Des travaux menés au laboratoire sur la biologie des neurofilaments et sur leurs interactions avec les autres constituants du cytosquelette ont montré, sur différents filaments intermédiaires, des sites de fixation de la tubuline libre TBS (« tubulin-binding site »). Parmi les peptides synthétisés correspondants à ces séquences, le peptide NFL-TBS.40-63 issu de la sous-unité légère des neurofilaments (NFL) a révélé in vitro et in vivo des propriétés de ciblage et une action anti-tumorale sur des cellules de glioblastome, tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive, pour laquelle l’efficacité des traitements actuels reste très limitée. L’intérêt thérapeutique de ce peptide est renforcé par le fait qu’il entre peu et qu’il n’a pas d’effet cytotoxique dans des cellules saines (astrocytes, neurones). Dans cette thèse les travaux décrivent les mécanismes d’entrée du peptide NFL-TBS.40-63 dans les cellules de glioblastome, pour mieux comprendre sa sélectivité. Sa spécificité d’action dans ces cellules a été complétée en analysant les effets du peptide sur l’organisation et la fonction mitochondriales. Enfin, nous montrons que le peptide cible des cellules souches neurales, qui pourraient être à l’origine du développement des glioblastomes, et qui pourraient servir d’outil thérapeutique dans de nombreuses pathologies cérébrales, telles que des lésions traumatiques et des maladies neurodégénératives. Ces travaux indiquent que le peptide NFL-TBS.40-63 représente un outil prometteur dans la stratégie thérapeutique des glioblastomes. Il peut aussi permettre de cibler les cellules souches neurales pour développer de nouveaux traitements des pathologies cérébrales. / In the laboratory, investigations on neurofilament biology and on their interactions with other cytoskeleton components showed tubulin-binding sites (TBS) on different intermediate filaments. Among the synthesized peptide corresponding to these sequences, the NFLTBS.40-63 peptide derived from the neurofilament light subunit (NFL), revealed in vitro and in vivo targeting properties and anti-tumour effect on glioblastoma cells, the most frequent and aggressive brain tumour, for which current treatments show very limited effects. The therapeutic value of this peptide is reinforced by its lower uptake and the lack of a major cytotoxic effect in healthy cells (astrocytes, neurons). Works in this thesis describe the uptake mechanisms of the NFL-TBS.40-63 peptide in glioblastoma cells, to better understand its selective internalization. Its specificaction on glioblastoma cells has been completed by the analysis of the peptide effects on the mitochondrial organization and function. Finally, we show that the peptide targets neural stem cells, which could be at the origin of glioblastoma, and serve as a therapeutic tool inseveral brain diseases, such as traumatic injuries and neurodegenerative diseases. Altogether these works indicate that this NFL-TBS.40-63 peptide is a promising tool for therapeutic strategies of glioblastoma. It can also target neural stem cells in order to develop new treatments for various brain disorders.

Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une vacuolisation intense et une perte neuronale associées à l’accumulation d’une protéine prion pathologique : la PrPSc. A cause de la longue période d’incubation silencieuse de ces maladies, les individus souffrant d’une maladie à prions peuvent exposer des patients qui recevraient leur sang ou un de leurs organes à un risque de contamination iatrogène. De plus, lorsque le diagnostic survient, les dommages cérébraux sont souvent massifs, et l’issue toujours fatale. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, et l’ensemble des stratégies testées a échoué.L’alternative développée par le laboratoire est celle de la thérapie cellulaire couplée à la thérapie génique, en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) délivrant des molécules anti-prions. Concernant le choix des molécules anti-prions, nous avons choisi les mutants PrP-DN. Notre hypothèse repose sur des études montrant qu’une lysine au codon 219 de la PrP chez l’Homme ou une arginine au codon 171 de la PrP ovine, protègent du développement d’une ESST. L’étude de ces mutants, en cellules infectées ou dans des souris transgéniques, a permis de montrer que les PrP mutées n’étaient pas converties en PrPSc et qu’elles exerçaient un effet protecteur dit « dominant négatif » sur la conversion de la PrPC sauvage en PrPSc.Un des projets du laboratoire avait donc pour objectif d’utiliser les cellules souches exprimant les mutants PrP-DN pour développer une stratégie de thérapie génique et cellulaire des maladies à prions : l’hypothèse étant que les cellules greffées pourraient non seulement réparer le tissu lésé mais que ce dernier serait également protégé de l’infection par les prions.Une première approche de thérapie génique et cellulaire avait été initiée au laboratoire et montrait des résultats plutôt encourageants. En effet, la greffe de cellules souches neurales murines exprimant des PrP-DN et produites à partir de cellules souches embryonnaires murines, conduisait, pour une partie des souris, à un allongement du temps d’incubation de la maladie, ainsi qu’à une diminution de l’astrogliose et de la vacuolisation.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse a été de valider l’approche thérapeutique en montrant que les cellules greffées délivraient des mutants PrP-DN capables d’inhiber la réplication du prion. Nous avons opté pour un modèle de culture organotypique infectée par des prions murins. En plus de répondre aux exigences éthiques de la directive 2010/63/UE, ce modèle offre l’avantage de pouvoir réaliser plus d’essais, des cinétiques d’accumulation de PrPSc et de visualiser le devenir des cellules greffées. Enfin, opter pour cette stratégie permettait de transposer dans un modèle humanisé des travaux précédemment réalisés et ayant montré des résultats encourageants. Pour cela, il a été nécessaire de mettre en place un modèle prion ex vivo de culture organotypique de tranches de cerveau, dans lequel il était possible de réaliser des greffes et permettant d’évaluer l’effet inhibiteur des mutant-PrP-DN sur la réplication du prion. Par ailleurs, notre groupe fait partie, avec d’autres groupes travaillant avec des cellules souches mésenchymateuses, de l’équipe « Biologie des cellules souches et médecine régénératrice », il nous est apparu pertinent d’évaluer l’effet des MSC sur la pathologie prions dans des modèles prions en culture organotypique et en particulier d’évaluer l’impact de greffes de MSC concomitantes aux greffes de NSC-PrP-DN. En effet, ces cellules sont décrites comme pouvant induire un microenvironnement neuroprotecteur en limitant la prolifération des cellules de la microglie et des astrocytes, et peuvent favoriser la différenciation des NSC. Enfin notre dernier objectif visait à transposer les outils murins vers des outils « humains » en produisant des NSC humaines issues d’ES et exprimant une PrP humaine portant les mutations DN. / Transmissible spongiform encephalopathies are neurodegenerative diseases characterized by a strong vacuolization, a neuronal lost and deposits of prion pathologic protein: PrPSc. This PrPSc accumulation is the result of the conformational conversion of the host encoded endogenous PrPC protein. Although the incidence of these diseases in humans remains low (about one to two cases per million inhabitants per year), these diseases remain a public health problem. Indeed, because of their long and silent incubation period, patients with prion disease may expose people through blood transfusion or organ transplantation with a risk of iatrogenic contamination. In addition, when the diagnosis occurs, brain damage is often massive, and the outcome is always fatal and rapidly occurs. Until now, there is no treatment that could be proposed to patients.The alternative developed by our laboratory for several years, is a strategy of cell therapy coupled with gene therapy. The general objective is to use pluripotent embryonic stem cells (ESC) and graft them as a “medicine” not only to orchestrate a functional recovery of the damaged zones and protect the grafted cells from prion propagation but also to deliver anti-prion molecules.For the anti-prion molecules, we have chosen dominant negative PrP mutants (PrP-DN). Our choice is based on studies showing that a lysine at codon 219 of the human PrP or an arginine at codon 171 of the ovine PrP protect against the development of a TSE. Study of these mutants in infected cells or in transgenic mice showed that the mutated PrPC were not converted into PrPSc. Moreover, they exibit a so-called "dominant negative" protective effect on the conformational conversion of their wild-type PrPC counterparts. A first approach of gene and cell therapy was initiated in the laboratory and has shown encouraging results. Indeed, the graft of murine neural stem cells (NSC) derived from murine embryonic stem cells and expressing anti-prion molecules, has allowed, for some of the mice, to an increase the incubation time of the diseaseas well as to a decrease of astrogliosis and vacuolization.In this context, the first objective of my thesis was to validate the therapeutic approach by showing that the grafted cells were able to inhibit prion replication trough the dominant negative effect of the PrP-DN. To address this point, we have chosen to use an organotypic culture model infected with murine prions (22L strain). In addition to fill the ethical requirements under the European Directive 2010/63 and the 3Rs, organotypic culture models offer the advantage to perform and repeat experiments, kinetic tests, and PrPres analysis. This model also allows to visualize the fate of the grafted cells. Finally, by choosing this strategy, it will be possible to transpose into a humanized model the work previously performed on mouse organotypic cultures.To achieve this task, it was necessary to establish an ex vivo prion model of organotypic culture brain slices, in which it was possible to perform grafts and to evaluate the inhibitory effect of PrP-DN mutants on the prion replication.In addition, as our group is included in the team "Stem cell biology and regenerative medicine" (led by Pr Jorgensen) in which several stem cells are studied (liver stem cells and mesenchymal stem cells (MSC)) and because MSC have been shown to provide protective effects when grafted in the brain of mice with neurological diseases, it was therefore relevant to evaluate the effect of MSC on prion pathology in our prion models and in particular to evaluate the impact of concomitant MSC grafts on NSC-PrP-DN.In a last step, our goal was to transpose the mouse tools (NSC from ES and expressing the PrP-DN mutants) to "human" tools by producing human NSCs derived from human ESC and expressing human PrP-DN, and to characterized the resulted cells.

Chez les mammifères, une centaine de gènes sont soumis à une régulation épigénétique où seule la copie maternelle, ou paternelle, est exprimée. Ce phénomène appelé empreinte parentale alimente encore différentes théories liées à la reproduction, notamment celles du conflit parental et de la coadaptation entre mère et enfant. Pw1/Peg3 est un gène d'empreinte paternellement exprimé. Cependant, à l'aide de deux modèles de souris bien distincts, une souris rapporteur (Pw1IRESnLacZ) et une nouvelle souris knockout pour Pw1/Peg3, nous avons détecté des transcrits Pw1/Peg3 maternels dans le cerveau périnatal. Plus précisément, nous avons mis en évidence une expression bi-allélique du gène rapporteur Pw1IRESnLacZ restreinte aux deux futures niches de cellules souches neurales adultes. In vitro, nous avons conclu, via des cultures primaires de cellules souches neurales, que l'expression bi-allélique endogène de Pw1/Peg3 est un évènement ponctuel rare. D'ailleurs lors de la caractérisation de notre modèle de souris Pw1/Peg3 knockout, nous avons observé un retard de croissance uniquement lors de la délétion de l'allèle Pw1/Peg3 paternel. Ce phénotype n'est pas lié à un problème de prise alimentaire chez les nouveaux-nés et contrairement à ce qui a été précédemment décrit, nous n'avons détecté aucun défaut de comportement maternel chez les femelles mutantes pour Pw1/Peg3. La lactation n'est pas non plus impactée par la délétion de Pw1/Peg3. Ces résultats démontrent que Pw1/Peg3 favorise intrinsèquement la croissance postnatale et que, désormais, ce gène d'empreinte ne peut plus être utilisé afin d'illustrer la théorie de coadaptation entre mère et enfant. / In mammals, a hundred of genes are preferentially expressed from one specific parental allele; a phenomenon referred as genomic imprinting. Establishing theories to explain the emergence of such a gene dosage strategy is challenging. Pw1/Peg3 is a paternally expressed gene. Using both a reporter mouse model and a novel constitutive knockout mouse model, we detected Pw1/Peg3 transcription from the maternal allele, which is normally silent, in the perinatal brain. Specifically, we observed that a putative Pw1/Peg3 bi-allelic expression is mainly restricted to the two future adult neural stem cells niches. In vitro experiments on primary neural stem cells allowed us to conclude that imprinting relaxation of the Pw1/Peg3 maternal allele is a rare event. Whether it affects the mouse phenotype is currently under investigation. In parallel, consistent with previously established mutant mouse models we confirmed that paternal Pw1/Peg3 deletion leads to growth retardation. However we did not find any impairment in maternal behaviors upon heterozygous or homozygous loss of Pw1/Peg3. Lactation was also not disrupted and mutant pups exhibited a normal suckling ability. Taken together, PW1/PEG3 promotes growth intrinsically and can no longer be used to illustrate the popular coadaptation theory between mother and infant.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Facteur de transcription Ikaros / La rétine constitue un modèle très intéressant pour l'étude du développement du système nerveux. Elle origine de cellules neuroépithéliales qui se diviseront et se différencieront pour donner naissance à 6 différents types de neurones et un type de cellule gliale. Au cours du développement, la majorité des cellules progénitrices de la rétine (CPRs) sont multipotentes et quelques unes ont même le potentiel de générer tous les différents types cellulaires de la rétine. Cependant, à des stades plus tardifs, les CPRs perdent alors la compétence qui leur permet de générer les cellules dites précoces et acquièrent la capacité de générer les cellules dites tardives. Il est clair que l'ensemble des types cellulaires est produit dans un ordre bien précis et concomitant, mais les mécanismes moléculaires par lesquels les CPRs changent leur compétence au cours du temps pour générer chaque type de cellule au bon moment restent toutefois inconnus. Le facteur de transcription Ikaros avait été largement étudié dans le système hématopoïétique, cependant son rôle potentiel au niveau du système nerveux n'avait que très peu été exploré. Dans cette étude nous avons investigué l'hypothèse qu'Ikaros puisse contrôler la compétence temporelle des CPRs. Nous avons premièrement observé qu'Ikaros est exprimé dans les CPRs au début du développement tandis qu'à des stades plus avancés son expression devient alors restreinte à une sous-population pour finalement être absente dans l'ensemble des CPRs aux derniers stades du développement de la rétine. De plus, chez la rétine adulte, Ikaros est exprimé dans les neurones différenciés de type précoce. En effectuant une analyse clonale à l'aide de rétrovirus, nous avons montré qu'en induisant l'expression d'Ikaros dans les CPRs à des stades tardifs, où il n'est normalement pas exprimé, il est possible d'induire la production de cellules de type précoce au dépend des cellules produites tardivement. De plus, l'analyse de souris dont le gène Ikaros à été inactivé nous a révélé que plusieurs cellules nées précocement au cours du développement sont manquantes. L'ensemble de ces résultats suggère donc un modèle dans lequel l'expression d'Ikaros est à la fois nécessaire et suffisante pour conférer une compétente temporelle précoce au CPRs. Une fois la diversité cellulaire générée, des vagues d'apoptoses successives ont lieu de manière à éliminer les cellules extranuméraires ou corriger les erreurs de connections. La mort cellulaire programmée ou apoptose est donc un procédé essentiel au développement du système nerveux. Cependant, les régulateurs extracellulaires de cette mort cellulaire developpementale restent toutefois très méconnus. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation du CNTF/LIF durant le développement rétinien in vivo. Nous démontrons que l'exposition au CNTF durant le développement postnatal de la rétine in vivo retarde l'expression de la rhodopsine et résulte en un important déficit spécifique en photorécepteurs. Plus spécifiquement, nous montrons que l'exposition au CNTF induit une augmentation importante de la mort cellulaire des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets. De plus, nous montrons que le blocage de la voie du CNTF/LIF durant le développement de la rétine de souris in vivo résulte en une diminution significative de la mort cellulaire developpementale des photorécepteurs. Nous démontrons aussi que la voie CNTF/LIF est responsable de l'apoptose spécifique des photorécepteurs issuent de clones contenant seulement des photorécepteurs sans toutefois affecter les photorécepteurs issuent de clones mixtes. Nous avons observé que la stimulation ou le blocage de la voie du CNTF/LIF contrôle l'expression génique des isoformes neuronale et endotheliale de la synthase d'oxide nitrique (NOS) et la production subséquente d'oxide nitrique (NO) à partir de ces enzymes est responsable de l'apoptose induite par CNTF . Ces résultats suggèrent donc que la voie de signalisation du CNTF/LIF est active au cours du dévelopement rétinien et agit via la régulation de la production d'oxide nitrique afin de moduler la mort cellulaire programmée des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets.

Le mécanisme biologique responsable pour l’augmentation de l’expression de la protéine nestin dans les cellules souches neurales (CSN) du cœur après un infarctus du myocarde (IM) demeure inconnu. Des études antérieures ont démontré que le traitement au dexamethasone, un glucocorticoïde aux propriétés anti-inflammatoires, abolit la régulation positive de nestin après un IM. Ceci suggère un lien avec la réponse inflammatoire. Nous avons vérifié dans cette étude l’hypothèse que la cytokine inflammatoire interleukin-1beta (IL-1beta) peut modifier le phénotype de cellules souches neurales. Le deuxième objectif de l’étude fut d’établir l’impact, suivant un IM, de l’inhibition de la signalisation de IL-1beta sur la fonction et la guérison cardiaque. Suite à une ligature complète de l’artère coronaire du rat mâle, le dysfonctionnement contractile du ventricule gauche fut associé à une régulation positive de la protéine nestin dans le myocarde non-infarci. Le traitement avec Xoma 052 (1 mg/kg), un anticorps anti-IL-1beta, 24h, 7 et 14 jours après un évènement ischémique, eu aucun effet sur la taille de l’infarctus ou la contractilité du ventricule gauche. De plus, le traitement avec Xoma 052 après un IM n’a pu supprimer l’augmentation de l’expression de nestin et Bcl-2 malgré une réduction modeste du niveau de la protéine Bax. Pour déterminer directement le rôle de la réponse inflammatoire en l’absence d’ischémie, nous avons injecté des rats mâles avec du LPS (10mg/kg, 18hrs). Dans le coeur du rat-LPS, nous avons noté une augmentation significative du niveau d’ARNm de IL-1beta et de l’expression de la protéine nestin. Le prétraitement avec 10mg/kg de Xoma 052 a aboli l’augmentation de l’expression de nestin dans le coeur des rats-LPS. Ces observations indiquent que les cellules souches neurales pourraient représenter une cible potentielle de l’IL-1beta. / The underlying biological event(s) implicated in the increased expression of nestin in cardiac resident neural stem cells (NSC) following myocardial infarction (MI) remain unknown. Past studies have shown that dexamethasone treatment, a synthetic glucocorticoid with potent anti-inflammatory properties, abolished the upregulation of nestin in the non-infacted left ventricle (NILV) following MI. This suggests an association with the inflammatory response. The present study tested the hypothesis that the inflammatory cytokine interleukin-1beta (IL-1beta) can influence the neural stem cell phenotype. A secondary goal of the study was to assess impact of IL-1beta signalling inhibition on cardiac function and wound healing following MI. Following complete coronary artery ligation of the adult male rat heart, left ventricular contractile dysfunction was associated with the upregulation of the pro-apoptotic protein bax, the anti-apoptotic protein Bcl-2 and nestin in the non-infarcted myocardium. Xoma 052 (1 mg/kg), an IgG antibody directed against IL-1beta, was administred 24 hrs after ischemic injury and subsequently injected 2x over a period of 21 days. Treatment did not alter infarct size or improve left ventricular contractility. In addition, it failed to abolish the increased expression of nestin and Bcl-2, and modestly reduced bax protein levels. To directly assess the relationship between inflammation and the expression of nestin in the absence of an ischemic insult, adult male rats were injected with lipopolysaccharide (LPS) (10mg/kg;18 hrs). In the heart of LPS- treated rats, IL-1beta mRNA levels were significantly increased and associated with elevated nestin protein expression. The pre-treatment with Xoma 052 (10mg/kg) abolished the increased expression of nestin in the heart of LPS-treated rats. These data indicate that neural stem cells may represent a target for IL-1beta. However, futher investigation is required to elucidate the role of IL-1beta on NSC following MI.

Les p21-activated kinases (PAK) du sous-groupe I sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels la prolifération, les mouvements cellulaires, l’adhérence et l’apoptose. Ces kinases sont des effecteurs des Rho-GTPases Rac1 et Cdc42 et participent à la régulation du cytosquelette d’actine. Les deux kinases neuronales PAK1 et PAK3, qui présentent de fortes identités de séquence, régulent le cytosquelette d’actine, contrôlant ainsi la dynamique des épines dendritiques, et la plasticité synaptique.Les mutations du gène pak3, localisé sur le chromosome X, sont responsables de déficience intellectuelle chez l’homme, et les mécanismes moléculaires et cellulaires associés aux défauts cognitifs sont mal connus. Il a été montré que PAK3 participe à la voie proneurale au cours de l’embryogénèse précoce du xénope en favorisant la sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale. Cependant, le rôle de PAK3 dans la neurogenèse adulte n’a pas été étudié. Or depuis maintenant une quinzaine d’années, il est admis que la neurogenèse perdure à l’âge adulte et participe aux processus de mémorisation et d’apprentissage. Nous nous sommes donc intéressés à l’implication de PAK3 dans la régulation de la neurogenèse adulte, posant l’hypothèse qu’un défaut de neurogenèse serait responsable, au moins en partie, des défauts cognitifs chez les patients. Nous avons montré que PAK3 n’est pas exprimée dans les cellules souches neurales/progéniteurs prolifératifs mais son expression augmente fortement dès le retrait des facteurs de croissance, ex vivo, suggérant un rôle dans la neurogenèse adulte. Nous avons montré que l’invalidation de pak3 provoque une augmentation de la fréquence de neurosphères primaires formées ainsi qu’un accroissement de leur taille, ceci sans affecter la taille du réservoir de cellules souches ni les propriétés cardinales de celles-ci (multipotence, auto-renouvellement et prolifération). Toutefois, les cellules progénitrices pak3- poursuivent leur prolifération dans des conditions de culture induisant normalement la différenciation, suggérant un défaut de sortie du cycle cellulaire.Nous nous sommes ensuite demandé si les mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 altèrent la neurogenèse adulte. Nous avons créé pour cela un modèle murin portant la mutation R67C, responsable chez l’homme de la forme la plus sévère de déficience intellectuelle associée aux mutations de ce gène. Nous mettons en évidence, dans cette souris knock-in, une forte diminution du nombre de cellules nouveau-nées dans les deux zones neurogéniques du cerveau (la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de l’hippocampe) et une augmentation de la proportion de neurones nouveau-nés immatures. Ces données suggèrent que la mutation R67C n’induit pas une perte de fonction de la kinase mais un changement de fonction dépendante d’une activation préférentielle par la GTPase Rac1.En conclusion, ce travail de thèse montre que PAK3 participe à la régulation de la neurogenèse adulte chez les mammifères, contrôle la sortie du cycle cellulaire des progéniteurs neuraux et que la mutation R67C impacte la maturation des neurones nouveau-nés. L’ensemble de ces données suggère que les défauts de neurogenèse adulte dus aux mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 sont à l’origine de certains dysfonctionnements cognitifs. / The group I p21-activated kinases (PAK) are involved in many cellular processes such as proliferation, cell movement, adhesion and apoptosis. These kinases are effectors of Rho GTPases Rac1 and Cdc42, and participate in the regulation of the actin cytoskeleton. Both neuronal kinase PAK1 and PAK3, which exhibit high sequence identities, regulate the actin cytoskeleton, thereby controlling the dynamics of dendritic spines and synaptic plasticity. Mutations of the X-linked pak3 are responsible for intellectual disability (ID) in humans, and the molecular and cellular mechanisms associated with cognitive defects are poorly described. It was shown that PAK3 participates in the proneural pathway during early Xenopus embryogenic development, by promoting cell cycle exit and neuronal differentiation of neural precursors. However, the role of PAK3 in the adult neurogenesis has not been studied in mammals. It is now generally accepted that neurogenesis persists during human adulthood and is involved in learning and memory. We are therefore interested in the involvement of PAK3 in the regulation of adult neurogenesis, on the assumption that defects in neurogenesis may be responsible, at least in part, for cognitive defects in ID patients.We showed that PAK3 is not expressed in proliferative neural stem/progenitor cells but its expression increased significantly upon growth factor removal, suggesting a role in adult neurogenesis. We showed that the invalidation of pak3 gene causes an increase in the frequency and in size of primary neurospheres. However Pak3 invalidation does not affect the size of the stem cell reservoir nor the NCS cardinal properties (pluripotency, self-renewal and proliferation). However, the pak3- progenitor cells continue their proliferation in culture conditions normally inducing differentiation, suggesting a defect in cell cycle exit. We then asked whether pak3 ID mutations affect adult neurogenesis. We created a knock-in model expressing the pak3-R67C mutation responsible in humans for a severe form of intellectual impairment. We observed in the knock-in mice, a significant decrease in the number of newborn cells in both neurogenic areas of the brain (the subventricular zone inforebrain, and the dentate gyrus of the hippocampus) and an increase in the proportion of immature newborn neurons. These data suggest that the R67C mutation does not induce a loss of function of the kinase but a change of a function dependent on preferential activation by the Rac1 GTPase.In conclusion, we show that PAK3 play an important role in the regulation of adult neurogenesis in mammals by controlling the cell cycle exit of neural progenitors. The R67C ID mutation impacts both newborn cell proliferation and their maturation. Taken together, these data suggest that defects in adult neurogenesis caused by ID mutations in the pak3 gene may be involved in some cognitive dysfunctions.

La voie de signalisation du morphogène Sonic Hedgehog (Shh) met en jeu des processus complexes étudiés, jusque là principalement, au cours du développement embryonnaire, où Shh est primordial pour le développement du tissu nerveux. Shh transmet son action via le complexe-récepteur Patched/Smoothened (Ptc/Smo) et le facteur de transcription Gli1, et interagit avec la glycoprotéine Hip (Hedgehog interacting protein) proposée comme antagoniste des protéines Hedgehog. Des analyses biochimiques ont permis de montrer qu'en plus de la forme membranaire, une forme soluble de Hip existe, notamment dans le cerveau adulte, et inhibe la voie de signalisation Shh in vitro. Par ailleurs, une cartographie de Hip dans le cerveau de souris embryonnaire (E13.5) et adulte supporte l'hypothèse que Hip interviendrait dans la régulation négative de la voie Shh. Enfin l'expression de Hip dans des cellules exprimant l'enzyme de synthèse de l'oxide nitrique (NO) dans le cerveau mature suggère des interactions entre les voies de signalisation impliquant respectivement Hip et le neuromédiateur gazeux NO. Pour étudier le rôle de Shh in vivo sur les progéniteurs neuraux du cerveau mature, la protéine recombinante ShhN a été injectée par stéréotaxie dans le ventricule latéral (VL) de souris adultes. En plus d'une forte activation de la voie Shh, reflétée par l'augmentation de la transcription de Ptc et Gli1 dans plusieurs régions cérébrales, telles que la zone sous ventriculaire (ZSV), le striatum, le septum latéral, le corps calleux et le cortex cérébral, le nombre de cellules ayant incorporé le marqueur de prolifération Bromodésoxyuridine (BrdU), est augmenté d'un facteur 3-4 dans le corps calleux et le cortex cérébral des souris ayant reçu la protéine Shh en comparaison avec des souris contrôles. Une telle augmentation n'a pas été observée dans la ZSV, une aire de neurogenèse majeure chez l'adulte. Par ailleurs, deux jours après l'injection de ShhN, un nombre significativement plus important de cellules en prolifération exprimant le protéoglycan membranaire NG2, marqueur des précurseurs oligodendrocytaires, est observé dans le cortex cérébral des souris ayant reçu la protéine ShhN. Afin d'analyser l'effet à long terme de la surexpression continue de la protéine Shh, un vecteur adénoviral Ad5-hShh-ires-eGFP destiné à exprimer la forme humaine de la protéine Shh a été développé puis caractérisé in vitro. Ce vecteur a ensuite été délivré dans le VL de cerveau de souris adultes et quatre jours après, la protéine Shh a été détectée dans les régions épendymaire et subépendymaire. Vingt-six jours après l'injection du vecteur Ad5-hShh-ires-eGFP, la voie Shh est toujours active comme révélé par la présence de nombreuses cellules exprimant le transcrit Gli1 dans plusieurs aires cérébrales. Une augmentation de 50% du nombre de cellules BrdU+ exprimant le marqueur oligodendroglial dm20+ est détectée dans le cortex cérébral et le corps calleux des souris ayant reçu le vecteur adénoviral Ad5-hShh-ires-eGFP par rapport aux souris ayant reçu le vecteur contrôle Ad5-eGFP. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent la capacité de la voie Shh à stimuler les cellules oligodendrocytaires pré-matures dans plusieurs régions du cerveau de rongeurs adultes. La modulation de cette voie apparaît donc potentiellement intéressante pour le traitement des maladies affectant le lignage oligodendrocytaire.

Au cours de ma thèse, mes projets de recherche ont visé à mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules progénitrices dans la rétine du xénope à travers trois projets principaux. Le réseau de régulation qui contrôle la spécification des cellules progénitrices vers les sous-types neuronaux est à ce jour très peu connu. C'est dans ce contexte que j'ai étudié le rôle du facteur de transcription à domaine bHLH, Ascl1, dans la détermination des sous-types rétiniens au cours du développement. Par des approches in vivo de gain et perte de fonction d'Ascl1, des expériences d'épistasie et la recherche de ses cibles transcriptionnelles, j'ai pu mettre en évidence qu'Ascl1 (i) est impliqué dans la genèse des neurones GABAergiques rétiniens, (ii) qu'il est épistatique sur des facteurs glutamatergiques tels que Neurog2, NeuroD1 ou Atoh7, (iii) que son activité GABAergique est conférée par son domaine basique de liaison à l'ADN et (iv) que cette activité implique la régulation directe du facteur de transcription Ptf1a. Ces données ajoutent donc une nouvelle pièce au réseau transcriptionnel gouvernant la spécification des sous-types GABAergiques au cours du développement de la rétine. La mise en place correcte des types et sous-types cellulaires de la rétine nécessite une coordination avec le moment de sortie du cycle cellulaire des progéniteurs rétiniens. Dans ce contexte, j'ai contribué à l'avancée d'un projet visant à étudier le réseau de signalisation contrôlant la prolifération des précurseurs de la rétine. Par des approches in vivo, génétiques et pharmacologiques, cette étude a montré que les voies Wnt et Hedgehog s'antagonisent pour réguler l'activité proliférative des cellules souches et progénitrices rétiniennes. Nos données préliminaires suggèrent que ces voies agissent de façon opposée à la fois sur la sortie et sur la cinétique du cycle cellulaire. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle selon lequel ces voies Wnt et Hedgehog réguleraient la balance entre prolifération et différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Enfin, dans le but d'élargir nos connaissances sur les réseaux de signalisation et les réseaux transcriptionnels impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la détermination cellulaire dans la rétine, j'ai également contribué à la recherche de nouveaux marqueurs spécifiques des différentes populations cellulaires rétiniennes au travers d'un crible à grande échelle par hybridation in situ. De nombreux gènes spécifiquement exprimés dans les cellules souches ou les cellules progénitrices constituent des gènes candidats pour de futures approches fonctionnelles.

Le cerveau adulte des mammifères conserve sa capacité à générer de nouvelles cellules cérébrales à partir de cellules souches neurales (CSNs), principalement localisées dans deux régions cérébrales spécifiques, l'hippocampe et la zone sous-ventriculaire (SVZ). Ce processus, appelé neurogenèse, permet la formation de nouveaux neurones et de nouvelles cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes). Différents signaux contrôlent la prolifération et la différenciation des CSNs. Parmi ces signaux, les hormones thyroïdiennes (HTs) sont impliquées dans la prolifération des CSNs de la SVZ et dans la différenciation neuronale. À l’inverse des cellules différenciées, telles que les neurones ou les glies, les CSNs ont un fonctionnement – ou métabolisme – principalement basé sur la glycolyse et sur une faible respiration mitochondriale. Or l'évolution du métabolisme des CSNs peut influencer leur choix de destin cellulaire. Les HTs jouant un rôle important dans l'activation du métabolisme mitochondrial, j'ai testé l'hypothèse selon laquelle le choix du destin des CSNs de la SVZ adulte se ferait grâce à l'influence de la signalisation thyroïdienne sur l'activité mitochondriale. J'ai tout d'abord montré in vivo et in vitro que les HTs permettent la détermination des CSNs en précurseurs neuronaux dans la SVZ, tandis qu'une période d'hypothyroïdisme favorise la détermination gliale. La transthyrétine, protéine de liaison des HTs, est spécifiquement présente dans les cellules de la SVZ ayant un destin neuronal, alors que la désiodase de type 3, inactivatrice des HTs, est exprimée par les précurseurs oligodendrocytaires (OPCs), indiquant une activationdifférentielle de la signalisation thyroïdienne dans les deux lignages cellulaires. Par ailleurs j'ai pu observer que les cellules s'engageant vers un destin neuronal possèdent une plus grande activité mitochondriale que les OPCs. La présence d'HTs favorise de plus la respiration mitochondriale, ainsi que la production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) issus de l'activité des mitochondries, dans les cellules de la SVZ. Un blocage des protéines de la chaîne respiratoire empêche les HTs de promouvoir la détermination neuronale, montrant la nécessité de l'activation mitochondriale pour l'engagement des CSNs en précurseurs neuronaux. On sait d'autre part que les modifications morphologiques (ou dynamiques) mitochondriales sont nécessaires à l'augmentation de la respiration. La division (ou fission) des mitochondries est en particulier essentielle à une bonne répartition intracellulaire de la production de l'énergie issue de la respiration, ainsi qu'à la migration cellulaire. Dans les cellules de la SVZ, j'ai montré que l'action des HTs permet l'activation de la protéine DRP1, médiatrice de la fission mitochondriale, et ce principalement dans les cellules du lignage neuronal. Les HTs favorisent donc la détermination des CSNs de la SVZ vers un destin neuronal grâce à l'activation de la respiration et de la fission mitochondriales. / The adult mammalian brain maintains its capacity to generate new cells from neural stem cells (NSCs), mainly localized in two specific brain regions, the hippocampus and the sub-ventricular zone (SVZ). This process, named neurogenesis, results in the production of new neurons and new glial cells (astrocytes and oligodendrocytes). Several signals control NSCs proliferation and differentiation. Among those, thyroid hormones (THs) are involved in NSCs proliferation in the SVZ and in neuronal differentiation. NSC metabolism relies mainly on glycolysis associated with a low mitochondrial activity, whereas mature cells, like neurons and glia, preferentially use oxidative phosphorylation. Changes in NSC metabolism can impact cell fate. As THs play an important part in activating mitochondrial metabolism, I hypothesized that the influence of TH signaling on mitochondrial activity triggers NSC fate choice in the adult SVZ. First, I showed in vivo and in vitro that THs allow NSC determination in neuronal precursors, whereas a short hypothyroidism favors glial determination. Transthyretine, a TH binding protein, is specifically present in the SVZ cells having a neuronal fate, while type 3 deiodinase, a TH inhibitor, is expressed by oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These results indicate that THs signaling isdifferentially activated in neuronal and glial cell lineages. I observed that cells adopting a neuronal fate display a greater mitochondrial activity when compared to OPCs, and that TH signaling favors mitochondrial respiration and ROS production in the SVZ cells. Inhibiting the mitochondrial respiratory chain prevents TH-mediated promotion of neuronal determination, proving the need of mitochondrial activation for NSC commitment toward a neuronal phenotype. Besides, it is also known that modifications of mitochondrial morphology (or mitochondrial dynamics) are required for the respiration to increase. Among mitochondrial dynamics, fission is crucial for a good intracellular repartition of energy production, and for cell migration. In the SVZ cells, I showed that, DRP1, the main inducer of mitochondrial fission, is activated by THs mainly in cells adopting a neuronal fate. Thus, THs favor NSC fate choice toward a neuronal phenotype through the activation of mitochondrial metabolism and mitochondrial fission in the adult mouse SVZ.