La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l'évolution. Elle joue un rôle clé dans le développement, et elle est impliquée dans de nombreuses décisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Une dérégulation de la signalisation Notch est impliquée dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utérus, et les leucémies, comme la Leucémie Aiguë Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un récepteur transmembranaire activé par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogéniques ont été identifiées au niveau du récepteur Notch, de nombreux cancers modulés par Notch demeurent ligand-dépendants. Étonnamment, les mécanismes moléculaires régulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractérisés par rapport à ceux qui régissent le récepteur Notch lui-même. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur luciférase de Notch, nous avons effectué le premier crible d'ARNi pan-génomique visant spécifiquement à identifier des régulateurs des ligands de Notch dans la cellule émettrice du signal. Nous avons ainsi pu découvrir de nouvelles classes de régulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces régulateurs comprennent des inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, et des gènes divers à fonction inconnue, tels que Tmem128 « Transmembrane protein 128 », ou à fonction préalablement caractérisée tels que la co-chaperonne moléculaire Cdc37 « Cell division cycle 37 homolog ». Par la suite, nous avons développé des cribles secondaires fonctionnels où nous avons démontré l'importance de ces régulateurs pour des événements Notch-dépendants, comme la différenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pré-leucémiques isolées à partir d'un modèle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouvé que les régulateurs les plus forts du crible de survie sont également nécessaires pour l'activité d'auto-renouvellement des cellules souches pré-leucémiques. Finalement, nous avons entamé une caractérisation moléculaire préliminaire de deux régulateurs nouvellement identifiés; Tmem128 et Cdc37 afin d'étudier leur mécanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustré par le modèle LAL-T. La compréhension des détails moléculaires sous-jacents aux fonctions de ces régulateurs sera essentielle afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer. / The Notch signalling pathway is evolutionarily conserved. It plays a key role in development and it is involved in multiple cell fate decisions, in the maintenance of stem cells, and in the regulation of cell proliferation and differentiation. Misregulation of Notch signalling is implicated in various diseases and cancers including solid tumours, such as breast and cervical cancers, and leukemias, such as T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL). Notch is a transmembrane receptor activated by transmembrane ligands of the DSL family (Delta/Serrate/Lag-2). Whereas oncogenic mutations have been identified in the Notch receptor, many Notch-mediated cancers remain ligand-dependent. Strikingly, the molecular mechanisms that regulate ligand activation are still poorly characterized as compared to those regulating the Notch receptor itself. Using a co-culture assay with a luciferase Notch reporter, we performed the first genome-wide RNAi screen aiming specifically at identifying regulators of Notch ligands in the signal-sending cell. We thereby unraveled new classes of common regulators for both Delta-like1 and 4 ligands. These regulators include protease inhibitors, transcription factors and various genes of unknown function such as Tmem128 (Transmembrane protein 128), or of previously characterized function such as the molecular co-chaperone Cdc37 (Cell division cycle 37 homolog). We next developed functional secondary screens where we demonstrated that our hits are important for Notch-mediated events, such as normal T-cell differentiation, and survival of pre-leukemic stem cells (pre-LSCs) isolated from a mouse model of T-ALL. Moreover, we showed that top hits from the pre-LSC survival screen are also required for the self-renewal activity of pre-LSCs. Finally, we performed a preliminary molecular characterization of two newly identified regulators; Tmem128 and Cdc37 in order to investigate their mechanism of action on Delta-like ligands. Altogether, this study led to the identification of novel Notch pathway regulators that could serve as potential therapeutic targets in Notch cancers, as exemplified by the T-ALL model. Elucidating the finer details that underlie the molecular functions of these regulators will be critical to develop pharmacological inhibitors to counteract their action and impede Notch signalling in cancer.

La reconnaissance d'antigènes par le TCR active des protéines tyrosine kinases qui phosphorylent d'autres substrats intracellulaires dont LAT. Ceci engendre l'activation de molécules telles que PKCθ et CARMA-1. La mutation LatY136F associe des TCR "estropiés" dans le développement de cellules T effectrices générant des désordres lymphoprolifératifs. Nous avons essayé de comprendre les gènes aggravant ou empêchant cette lymphoprolifération en utilisant la mutagénèse ENU. Nous avons identifié une mutation appelée Basilic empêchant le déroulement de la pathologie LatY136F. Basilic est une mutation du gène Rltpr qui constitue une phénocopie de Cd28-/- sur fond sauvage et sur fond LatY136F. Rltpr est un une nouvelle protéine ayant de multiples domaines, qui appartient à la famille CARMIL et qui est exprimée dans les cellules T et B. L'objectif de ce travail était d'élucider les mécanismes au cours desquels CD28 et Rltpr coopèrent avec le TCR pour différencier des cellules T naïves en cellules T effectrices. Ce travail visait aussi à caractériser Rltpr, dont la structure/fonction et l'interactome sont encore inconnus. En utilisant des techniques de microscopie confocale, nous avons montré que la localisation et le recrutement de Rltpr et de RltprBas à la synapse immunologique sont tous deux CD28-dépendants. Les deux molécules colocalisent avec CD28 tout au long du processus d'activation. En outre, Rltpr est essentiel pour la translocation à la synapse de PKCθ et CARMA-1, qui sont induits lors de la co-stimulation par CD28. Ces résultats permettent une meilleure compréhension du fin réglage du système immunitaire adaptatif qui est mis en place lors de l'activation. / TCR recognition of antigens triggers the activation of protein tyrosine kinases that phosphorylate other intracellular substrates including LAT. LAT phosphorylation leads to the activation of PKCθ and CARMA-1. The point mutation LatY136F associates TCRs with crippled signaling abilities to the development of effector T cells generating lymphoproliferative disorders (LPDs). We tried to shed light on genes exacerbating or preventing the LatY136F LPD by using an ENU mutagenesis screening. We identified one point mutation called Basilic that prevents the unfolding of the LatY136F pathology. Basilic is a point mutation of the Rltpr gene and is a phenocopy of a Cd28-/- mutation both on a wild-type and on a LatY136F background. Rltpr is a newly-discovered, multidomain protein belonging to the CARMIL family that is expressed in T and B cells. The objective of the present work was to elucidate the mechanisms during which CD28 and Rltpr cooperate withthe TCR to differentiate naïve into effector T cells. I also aimed at characterizing the Rltpr molecule, whosestructure/function and interactome are still largely unknown. Using confocal microscopy in collaborationwith Takashi Saito's group and Christoph Wülfing we showed that the localization and the recruitment ofboth Rltpr and RltprBas at the immune synapse are CD28-dependent. The two molecules colocalize with CD28all along the activation process. Moreover, Rltpr is essential for the synapse translocation of PKCθ andCARMA-1, which are induced upon CD28 costimulation. Those results allow a better understanding of theadaptive immune system fine tuning upon activation.

L’anticorps monoclonal anti-CD20 (Rituximab) est largement utilisé dans le traitement des maladies auto-immunes. L’analyse de la rate des patients souffrant d’un purpura thrombopénique (PTI) ou d’une anémie hémolytique auto-immune traités par anti-CD20 a mis en évidence que la déplétion lymphocytaire B favorisait la différenciation des plasmocytes (PC) normaux en plasmocytes à longue durée de vie (PLDV) auto-réactifs, expliquant en partie l’absence de réponse à ce traitement. L’enjeu de ce projet a été de savoir si la déplétion lymphocytaire B induit l’émergence de PLDV spléniques et de comprendre les processus impliqués dans la survie plasmocytaire. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2xRosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les cellules B lors de leur passage dans un centre germinatif au cours d’une réponse immune après ingestion de tamoxifène, puis de les suivre in vivo. Les PC EYFP+ ont été générés suite à 2 immunisations avec des globules rouges de mouton. Après avoir sélectionné un set de gènes permettant d’établir les signatures plasmablastiques et plasmocytaires, nous avons comparé par RT-PCR multiplex sur cellules uniques le profil d’expression des PC EYFP+ de la rate de souris traitées ou non par anti-CD20. Nous avons ainsi caractérisé dans le contexte de déplétion B une population plasmocytaire dans la rate homogène et mature, proche des PLDV de la moelle osseuse. Ce profil était différent de celui retrouvé dans la rate des souris contrôles, plus hétérogène, comprenant une majorité de PC intermédiaires entre plasmablastes et PC matures. Nous avons observé le même processus de différenciation paradoxale plasmocytaire dans la rate sous anti-CD20 dans le modèle murin lupique NZB/W, signifiant probablement un mécanisme général, que ce soit en contexte auto-immun ou non, chez l’homme et chez la souris. Nous avons identifié le BAFF (B-cell activating factor) comme un facteur essentiel dans le processus de survie des PC de la rate dans le contexte de déplétion B. En effet, le taux de BAFF augmente dans le sérum et le tissu splénique après traitement par anti-CD20, la combinaison in vivo des traitements anti-CD20 et anti-BAFF induit une diminution drastique des PLDV de la rate, sans générer d’hypogammaglobulinémie IgG. Les granuleux Gr1+ et en particulier les neutrophiles Ly6G+ semblent être la principale source de production de BAFF dans le contexte de déplétion B. Nous avons observé un effet similaire de la combinaison anti-CD20 et anti-BAFF sur les PLDV de la rate dans le modèle lupique NZB/W. Enfin, les LT CD4+ sont un autre composant important de la niche splénique dans le contexte de déplétion B. En effet, le nombre de PC EYFP+ diminue significativement avec l’association anti-CD20 et anti-CD4. Ces résultats suggèrent donc que l’association du traitement anti-CD20 à un inhibiteur de facteur de survie plasmocytaire spécifique de la rate, en particulier BAFF, pourrait avoir un bénéfice clinique au cours des maladies auto-immunes en interférant sur le processus paradoxal de maturation des PC. Un essai clinique associant les traitements anti-CD20 et anti-BAFF au cours du PTI débutera prochainement. / Previous data suggested that the monoclonal anti-CD20 antibody induced paradoxically the settlement of autoreactive splenic long-lived plasma cells (LLPC) in the spleen of patients with auto-immune cytopenia, explaining the treatment failure. To investigate whether this process had a general relevance and decipher its mechanism, we used the AID-CreERT2-EYFP mouse model, which allows the irreversible expression of EYFP in B cells engaged in an immune response after tamoxifen regimen to follow plasma cells at different times after immunization. When analyzed by multiplex PCR at the single-cell level, while the splenic EYFP+B220-PC of untreated mice displayed an intermediate profile between short-lived and long-lived PC, the PC from anti-CD20 treated mice composed a more mature homogeneous population, similar to the long-lived bone marrow PC. The absolute number of splenic EYFP+B220-PC did not change significantly upon anti-CD20 treatment indicating that B-cell depletion promoted PC differentiation rather than a long-lived PC selection. BAFF (B-cell activating factor) and CD4+ T-cells played a major role in plasma cell survival since combination of anti-CD20 with anti-BAFF or anti-CD4 antibodies dramatically reduced the number of splenic EYFP+B220- LLPC. Anti-CD20 treatment also promoted the differentiation of LLPC in the spleen in the lupus prone NZB/W model, while a treatment combining anti-CD20 with anti-BAFF induced a marked reduction in total splenic PC numbers. These results suggest that the process of PC maturation upon anti-CD20 treatment is a general mechanism and that interfering with anti-BAFF antibody at the time of B-cell depletion might greatly improve the response rate in auto-immune disease.

Le développement d'un vaccin anti-paludique est limité par notre connaissance incomplète des effecteurs agissant contre P.falciparum. Nous avons mis en évidence que les cellules T Vγ9Vδ2 sont activées par la forme intra-érythrocytaire (schizonte) et par les phosphoantigènes de P.falciparum, et peuvent inhiber la croissance du parasite in vitro par un mécanisme dépendant de la granulysine ciblant la forme invasive du parasite (mérozoïte). Ces résultats suggérent que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 jouent un rôle dans le contrôle précoce de la charge parasitaire. Cependant, le mécanisme médiant l’interaction entre les schizontes, les mérozoïtes les cellules T Vγ9Vδ2 et reste élusif. L'objectif de cette thèse est d’étudier les interactions entre les stades sanguins de P. falciparum et les cellules T Vγ9Vδ2, afin de mieux comprendre leurs activités anti-parasitaires, dans le but à long terme d’une utilisation clinique. Dans ce travail, nous étudions l'importance du contact direct avec les parasites dans l’activation et les activités anti-parasitaires des cellules T Vγ9Vδ2, par des approches de microscopie confocale et de cytométrie en flux. Nous suggérons que les cellules T Vγ9Vδ2 forment peu ou pas de contacts avec les mérozoïtes, et très peu de contacts avec le schizonte. De plus, nous montrons que, contrairement à une lignée cellulaire tumorale cible (Daudi), le contact avec les schizontes n'affecte pas l'activation des cellules T Vγ9Vδ2, suggérant que les phosphoantigenes du parasite sont libérés dans le milieu. Nous démontrons que les phosphoantigènes produits par la voie DOXP sont probablement libérés par un processus actif, dépendant des new permeation pathways (NPP). Ensembles, ces résultats suggèrent que l'activation et l'activité antiparasitaire des cellules T Vγ9Vδ2 n’est pas dépendante du contact, mais est médié par des facteurs solubles. / The limited knowledge of immune effector against Plasmodium falciparum precludes the development of a malaria efficient vaccine. We have recently evidenced that Vγ9Vδ2 T cells act as a new immune effector early in malaria infection. These cells are activated by the mature intraerythrocytic form (schizont) and by parasite-derived antigens (phosphoantigens). After activation, they inhibit in vitro parasite growth by targeting the extraerythrocytic invasive form (merozoite), by a granulysin-dependent mechanism. However, the mechanism by which Vγ9Vδ2 T cells are activated by schizonts and target merozoites remains elusive. The aim of this PhD project is to describe the interactions between P.falciparum blood stages and γδ T cells, in order to better understand their anti-parasitic activities and in the long term goal to manipulate these cells to prevent malaria. In the work, we investigate the importance of cell to parasite contact in Vγ9Vδ2 T cell activation and anti-parasitic activity by time-lapse and fixed confocal imaging, and cytometry. We suggest that Vγ9Vδ2 T cells form little or no contacts with merozoites, and very few contacts with the mature intraerythrocytic (schizont) form of the parasite. Moreover, we show that cytotoxic activities are elicited by schizonts, but that contrary to a known tumor cell line (Daudi cells), contact has no effect on the level of activation, suggesting that parasite-derived phosphoantigens are secreted in the microenvironment. We pursue the characterization of the parasite-derived phosphoantigens and demonstrate that they are produced by the DOXP pathway. Lastly, we show that phosphoantigens are most likely released by an active process, dependent on the new permeation pathways. Altogether, these results shed light on an unconventional mode of activation by P.falciparum blood stages and antiparasitic activity of Vγ9Vδ2 T cells, which is not contact-dependent, but rather is mediated by soluble factors.

La toxine pertussique (PTX) est une exotoxine produite uniquement par Bordetella pertussis, un pathogène de la coqueluche. Les effets de la toxine au cours d'une infection bactérienne sont bien connus, et sont pour la plupart liés à son activité ADP-ribosyltransférase qui cible les GPCRs. Or, la PTX est un antigène majeur permettant d’établir une réponse immunitaire contre B. pertussis ce qui en fait donc un composant principal de tous les vaccins anti-coqueluche actuels. De nombreux travaux sur la PTX concernent ses mécanismes moléculaires et son rôle durant la phase d'infection. Mais, il y a un manque d'information sur le rôle immunogène de la PTX.En utilisant un modèle d'infection intranasale par B. pertussis, nous avons constaté que la génération de lymphocytes T CD4 mémoires résidant (Trm) dans les poumons dépendait de l'exposition à la PTX. La toxine pertussique est couramment utilisée pour inhiber la réponse aux chimiokines, dans l'étude de la migration des cellules T. Etant donné que la plupart des récepteurs aux chimiokines sont des GPCRs, la mobilité de nombreuses cellules immunitaires, y compris les cellules T, est facilement affectée par la PTX. La migration des cellules T est un phénomène sophistiqué régulé spatio-temporellement. Nos résultats démontrent que la PTX n’affecte pas les étapes de la migration dépendantes des intégrines lorsque les cellules T sont activées.Ce travail s’intéresse à l'impact de la PTX sur la biologie des cellules T en étudiant son rôle dans la réponse immunitaire adaptative in vivo, dans un modèle animal d'infection et son impact sur la migration des lymphocytes T in vitro. / Pertussis toxin (PTX) is an exotoxin uniquely produced from Bordetella pertussis, a human respiratory tract pathogen causing pertussis disease, also known as whooping cough. The toxin is well described its virulence effects during bacterial infection. Most of these effects are due to ADP-ribosyltransferase activity of the molecule that targets G-protein coupled receptors (GPCR). On the other hand, PTX is an important antigen that provides protection against pertussis disease and a major component of all current pertussis vaccines. There are numerous literatures on PTX about its molecular mechanisms and its role during infection phase. Instead, lack of information on how PTX contributes host’s adaptive immunity has incurred confusion in understanding the immunogenic role of PTX. With intranasal infection model of B. pertussis, we detected the generation of CD4 lung-resident memory T cells (Trm) were depending on PTX exposure. For T cell migration study, PTX is being used to inhibit chemokine response. Because most of chemokine receptors are GPCR, the motility of many immune cells including T cells is easily affected by PTX. T cell migration is a sophisticate phenomenon regulated space-temporally. The results demonstrated, once T cells become activated and effector, are less influenced than inactivated T cells.This thesis reports the impact of PTX on T cells in two parts; 1) Role of PTX in adaptive immune response by in vivo infection system and 2) Influence of PTX on T cell motility by in vitro assays.

L'hypertension artérielle (HTA) est l'une des pathologies les plus fréquentes et les plus préoccupantes des pays occidentaux. Elle est souvent associée au surpoids, à des maladies rénales, cardiaques et aussi à un dysfonctionnement du système endocrinien. Les désordres vasculaires compliquant l'HTA induite par le traitement par l'érythropoïétine recombinante (r-HuEPO) chez les patients ayant une maladie rénale chronique ou en lien avec une perturbation du système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA), associent une augmentation de la rigidité artérielle, une dysfonction endothéliale, un déséquilibre endothéline-1/monoxyde d'azote (ET-1/NO) et un état inflammatoire. L'inflammation vasculaire contribue à la physiopathologie de l'HTA par l'augmentation du stress oxydatif et l'activation des cellules immunitaires. Plusieurs études ont suggéré que le système immunitaire est impliqué dans le développement des maladies cardiovasculaires. Cependant le rôle des lymphocytes T régulatrices (Treg) dans l'HTA ou d'autres formes de maladies cardio-vasculaires, reste encore largement inconnu. Bien que la majorité des études ont montré que l'HTA induite par l'r-HuEPO est associée à une dysfunction endothéliale et à un déséquilibre du rapport (ET-1/NO), les mécanismes exacts restent à être identifier.Plusieurs études ont montré que l'exercice physique d'endurance prévient l'HTA chez les patients ou les modèles animaux. L'objectif de la première partie du travail est d'étudier l'impact du shear stress et de l'exercice sur les désordres vasculaires et l'HTA induits par l'r-HuEPO, en présence d'un déséquilibre endothélial (ET-1/NO). Pour ce faire, trois environnements ont été utilisés (in vitro (cellules en culture), in vitro (artères mésentériques (AM)) et in vivo (souris transgéniques sur-exprimant l'ET-1 au niveau de l'endothélium). Nos résultats montrent que l'association L-NAME/r-HuEPO est responsable d'une vasoconstriction flux-dépendante et une augmentation accrue du shear stress correspondant (plus de 25 dyn/cm2). Le Bosentan, inhibiteur non sélectif des récepteurs de l'ET-1, empêche la vasoconstriction flux-dépendante engendrée par la combinaison L-NAME/rHu-EPO, sans pour autant corriger la vasodilatation; Le traitement des souris transgéniques eET-1 avec l'r-HuEPO augmente la pression artérielle systolique, la concentration plasmatique en ET-1, le stress oxydatif, l'infiltration des monocytes et des macrophages aortiques (MOMA-2), le taux des cytokines pro-inflammatoire INF-γ, TNF-α et IL-6 et exacerbe la dysfonction endothéliale. L'exercice physique prévient tous les effets délétères engendrés par l'administration de l'r-HuEPO. Il est à noter aussi que l'exercice augmente le taux du Foxp3 dans la rate et le cortex rénal. Quant à la deuxième partie, il s'agissait de tester l'effet du transfert adoptif des Treg sur l'HTA et les désordres vasculaires induits par l'administration d'angiotensine II ou d'aldostérone à des souris. Nos résultats montrent que le transfert adoptif des Treg prévient l'HTA induite par l'Ang II, l'altération de la vasodilatation endothélium-dépendante, prévient l'augmentation de la rigidité des AM, diminue le stress oxydatif et les taux plasmatiques des cytokines proinflammatoires (INF-γ, TNF-α et IL-6), ainsi que l'infiltration aortique et rénale des macrophages. Le transfert adoptif des Treg prévient partiellement l'augmentation de la pression artérielle systolique induite par l'Aldo, prévient l'altération de la vasodilatation endothelium dépendante et le remodelage hypertrophique des AM, diminue le stress oxydatif et l'infiltration des cellules immunitaires inflammatoires. Le transfert adoptif des cellules T effectrices (Teff) exacerbe la majorité des effets de l'Aldo. Nos résultats justifient, d'une part, l'importance de l'exercice comme outil préventif de l'HTA induite par l'r-HuEPO, et d'autre part, présentent les Treg comme élément essential dans la modulation de l'HTA et des désordres cardiovasculaires.

Suite à la rencontre d’un antigène (Ag) présenté à la surface des cellules présentatrice de l’Ag (CPA), les lymphocytes T naïfs, ayant un récepteur des cellules T (RCT) spécifique de l’Ag, vont proliférer et se différencier en LT effecteurs (1). Suite à l’élimination de l’Ag la majorité des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se différencier en LT mémoire (LTm) protégeant l’organisme à long terme. Les mécanismes qui permettent la différenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont générés à partir des LTe, nous avons émis l’hypothèse que la densité de l’Ag présenté par les CPA peut avoir un impact sur la sélection des LT CD8+ répondant l’Ag à se différencier en LTm. De manière intéressante, nos résultats montrent qu’une immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide à sa surface permet le développement de LTm. À l’inverse, le développement des LTm est fortement réduit (10-20X) lorsque les souris sont immunisées avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide à leur surface. De plus, la quantité d’Ag n’a aucune influence ni sur l’expansion des LT CD8+ ni sur l’acquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manière critique la génération des LTm. Nos résultats suggèrent que le nombre de RCT engagé lors de la reconnaissance de l’Ag est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observé par vidéo-microscopie le temps d’interaction entre des LTn et des DCs. Nos résultats montrent que le temps et la qualité de l’interaction sont dépendants de la densité d’Ag présenté par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolongée avec les DCs quand le niveau d’Ag est faible. De plus, nous observons des variations de l’expression des facteurs de transcription clefs impliqués dans la différenciation des LTm tels qu’Eomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densité d’Ag fait varier l’expression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqué dans la conversion de Bcl-2 en molécule pro-apoptotique et contribue à la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modèle propose que la densité de l’épitope contrôle la génération des CD8+ LTm. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la génération des LTm permettra le développement de meilleures stratégies pour la génération de vaccin. Dans un second temps, nous avons évalué le rôle du signal RCT dans l’homéostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de souris transgénique pour le RCT dont son expression peut être modulée par un traitement à la tétracycline. Ce système nous a permis d’abolir l’expression du RCT à la surface des LTm. De manière intéressante, en absence de RCT exprimé, les LTm CD8+ peuvent survivre à long terme dans l’organisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacité de survivre sans RCT exprimé dans un hôte lymphopénique alors que l’autre sous population nécessite l’expression du RCT. / Following antigen (Ag) encounter presented at surface of antigen presenting cell (APC), naïve T lymphocytes, which express a T cell receptor (TCR) specific for Ag, undergo massive proliferation and differentiate into effector T cells (1). After elimination of the pathogen, most effector T cells die, while the remaining differenciates into memory T cells (LTm) which are responsible for long-term protection of the organism. The mechanism that promotes the differentiation of effectors T cells into memory T cells is still largely unknown. To understand how Tm cells are generated from effectors, we hypothesized that the density of antigen on the APC could have an impact on the selection of CD8+ T cell responders differentiating into memory. Very interestingly, our results show that immunization of mice with dendritic cells (DCs) expressing high levels of peptide-MHC complexes on their surface allow a strong development of LTm. In contrast, the development of memory T cells was strongly reduced (10-20X) when mice were immunized with DCs expressing two-fold less level of peptide-MHC complexes. In agreement with the results described above, the amount of Ag does not have any influence on T cell expansion and acquisition of effector functions, but critically affects memory T cell generation. Our data suggest that the numbers of TCR engaged in MHC/peptide recognition are important for the formation of memory T cells. To do that, we evaluated by time-lapse videomicroscopy the time of interaction between LTn and DCs. Effectively, we observed a significant reduction in the percentage of cells making prolonged interaction with DCs when the level of Ag is decreased. Moreover, we observed a modification in the expression of key transcription factors involved in the differentiation of Tm cells, such as Eomes, Bcl6 and Blimp-1. Further analysis reveals that the Ag density influences the expression of Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor1). Nor-1 is involved in the conversion of Bcl-2 into a pro-apoptotic molecule and contributes to effector death by apoptosis during contraction phase. Our model proposes that density of Ag controls the generation of LTm. A better understanding of the role of TCR signals in the generation of LTm will help to develop better vaccination strategies. Second time, we have evaluated the role of TCR signals in Tm cell homeostasis. To do that, we have used a tetracycline-inducible expression system of the TCR in mice. This system allows us to abolish TCR expression on Tm cells. Interestingly, we show that the ablation of TCR expression did not influence the survival and functionnality of Ag-specific CD8+ LTm cells. Furthermore, our results show that a subset of CD4 Tm cells can survive in the absence of TCR expression in nonlymphopenic hosts while another subset requires the TCR expression to survive.

Les travaux antérieurs du laboratoire ont démontré le rôle du CD47 dans la fonction des cellules dendritiques ainsi que dans l’induction des lymphocytes T régulateurs (Tregs) chez l’humain in vitro. Notre premier objectif était de déterminer le rôle de CD47 sur la fonction des DCs in vivo. Nos travaux démontrent que le CD47 contrôle sélectivement la migration des DCs au travers des vaisseaux lymphatiques et des barrières cellulaires endothéliales in vivo sans interférer avec celle des lymphocytes T et B. Des expériences de migration compétitive et d’ immunisation active avec des DCs myéloïdes démontrent que la migration des DCs est dépendante de l’expression du CD47 sur les DCs et non sur les cellules endothéliales. Ce défaut de migration est corrélé avec l’absence de DCs spléniques dans la zone marginale chez nos souris CD47-/-. Notre second objectif était de déterminer le rôle de CD47 dans l’homéostasie et la fonction des Tregs. Nous démontrons que l’expression du CD47 contrôle sélectivement l’homéostasie d’une sous-population de Tregs CD103+ à l’état de base. La proportion de cellules activées/mémoires (CD44hi CD62Llo ) Foxp3+ CD103+ augmente rapidement au cours du vieillissement chez nos souris CD47-/- comparée aux souris CD47+/+ du même âge, tandis que le pourcentage de cellules (CD44loCD62Lhi) Foxp3+ CD103- reste comparable entre les deux souches de souris. En conclusion, le CD47 inhibe la prolifération excessive des Tregs CD103+ empêchant ainsi l’accumulation de ces cellules en absence d’inflammation. Les DCs et les Tregs sont étroitement régulées de manière reciproque. Cette régulation croisée contribue au maintien d’un équilibre entre l’immunité protectrice et la tolérance. La perspective de nos travaux est d’approfondir nos connaissances sur le rôle du CD47 et de ses ligands dans la régulation des DCs par les Tregs et vice et versa. Les DCs et les Tregs étant impliqués dans la pathogenèse de multiples maladies telles que le cancer, les maladies infectieuses et les maladies auto-immunes. Par conséquent, nos études pourraient ouvrir des portes à de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Previous work in the laboratory have demonstrated the role of CD47 in the function of dendritic cells and in the induction of regulatory T cells in humans. Here, we show that the ubiquitous self-marker CD47 selectively regulates DC, but not T and B cell trafficking across lymphatic vessels and endothelial barriers in vivo. Competitive DC migration assays and active immunization with myeloid DCs demonstrate that CD47 expression is required on DCs but not on the endothelium and not vice and versa for efficient DC trafficking and T-cell responses. This migratory defect correlates with the quasi-disappearance of splenic marginal zone DCs in non manipulated CD47-deficient mice. Our data reveal that CD47 on DCs is a critical factor in controlling migration and efficient initiation of the immune response. Mutual or reciprocal regulation exists between DCs and Tregs. For instance, DCs efficiently induce Tregs in vivo. We here examine how CD47 deficiency that selectively decrease myeloid DCs impact on Treg homeostasis. We here show that CD47 expression, selectively regulated CD103+Foxp3+ Treg homeostasis. The proportion of effector/memory-like (CD44highCD62Llow) CD103+ Foxp3+ Tregs rapidly augmented with age in CD47-deficient mice (CD47-/-) as compared with age-matched control littermates. Yet, the percentage of quiescent (CD44lowCD62Lhigh) CD103-Foxp3+ Tregs remained stable. Thus, sustained CD47 expression throughout life is critical to avoid an excessive expansion of CD103+ Tregs that may overwhelmingly inhibit Ag specific T cell responses. DCs and Tregs are closely regulated to maintain the balance between protective immunity and tolerance. When that balance is broken, several diseases such as cancer, infectious diseases and autoimmune diseases may develop. Our ultimate goal is to understand how CD47 regulates DCs and Tregs function. Manipulation of the two cells types may open to the door to unexplored therapeutic avenues.

La réaction du greffon contre l’hôte (GvH) est responsable d’un grand taux de morbidité et de mortalité chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogéniques. Dans ce contexte, les cellules T régulatrices sont largement étudiées et semblent avoir un grand potentiel d’utilisation dans le domaine de la thérapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T régulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCRαβ+ « Doubles-Négatifs » (DN), qui ne représentent que 1-3% des lymphocytes T, ont été décrits. Ces cellules ont des propriétés inhibitrices de la réponse immunitaire qui s’avèrent spécifiques aux antigènes auxquels elles ont préalablement été exposées. La répression de la réponse immunitaire par les cellules T DN régulatrices semble être un mécanisme important impliqué dans l’induction de la tolérance aux allo-antigènes. De plus, ces cellules confèrent une tolérance immunitaire dans des modèles de greffes allogéniques et xénogéniques. En effet, ces cellules ont la capacité d’inhiber la réaction contre un allo-antigène auquel elles ont été exposées, sans inhiber la réaction contre un allo-antigène inconnu. Les cellules T DN ont été isolées et caractérisées chez l’homme où elles ont la capacité d’interagir avec des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacité immunomodulatrice reste inconnue chez l’humain. Notre objectif consistait donc principalement à étudier le rôle et le mécanisme d’action des cellules T DN régulatrices humaines in vitro, en étudiant leur capacité à inhiber une réaction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montré que les cellules T DN stimulées par un allo-antigène donné inhibent des cellules syngéniques effectrices dirigées contre ce même alloantigène mais n’inhibent pas des cellules syngéniques effectrices dirigées contre un autre alloantigène, démontrant ainsi la spécificité aux antigènes de ces cellules. De plus, les T DN non stimulées par un allo-antigène n’ont pas de rôle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous n’observons pas de modulation de l’expression des marqueurs d’activation et d’induction de l’apoptose. Afin d’étudier le mécanisme d’action des cellules T DN, nous avons mesuré l’expression intracellulaire de la granzyme B. Les résultats démontrent que les cellules T DN stimulées expriment un niveau significativement plus élevé de granzyme B que les cellules T DN non-stimulées par l’allo-antigène. Ceci suggère que l’immunosuppression induite par les cellules T DN stimulées pourrait passer par la voie granzyme B. Le mécanisme utilisé par ces cellules reste à être confirmé par nos futures expériences. / Graft-versus-Host Disease (GvHD) is a major cause of morbidity and mortality in patients receiving an allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT). Many regulatory T cell populations have been studied and shown to have immunosuppressive properties in GvHD. Among these populations, Double Negative CD4-CD8-TCRαβ+ regulatory T cells (DN T) have been described. These cells represent 1-3% of all T cell lymphocytes and are known to have antigen-specific inhibitory functions of the immune response. The suppression of an immune response by DN T cells seems to be an important mechanism involved in the induction of tolerance to allo-antigens. Moreover, these cells also confer immune tolerance in models of allogeneic and xenogenic grafts. DN T cells have the ability to suppress syngeneic T CD4+ and T CD8+ cells in an antigen-specific manner. Therefore, these DN T cells can inhibit the reaction caused by syngeneic effector cells against a specific alloantigen to which they have been previously exposed. However, they cannot inhibit a reaction directed against an unknown alloantigen. Human DN T cells have been isolated and characterized as cells that have the capacity to interact with APCs by cell-to-cell contact, just like in mice. However, their immunomodulatory properties are still unknown in humans. The goal of our project was to study the role and immunomodulatory functions of human DN T cells in Mixed Lymphocyte Reactions (MLR). The MLRs have allowed us to demonstrate that DN T cells, after having been stimulated by an allo-antigen, have an antigen-specific inhibitory function towards the syngeneic effector cells reacting against the same alloantigen that they have been exposed to. Interestingly, they do not inhibit the reaction of these effector cells against an unknown alloantigen. However, stimulated DN T cells did not modulate the expression of the activation markers expressed by the effector cells and did not give a death signal to these cells either. Moreover, we also wanted to study how DN T cells have an immunosuppressive activity. Therefore, we compared the expression of Granzyme B in stimulated versus non-stimulated cells. Our results suggest that DN T cells may use the Granzyme B pathway to immunosuppress the effector cells. In conclusion, our results demonstrate that DN T cells have an antigen-specific inhibitory function. The mechanism used by these DN T cells remains to be confirmed with our future experiments.

Les cellules T mémoires (Tm) protègent l’organisme contre les réinfections de pathogènes qu’il a déjà combattu. Les Tm possèdent plusieurs propriétés en commun avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment la capacité de se différencier, de s’auto-renouveler et de maintenir une population relativement constante au sein de l’organisme via des mécanismes homéostatiques. Il a été démontré que Hoxb4, un membre de la famille des facteurs de transcription Hox, était capable d’induire l’expansion des CSH in vivo et in vitro de façon rapide. Au vu de ces parallèles, nous avons posé l’hypothèse que la surexpression de Hoxb4 pourrait induire l’expansion de populations de Tm. Nous avons analysé les populations de Tm et lymphocytes T naïfs (Tn) dans les organes lymphoïdes de souris transgéniques surexprimant Hoxb4 et les avons comparées à des souris de type sauvage (wt). Alors que la fréquence des cellules T matures Hoxb4 diminuait avec l’âge, leur phénotype ainsi que leur viabilité demeuraient inchangés. Ensuite, nous avons procédé à des transplantations en compétition de Tm (CD4+CD44hi) Hoxb4 et wt chez des hôtes dépourvus de lymphocytes T (CD3-/-) dans le but d’évaluer leur contribution à la reconstitution du compartiment T après 2 mois. Au final, les Tm wt avait contribué un peu plus que les Tm Hoxb4 à la reconstitution (~60%). Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont montré que les Tm Hoxb4 possédaient une fonctionnalité normale, mais se distinguaient des Tm wt par la présence d’une faible population qui présentait un phénotype « mémoire central » (Tcm), conférant habituellement une longévité accrue. Les cellules des ganglions lymphatiques totaux des hôtes furent transplantées de façon sérielle chez trois générations de nouveaux hôtes. Le phénotype Tcm observés chez les Tm Hoxb4 était récapitulé chez les hôtes secondaires uniquement. Les ratios sont demeurés en faveur des Tm wt lors des deux transplantations suivantes, mais les Tm Hoxb4 ont commencé à montrer un avantage compétitif chez certains hôtes quaternaires. Une transplantation en compétition à court terme de Tm Hoxb4 et wt marqués avec un marqueur cytoplasmique ont démontré la présence chez les Tm Hoxb4 seulement d’une faible population CD62Lhi proliférant lentement. Ainsi, l’expansion préférentielle de Tcm CD4 par le biais d’une sélection ou d’une différenciation induite par la surexpression de Hoxb4 pourrait potentiellement leur permettre de maintenir un état de quiescence leur permettant de persister plus longtemps suite à des transplantations sérielles. / Memory T cells (Tm) protect the organism against reinfection from pathogens they’ve already encountered. Tm share characteristics with hematopoietic stem cells (HSC), such as the capacity to differentiate, self-renew and maintain a relatively constant population via homeostatic mechanisms. Hoxb4, a member of the Hox genes family of transcription factors, has been shown to expand HSCs rapidly in vivo and in vitro. Thus, drawing from these parallels we hypothesise that Hoxb4 overexpression could lead to expansion of Tm populations. Tm and naïve T cell (Tn) populations were analysed in the lymphoid organs of young and aged transgenic mice overexpressing Hoxb4 in comparison with wild type (wt) mice. While the frequencies of mature Hoxb4 T cells in lymphoid organs seemed to decline with age, the phenotype or the cell viability remained unaffected. Next, CD4+CD44hi Hoxb4 Tm were transferred into T cell deficient (CD3-/-) hosts in competition with wt CD4+CD44hi Tm and evaluated for their contribution to T cell reconstitution after 2 months. Engraftment of wt Tm in secondary lymphoid organs was slightly higher than Hoxb4 Tm (~60%). Functional assays and phenotypic analysis showed that Hoxb4 Tm exhibited normal functionality, but in contrast to wt Tm, a fraction of Hoxb4 Tm exhibited a more central memory (Tcm) phenotype, indicative of a longer lifespan. Total lymph nodes from hosts were serially re-transplanted for three generations. The Tcm phenotype of the Hoxb4 Tm present in the primary hosts was recapitulated in the secondary but not in the tertiary hosts. The ratios remained in favor of the wt Tm after two subsequent expansion rounds, but Hoxb4 Tm showed a competitive advantage over wt Tm in some quaternary hosts. Cell tracking of a short term transplantation of Hoxb4 and wt Tm in competition exposed a small population of CD62Lhi cells displaying slow proliferation in the Hoxb4 Tm only. Thus preferential CD4+ Tcm expansion by selection or differentiation could potentially allow Hoxb4 Tm to persist longer following serial transplantations due to a more quiescent state.