD-1. Ainsi, notre équipe a récemment démontré que, dans un modèle de cancer résistant aux anti-PD-1, l'administration de cDC1 restaurait la sensibilité au traitement, alors que l'administration de cDC1 seules n'avait pas d'effet. Notre hypothèse est donc que la potentialisation de l'activité anticancer des cDC1 avant leur injection par l'induction de leur maturation pourrait leur conférer un gain de fonction et donc une activité anticancer accrue. Ainsi, l'objectif de ce projet était de générer des cDC1 murines matures ayant une production d'IL-12 accrue et de générer des cDC1 humaines productrices d'IL-12. Chez la souris, l'efficacité d'un traitement dans lequel la population de cDC1 est régénérée par l'injection de cDC1 potentialisées sera testée sur la progression tumorale in vivo. Nous avons d'abord testé in vitro l'effet de différentes stimulations connues pour induire la maturation des DC (Poly I :C (agoniste du TLR3), anti-CD40, exposition à des cellules de cancer) sur la maturation et la production d'IL-12 de cellules dendritiques. Les conditions testées augmentaient la production d'IL-12 ainsi que l'expression de marqueurs de maturation (CD80, CD86, CD40) et de molécules régulatrices (PD-L1, PD-L2, CD200). Les proportions de cDC1 parmi les cDC totales étaient affectées négativement par les stimulations. Le Poly I :C semblait être la condition ayant le meilleur potentiel anticancer, puisqu'elle augmente significativement la production d'IL-12 tout en préservant la proportion de cDC1 dans les cultures. Nous avons ensuite vérifié l'impact de l'administration de cDC1 stimulées au Poly I :C comparativement aux cDC1 normalement dérivées de la moelle osseuse sur la progression du cancer in vivo dans des souris Baft3[exposant -/-] (lesquelles sont déficientes en cDC1) auxquelles des cellules de cancer (CMT-167) ont été injectées. L'injection des cDC1 stimulées au Poly I: C diminue la sévérité du cancer et le nombre de nodules pulmonaires comparativement à l'administration des cDC1 non stimulées, ou à l'absence de traitement. De plus, le traitement semble favoriser la réponse anticancer associée aux lymphocytes T. Sachant que la stimulation au Poly I :C confère un gain de fonction in vivo aux cDC1, nous avons investigué l'effet de la combinaison de DC1 et d'un inhibiteur de point de contrôle immun (ICI) anti-PD-1 dans un modèle de cancer résistant à cette thérapie (CMT-167). L'administration de cDC1 potentialisées tends à diminuer la sévérité du cancer, bien qu'aucune synergie n'ait été observée dans la combinaison des options thérapeutiques. Dans le passé, l'utilisation de cellules dendritiques humaines dans le traitement du cancer a fait l'objet d'études cliniques, sans grand succès. Toutefois, ces études utilisaient une sous population de DC non spécialisée dans la réponse anticancer et différente des cDC1. Le développement d'une approche permettant d'obtenir des DC1 humaines conventionnelles productrices d'IL-12 demeure un défi, puisque les précurseurs de cDC proviennent de la moelle osseuse. Nous avons pu obtenir des cDC1 dérivées de la moelle osseuse de patients ayant subi une ablation de côte. Le R848, agoniste des TLR7/8 induit de manière modeste la production d'IL-12 par les cellules obtenues. Ces résultats suggèrent que les agonistes de TLR potentialisent l'activité des cDC1 et que l'administration de cDC1 potentialisées diminue la progression du cancer, chez la souris. Cette approche pourrait devenir une nouvelle avenue thérapeutique. / Lung cancer remains the deadliest and most diagnosed cancer. The 5-year survival rate is less than 20%, despite advances in immunotherapy over the past decade. Immune checkpoint inhibitors (ICIs), specifically anti-PD-1, have recently seen advances in the treatment of lung cancer. However, resistance to this treatment is present in some patients. Lung tumor development reduces CD103⁺ type 1 conventional dendritic cells (cDC1) population in mice, partly explaining resistance to anti-PD-1. These cells are also present in human (CD141⁺ DC1) and are necessary for anticancer immune response activation since they specialize in cytotoxic T lymphocytes (CTL) activation through tumor-antigen cross-presentation. CTL are anticancer immune response effector cells which destroy tumor cells upon recognition. cDC1s are also specialized in Interleukin (IL)-12, an important cytokine in cancer immunity. In lung cancer, cDC1 population is reduced locally in the lung. This could partly explain anti-PD-1 inefficacy. Thus, our team recently demonstrated that, in an anti-PD-1 resistant cancer model, administration of cDC1 restored sensitivity to treatment, while administration of cDC1 alone had no effect. Our hypothesis is therefore that the potentiation of cDC1 before their injection by the induction of their maturation could give them a gain in function and therefore an increased anticancer activity. Thus, the objective of this project was to generate mature and IL-12 producing mice and human cDC1s and to test the efficacy of potentialized cDC1 administration on tumor progression. We therefore tested in vitro effects of Poly I:C, anti-CD40 and cancer cell exposure stimulations (known to induce DC maturation) on cDC maturation and IL-12 production. All conditions upregulated IL-12 as well as maturation markers (CD80, CD86, CD40) and regulatory molecules (PD-L1, PD-L2, CD200). cDC1 population were reduced by stimulations. Poly I:C seemed to confer best anticancer potential, since it significantly induces IL-12 production while preserving cDC1 population in cultures. We then verified the impact of Poly I:C stimulated cDC1 administration compared to unstimulated cDC1 on cancer progression in vivo in Baft3[superscript -/-] mice lacking cDC1s previously administered with CMT-167 cancer cells. Stimulated cDC1 injection reduced cancer severity and number of tumors compared to unstimulated cDC1 or untreated mice. Furthermore, stimulated cDC1s seem to induce T cell associated immunity. Knowing that Poly I: C stimulation confers a gain of function to cDC1, we investigated the effects of stimulated cDC1 treatment in combination with anti-PD-1 in a resistant cancer model (CMT-167). Potentialized cDC1 tends to reduce cancer severity but no synergy was observed when treatments were combined. In the past, the use of human dendritic cells in the treatment of cancer has been the subject of clinical studies, without success. However, these studies used a different subpopulation of DC that was not specialized in the anti-cancer response. Developing an approach to generate conventional human cDC1s that produce IL-12 remains a challenge, since pre-DC come from bone marrow. We were able to generate cDC1 from human bone marrow from patients who underwent rib ablation R848, a TLR7/8 agonist, modestly induces IL-12 production by DCs generated from bone marrow. These results suggest that TLR agonists potentialize cDC1 cancer activity and that the administration of potentialized cDC1 reduces cancer progression. This approach could become a new therapeutic avenue.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / La capacité des cellules à migrer à distance de leur lieu de production est un élément clé du développement embryonnaire du cerveau. A l'âge adulte, dans le système nerveux central, la migration cellulaire est associée aux niches neurogéniques de la zone sous ventriculaire et du gyrus dentelé. Certaines conditions pathologiques ou lésions cérébrales peuvent créer un environnement pouvant attirer les précurseurs neuronaux en dehors de leurs voies habituelles de migration vers le site de lésion. Finalement, des déficits en migration durant le développement peuvent entrainer l'apparition de pathologies se traduisant par une organisation non conventionnelle des réseaux neuronaux pouvant conduire entre autres à l'apparition de troubles cognitifs ou de symptômes épileptiques. La migration des cellules est guidée par un ensemble complexe de signaux moléculaires, d'interactions physiques et de gradients électriques. C'est l'intégration de ces signaux au niveau intracellulaire qui coordonne la réponse migratoire de la cellule en modulant par exemple le cytosquelette, divers organites tels que les mitochondries ou des mécanismes tels que l'autophagie. Au cours des travaux présentés dans cette thèse, j'ai utilisé comme modèle d'étude la migration des neuroblastes dans le courant migratoire rostral, qui achemine les précurseurs neuronaux depuis la zone sous ventriculaire jusqu'au bulbe olfactif où ils intègrent les réseaux neuronaux existants. Dans le premier chapitre, je me suis intéressé à la contribution du mécanisme d'autophagie dans le contrôle de la migration cellulaire. Nous avons montré que l'autophagie est nécessaire au maintien d'une migration normale et que ce mécanisme est régulé temporellement et spatialement durant la migration. Son activation est liée au niveau énergétique intracellulaire et passe par l'activation d'AMPK, qui est le senseur d'énergie majeur de la cellule. Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à l'impact sur la migration cellulaire de mutations des cadhérines Fat4 et Dchs1 qui entrainent chez l'humain un phénotype d'hétérotopie neuronale périventriculaire. Grâce à l'utilisation de greffes de cellules progénitrices issues de cellules humaines pluripotentes induites (dont l'acronyme anglais est iPSC) j'ai pu confirmer un défaut de migration des cellules présentant des mutations pour l'une ou l'autre de ces protéines. Pour finir nous avons aussi pu montrer que ce défaut de migration est accompagné d'une dysfonction dans le flux d'autophagie et une diminution du nombre de lysosomes disponibles. / The ability of cell to migrate away from their sites of production is a major process during embryonic and postnatal brains development allowing for a correct positioning of cells. During adulthood, in the central nervous system, cell migration is still present and, under physiological conditions, is associated with neurogenic niches of the subventricular zone and the dentate gyrus. Some pathologies or brain damaged could de-route migratory neurons away from their normal paths of migration to lesions sites. It should be also mentioned that during embryonic development, migration-associated disorders could lead to brain malformation resulting in cognitive disorder or epilepsy. Migratory behaviors of cells is determined by a complex mixture of extrinsic molecular cues, physical scaffold, or electrical gradient. The integration of these signals at the cellular level creates a coordinated response of intracellular elements like cytoskeleton, mitochondria, or autophagy. In this work, I studied the role of autophagy in neuronal migration under physiological and pathological conditions by using a migration of neuroblasts from the subventricular zone to the olfactory bulb along the rostral migratory stream as model system. In the first chapter of my thesis, I studied the contribution of autophagy in the control of cell migration under physiological conditions. We showed that autophagy is spatially and temporally regulated in migrating neuroblasts and maintains a normal rate of migratory event. This process is controlled by intracellular ATP/ADP level via the activation of AMPK In the second part of this work, I focused on mutation for paired cadherins Fat4 and Dchs1 leading to periventricular neuronal heterotopia phenotypes in humans. By grafting in the pups with NPCs derived from human iPSC with mutation form Fat4 or Dchs1, I showed default of migration in vivo of NPCs with these two mutations. We also showed that these cells exhibit altered autophagy flux associated with a decreased in lysosomal vesicles.