CD2 is a transmembrane molecule and a “non-canonical” member of the signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family of receptors that is expressed on T cells and NK cells. Its ligands, mouse CD48 and human CD58, are widely expressed on hematopoietic cells including antigen-presenting cells (APCs) and T cells. Previous studies indicated that CD2 promotes T-cell receptor (TCR) signaling when it is engaged by its ligands displayed on APCs. However, the supporting experimental data were rather controversial, and there is no general agreement about the role of CD2 in T cell activation. To study the function of CD2 and its ligands in T cells, we examined T cell functions in newly generated mouse strains lacking CD2 or CD48 in the C57BL/6 background. Compared to wild-type (WT) mice, T cells from CD2-deficient (“knock-out”; KO) mice had severe activation defects. Surprisingly, expression of CD48 on T cells, not on APCs, was also necessary for optimal T cell responses. We found evidence of CD2 interacted with CD48 in cis on T cells and observed their co-localization by confocal microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET). The only exception was CD2-dependent cytotoxicity, which required CD48 both on T cells and on APCs. Mechanistic studies using mass spectrometry and structure-function analyses revealed that the cis interactions between CD2 and CD48 on T cells boosted TCR signaling, an effect that correlated with the capacity of CD2 to recruit the kinase Lck. Similarly, our further study revealed that the cis interactions between CD2 and CD58 on human T cells were also necessary for maximal TCR signaling and T cell activation. Taken together, our studies provide clear evidence that cis interactions between CD2 and its ligands on T cells are important in TCR signaling and T cell activation. Modulation of these cis interactions can be a promising approach to suppress or enhance T cell activation in a therapeutic setting. / CD2 est une molécule transmembranaire et un membre “ non-canonique ” de la famille de la famille SLAM (« signaling lymphocyte activation molecule ») exprimée à la surface des lymphocytes T et des cellules NK (« natural killer »). Les ligands de CD2, CD48 chez la souris et CD58 chez l’humain, sont exprimés de manière ubiquitaire sur les cellules hématopoïétiques, y compris sur les cellules présentatrices d’antigène (CPA) et lymphocytes T. Des études antérieures ont indiqué que CD2 est impliqué dans la signalisation des récepteurs TCR (« T-cell receptor ») en réponse à son engagement par CD48 sur le CPA; cependant, les données expérimentales qui supportent ce modèle sont plutôt contradictoires et aucun accord n’a été trouvé sur les rôle de CD2 dans l’activation de lymphocytes T. Pour étudier la fonction de CD2 et ses ligands, nous avons examiné les fonctions des lymphocytes T chez des souches de souris dépourvues de CD2 ou CD48 nouvellement générées à partir du “fond génétique” C57BL/6. Par rapport aux souris de type sauvage (WT; « wild-type »), les lymphocytes T de souris CD2-déficientes (« knock-out »; KO) présentent des sévères défauts d’activation. Il est intéressant de noter que l’expression de CD48 sur les lymphocytes T, mais non sur les CPA, était aussi nécessaire pour les réponses des lymphocytes T. Nous avons également démontré que CD2 interagit en cis avec CD48 sur les cellules T et avons observé leur co-localisation par microscopie confocale et FRET (« fluorescence resonance energy transfer) ». La seule exception était la cytotoxicité CD2- dépendante, qui nécessitait l’expression de CD48 à la fois sur les lymphocytes T et sur les CPA. L’étude des mécanismes par la spectrométrie de masse et les analyses structurefonction ont démontré que les interactions en cis entre CD2 et CD48 permettent de stimuler la signalisation du TCR, ce qui corrèle avec la capacité de CD2 à recruter la kinase Lck. De manière similaire, notre étude plus approfondie a démontré que les interactions en cis entre CD2 et CD58 sur les lymphocytes T humains sont nécessaires pour la signalisation maximale du TCR et l’activation cellulaire T. L’ensemble de nos études ont mis en évidence que les interactions en cis entre CD2 et ses ligands sur les lymphocytes T jouent un rôle important dans la signalisation du TCR et l’activation de ces cellules. La modulation de ces interaction en cis pourrait être une approche potentielle pour augmenter ou interférer avec l’activation des lymphocytes T dans un contexte thérapeutique.

La maladie cœliaque est une entéropathie inflammatoire chronique se développant chez des individus génétiquement prédisposés par l’expression des haplotypes HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 et survenant suite à la consommation de gluten. Elle se caractérise par le développement d’une atrophie des villosités de la muqueuse intestinale débouchant sur un syndrome de malabsorption alimentaire. La seule thérapie actuelle est le suivi d’une diète sans gluten mais cette éviction totale du gluten n’est pas toujours efficace et est lourde en concessions. Il est par conséquent urgent de développer des thérapies alternatives mais ce domaine constitue un pipeline évoluant lentement, notamment suite à l’absence d’un modèle animal pertinent et complet sur le plan physiologique. L’objectif de cette thèse doctorale est de répondre à ce besoin crucial en développant un modèle murin capable de récapituler les caractéristiques de la maladie. Le chapitre 1 dresse le portrait de la maladie en quatre parties amenant progressivement le lecteur dans les détails de sa pathogenèse. Cette introduction débute par un rappel sur la physiologie et l’immunité intestinale puis elle définit la face clinique de la maladie. Ensuite, le lecteur évolue dans une partie plus détaillée de la pathogenèse aidant au discernement de ses acteurs cellulaires et moléculaires. Finalement, elle se termine par une revue de la littérature sur les actuels modèles animaux. Le chapitre 2 brossent les objectifs de la thèse sur base de données clés de la littérature, notamment, les patients présentent au minimum une copie de l’halplotype HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 et plus des deux-tiers sur-expriment la cytokine pro-inflammatoire interleukine-15 au niveau de leur muqueuse intestinale. Il est donc raisonnable de penser qu’ensemble, le gluten, l’haplotype HLA et l’interleukine-15 contribuent activement à la pathogenèse. Bien que soupçonnés, leurs rôles et interactions nécessitent l’apport de preuves tangibles in vivo. Le chapitre 3 détaille ainsi ces interactions démontrées à l’aide du développement de notre nouveau modèle murin. Ce dernier est caractérisé par la surexpression de l’interleukine-15 dans l’épithélium et dans la lamina propria intestinale et par l’expression de l’haplotype HLA-DQ8. Ce travail démontre que l’exposition de cette souris au gluten s’accompagne d’une atrophie villositaire et de la signature complète de la maladie, tant sur le plan sérologique, cellulaire que transcriptionnel. Nous démontrons que la surexpression simultanée de l’interleukine-15 dans les deux compartiments de la muqueuse intestinale que sont la lamina propria et l’épithélium est une condition sine qua non au développement de l’atrophie. Aussi, cette étude permet de mettre en lumière la nécessité des cellules T CD4+ et de l’interféron-gamma dans l’activation des lymphocytes intraépithéliaux et le développement de l’atrophie. Finalement, cette recherche établit le rôle central joué par l’haplotype HLA-DQ8 et par l’enzyme transglutaminase II tissulaire dans la survenue de ces lésions. De manière générale, les résultats issus de ce modèle et présentés au chapitre 3 reflètent toute la complexité des interactions entre le gluten, la génétique et l’IL-15 dans le développement de la maladie cœliaque. Enfin, le chapitre 4 apporte une conclusion à ce travail et le chapitre 5 discute des futures directions envisagées pour ce modèle préclinique. Ce dernier va sans doute contribuer à une meilleure compréhension de la maladie cœliaque et permettre l’identification de potentielles cibles thérapeutiques. / Coeliac disease is a chronic inflammatory enteropathy characterized by autoimmune features. This disease occurs in genetically predisposed individuals expressing HLA-DQ2 or HLA-DQ8 haplotypes and is triggered following gluten consumption. The disease is characterized by the development of intestinal villous atrophy leading to malabsorption. The only current therapy is the adherence to a gluten-free diet, but the diet is not always effective and is heavy in concessions. Therefore, the development of alternative therapies is urgent but is a slowly evolving pipeline, mainly due to the absence of a physiologically relevant animal model. The aim of this thesis is to answer this unmet need by developing an animal model capable of recapitulating the main characteristics of the disease. Chapter 1 depicts a portrait of the disease in four points, gradually leading the reader into the details of its pathogenesis. This introduction begins with a review of the physiology and intestinal immunity and then draws a clinical portrait of the disease. Third, the reader evolves in a more detailed part of the pathogenesis helping him to discern its cellular and molecular actors. Finally, the introduction ends with a review of the literature on current animal models. Chapter 2 outlines the thesis objectives based on key data from the literature, in particular, patients present at least one copy of the HLA-DQ2 or HLA-DQ8 haplotype and more than two-thirds over-express the proinflammatory cytokine interleukin-15 at the level of their intestinal mucosa. It is therefore reasonable to hypothesize that gluten, HLA haplotype and interleukin-15 together contribute to the pathogenesis. Although suspected, their roles and interactions still require the provision of tangible evidence in vivo. Chapter 3 details these interactions based on the proposed new mouse model. This model is characterized by the overexpression of interleukin-15 in the intestinal epithelium and lamina propria and by the expression of the HLA-DQ8 haplotype. This work demonstrates that the exposure of this mouse to gluten is accompanied by villous atrophy and the complete serological, cellular and transcriptional signature of the disease. We also demonstrate that simultaneous overexpression of interleukin-15 in both mucosal compartments is a prerequisite for the development of atrophy. This study also highlights the need for CD4+ T cells and interferon-gamma in the activation of intraepithelial lymphocytes and the development of villous atrophy. Finally, this research establishes the central role played by the HLA-DQ8 haplotype and the enzyme tissue transglutaminase II in the occurrence of these lesions. In general, the results from this model presented in Chapter 3 reflects the complexity of the interactions between gluten, genetics and IL-15 in the development of coeliac disease. Finally, chapter 4 concludes this work and chapter 5 discusses future directions for this powerful preclinical model that will undoubtedly contribute to a better understanding of coeliac disease and will allow the identification of new potential therapeutic targets.

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Mémoire en cotutelle avec le Dr. Daniel Kaufmann et le Dr. Nicolas Chomont / Dans les dernières années, il a été montré que les provirus intacts et défectueux du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) codent pour des protéines virales qui contribuent à l’activation chronique des lymphocytes T spécifiques au VIH, et ce même sous traitement antirétroviral (ART). Nous avons développé deux méthodes pour étudier, d’un côté, l’intégrité et la clonalité de séquences provirales (virologie), et de l’autre, les réponses T spécifiques au VIH (immunologie). Tout d’abord, nous avons développé une bibliothèque R nommée « IntegrityAlgorithm », automatisant une séquence d’analyse utilisée précédemment pour déduire l’intégrité et la clonalité de séquences quasi-pleine longueur (NFL) de provirus. Chaque séquence provirale est analysée pour la présence, dans cet ordre, d’inversions, d’hypermutations, de grandes délétions internes, de codons stops, de défauts dans la région Ψ et de défauts dans les cadres de lectures ouverts (ORFs). Les provirus dépourvus de ces défauts sont identifiés comme « intacts ». Nous montrons que la hiérarchisation des défauts sous-estime certains défauts, comme les codons stops et les défauts dans le Ψ. L’algorithme produit des résultats en accord avec les données publiées et présente plusieurs avantages par rapport à d’autres algorithmes de prédiction. Nous avons aussi multiplexé l’essai de marqueurs induits par l’activation (AIM), couramment utilisé pour la détection de cellules T spécifiques à un antigène, en mesurant simultanément la co-expression de quatre AIMs (CD69, 4-1BB, OX40 et CD40L) plutôt que deux. En utilisant une stratégie de gating booléen ET/OU, l’approche augmente la fréquence de détection des cellules T CD4+ spécifiques à un antigène en comparaison aux paires d’AIMs standards. La détection des cellules T CD8+ était plutôt dominée par la paire d’AIMs CD69+4-1BB+. Le multiplexage réduit les biais dans la qualification et la quantification des cellules T spécifiques à un antigène, tel qu’il a été montré avec des analyses de phénotypage et des comparaisons intra- et inter-cohorte. Nous avons ensuite modifié la stratégie de gating booléen ET/OU pour une stratégie de gating en « L », nous permettant de trier des cellules vivantes T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH et au cytomégalovirus (CMV). En considérant l’étroite relation qu’entretiennent les provirus du VIH et le système immunitaire, améliorer nos méthodes pour la caractérisation à la fois des provirus, mais aussi des réponses T spécifiques au VIH, demeure essentielle pour une meilleure compréhension de la persistance des réservoirs et pour élaborer des stratégies de vaccination et d’éradication du virus. / In the past years, intact and defective human immunodeficiency virus (HIV) proviruses have been shown to code for viral proteins that contribute to sustaining chronic HIV-specific T cell responses, even under antiretroviral therapy (ART). We have developed two methods to study, on one side, the intactness and clonality of proviral sequences (virology), and on the other, the HIV-specific T cell responses (immunology). We developed an R package named “IntegrityAlgorithm” that automates a previous analysis pipeline used to infer intactness and clonality of near full-length proviral sequences (NFL). Each proviral sequence undergoes analysis to identify, in this order, the presence of inversions, hypermutations, large internal deletions, stop codons, Ψ defects, and defects in the open reading frames (ORFs). Proviruses exhibiting none of these defects are inferred as “intact.” We show that the hierarchization of defects underestimate some defects, such as stop codons or Ψ defects. The algorithm produces consistent results with the data published and presents several advantages over other prediction algorithms. We also multiplexed the activation-induced marker (AIM) assay, commonly used to detect antigen (Ag)-specific T cells, by simultaneously measuring the co-expression of four AIMs (CD69, 4-1BB, OX40, and CD40L) instead of two. When combined in an AND/OR Boolean gating strategy, the approach increases the frequency of Ag-specific CD4+ T cells detected in comparison to single AIM pairs. CD8+ T cell detection is rather dominated by the AIM pair CD69+4-1BB+. Multiplexing reduces biases in the qualification and quantification of Ag-specific T cells, as shown with phenotyping analyses and intra- and inter-cohort comparisons. We then modified the Boolean AND/OR gating strategy to an “L gating” strategy for the purpose of sorting live Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells. Considering the interdependent relationship between HIV proviruses and the immune system, improving our methods to characterize both the intactness of proviruses and the HIV-specific T cell responses will remain essential for a better understanding of the reservoirs persistence and to elaborate vaccine and viral eradication strategies.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) altère les fonctions du système immunitaire pour promouvoir sa persistance. Les composantes de l’immunité ciblées par le VIH-1 incluent les lymphocytes Th17 et les cellules dendritiques dérivées des monocytes (CDDMs). Deux sous-populations de lymphocytes Th17, nommées Th17 et Th1Th17, ont précédemment été décrites avec des propriétés transcriptionnelles et des spécificités antigéniques distinctes. Les cellules Th17 et Th1Th17 sont hautement permissives à l’infection par le VIH et leur fréquence est diminuée chez les sujets chroniquement infectés sous trithérapie antirétrovirale. Toutefois, seulement une fraction des lymphocytes Th17 est infectée par le VIH, indiquant l’existence de Th17 résistants à la réplication virale. Également, il est connu que l’infection à VIH induit une altération de la fréquence des monocytes reflétée par l’expansion de la population monocytaire exprimant le récepteur Fcγ de type III/CD16. Les monocytes sont des précurseurs de cellules dendritiques et une altération de ratio entre les monocytes CD16+ et CD16- pourrait avoir des conséquences délétères sur la qualité des réponses immunitaires. Le rôle fonctionnel des CDDM exprimant ou non CD16 dans le contexte de la pathogénèse à VIH-1 demeure inconnu. Ce projet de thèse est divisé en 2 parties: 1) l’étude de l’hétérogénéité des cellules Th17 et 2) la caractérisation approfondie des CDDM CD16+ et CD16- dans le contexte d’homéostasie et de la pathogénèse de l’infection à VIH. Dans la première partie, nous avons fonctionnellement caractérisé deux nouvelles sous-populations de lymphocytes Th17 avec une expression différentielle des récepteurs de chimiokines CXCR3 et CCR4 : nommés CCR6+DN et CCR6+DP, exprimant toutes les deux CCR6, marqueur de lymphocytes Th17. Nous avons démontré que les cellules CCR6+DN et CCR6+DP partagent des caractéristiques biologiques communes avec les cellules Th17 et Th1Th17 incluant la permissivité au VIH. Nos résultats indiquent que les cellules CCR6+DN représentent un stade précoce de différentiation des lymphocytes Th17 et expriment des marqueurs de cellules T folliculaires. De plus, comparativement aux sous-populations Th17, Th1Th17 et CCR6+DP, la fréquence et le compte des CCR6+DN sont préservés au sein des sujets chroniquement infectés sous thérapie antirétrovirale. Nous proposons un modèle dans lequel les cellules CCR6+DN représentent des lymphocytes Th17 résistantes à l’effet cytopatique du virus qui contribuent à la persistance virale par leur capacité de porter un virus compétent en matière de réplication. Dans la deuxième partie, nos résultats révèlent que les CDDMs CD16+ et CD16- représentent deux populations uniques avec des propriétés transcriptionelles et fonctionnelles distinctes. Les CDDMs CD16- détiennent un potentiel immunogène supérieur tandis que les CDDMs CD16+ ont une meilleure capacité de transmettre le virus aux cellules T CD4+ au repos. Également, nous confirmons l’effet néfaste du VIH sur les fonctions immunologiques des cellules DC à stimuler la prolifération et la polarisation des cellules Th17 spécifiques à C. albicans et à S. aureus. En conclusion, les résultats inclus dans cette thèse fournissent une compréhension détaillée sur l’hétérogénéité présente au sein des lymphocytes Th17 et des CDDMs et révèlent de nouveaux déterminants moléculaires de l’immunité exploités par le VIH au profit de sa persistance. / The ultimate aim of immunity is to restrict the emergence of exogenous pathogens while providing immune tolerance to self-antigens. The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) disrupts the functions of the immune system to promote its own dissemination and persistence. The components of the host immunity targeted by HIV-1 include the Th17 lineage and the monocytes. The Th17 lineage was previously reported to include two different populations referred to as the Th17 and Th1Th17 cells exhibiting different transcriptional profiles and antigenic specificities. Both Th17 and Th1Th17 cells are permissive to HIV and their frequency is reduced in the blood and gut mucosa of chronically HIV-infected subjects. Nevertheless, HIV-1 infects only a fraction of the Th17 pool, suggesting the existence of Th17 cells resistant to HIV. In addition, it well documented that HIV-1 infection alters the pool of peripheral blood monocytes and induces the expansion of a monocytic population expressing the Fcγ receptor III/CD16. Monocytes are precursors for dendritic cells (DCs) and an altered CD16+/CD16- monocyte ratio may have deleterious consequences on the quality of immune responses. The functional features of CD16+ versus CD16- monocyte-derived DCs (MDDCs) in the context of HIV infection remain to be elucidated. This thesis is divided in two parts: 1) the study of Th17 cell heterogeneity and 2) the in depth characterization of CD16+ and CD16- monocytes-derived DCs (MDDCs) at homeostasis and during HIV-1 infection. In the first part, we have identified and functionally characterized two new previously uncharacterized subsets of CCR6+ T-cells with differential expression of CXCR3 and CCR4, double negative CCR4-CXCR3- (CCR6+DN) and double positive CCR4+CXCR3+ (CCR6+DP) subsets. We demonstrated CCR6+DN and CCR6+DP share cytokine production, antigenic specificity, lineage plasticity and HIV permissiveness with the previously characterized Th17 (CCR6+CCR4+CXCR3-) and Th1Th17 (CCR6+CCR4-CXCR3+) subsets. Among these four Th17 subsets, CCR6+DN cells were found to represent an early stage of Th17 differentiation and expressed features of T follicular helper T-cells. Moreover, in contrast to Th17, Th1Th17 and CCR6+DP subsets, the frequency and counts of CCR6+DN cells was preserved in chronically HIV-infected subjects under antiretroviral treatments compared to uninfected controls. Our results suggest that CCR6+DN represent long-lived Th17 cells contributing to HIV persistence by carrying replication-competent virus. In the second part, our results reveal that CD16+ and CD16- MDDCs represent two distinct populations with unique transcriptional programs and immunological functions. CD16- MDDCs displayed a superior immunogenic potential, whereas CD16+ MDDCs exhibited a higher capacity to induce HIV replication in resting CD4+ T-cells. Also, we confirmed the negative effect of HIV on DCs immunogenic function involving the stimulation of T-cell proliferation and Th17 polarization in response to pathogens such as C. albicans and S. aureus. Overall, in this thesis we provide a better understanding on Th17 and MDDC heterogeneity and reveal new molecular determinants of pathogenicity in immune cells that are exploited by HIV-1 to insure its persistence in the infected host.

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1. / HIV-1 infection leads to a progressive CD4+ T cell depletion and T cell dysfunction, which in the absence of successful anti-retroviral therapy, results in individuals progressing to AIDS. Some of the underlying mechanisms for this T cell dysfunction have been elucidated and reveal an important role for the inhibitory receptor program death-1 (PD-1) in T cell exhaustion during chronic HIV-1 infection. Indeed, PD-1 up regulation correlates with increased viral load as well as decreased cytokine production and proliferative capacity of HIV-1 specific T cells. Moreover, blocking in vitro the interaction of PD-1 with its counter-receptor PD-L1 using antibodies restores HIV-1 specific T cell effector functions. Interestingly, our group and others have shown that levels of PD-1 during chronic HIV-1 infection are not only up regulated on virus-specific T cells but also on the total pool of CD4+ and CD8+ T cells. However, little is known about the impact of PD-1 expression on the turnover and maturation status of the PD-1 expressing cells during the course of the disease. Of note, PD-1 expression has never been investigated in acute HIV-1 infection. In this thesis, we clearly show that, in both acutely and chronically HIV-1 infected individuals, PD-1 is up regulated on all T cell subsets, including naïve T cells. We also uncovered an abnormal distribution of T cell subsets toward a more differentiated phenotype at all stages of the disease. In this thesis, we discuss the possible role of PD-1 in the homeostasis breakdown observed in HIV-1 infected individuals. More interestingly, if we focus on the transition from the acute to the chronic phase of the infection, we found that PD-1 is expressed at much lower levels on total CD8+ T cell subsets from acutely infected individuals than chronically infected individuals. These augmented PD-1 expression levels on CD8+ T cell in chronic infection are associated with reduced levels of in vivo cell proliferation - as monitored by Ki67 expression - suggesting that PD-1 expression may be partially responsible for the loss of CD8+ T cell function. In addition, naïve T cells accumulate in frequency during the transition from the acute to the chronic phase of the infection. Considering that naïve T cells already express high levels of PD-1, we hypothesize that priming of T cell might be impaired in chronically infected individuals. Altogether, we propose a model where high PD-1 expression is associated with (1) impaired CD8+ T cell function in chronic HIV-1 infection and suggest that lower levels of PD-1 may partially preserve the CD8+ T cell function and (2) impaired priming of T cells contributing to the progressive immunodeficiency in HIV-1 infection but also limiting the effectiveness of vaccine strategies by preventing any new responses to be triggered. To better understand immune responses in infection such as HIV-1 disease, we next developed multimeric reagents for the detection of CD4+ T cells, namely tetramers of HLA-DR molecules. These reagents aim at increasing the overall avidity of peptide-MHC class II complexes to detect low affinity TCRs. In this thesis, we describe a versatile and efficient method to produce different soluble HLA-DR molecules covalently linked to antigenic peptides. Gaining further insights into mechanisms underlying T cell exhaustion and disease progression, in addition to the development of state-of-the-art immune monitoring tools, will be crucial in better understanding of the interplay between the virus and the host immune system, leading to rational strategies in the fight against the AIDS epidemic.

L'interleukine-15 (IL-15) contribue au développement et à l’activation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclérose en plaques. Des niveaux élevés de l'IL-15 ont été trouvés chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux témoins, mais aucune étude n'a examiné les effets de tels niveaux élevés sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre étude étaient 1- de caractériser l’expression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de déterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- d’évaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modèles murins de la sclérose en plaques. Nous avons établi que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite à une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont été significativement augmentées lors des co-cultures avec des cellules B alloréactives exprimant l'IL-15. Dans les modèles murins de la sclérose en plaques, nous avons détecté au sein du système nerveux central des cellules immunes exprimant l’IL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le récepteur pour cette cytokine à différents stades de la maladie. Nous avons démontré que les cellules B modulent des réponses des lymphocytes T CD8 via l’IL-15, ce qui suggère un rôle pour les cellules B dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Nous avons aussi mis en évidence la présence de cellules exprimant l’IL-15 dans le système nerveux central dans des modèles murins de cette maladie. / Interleukin-15 is a cytokine involved in the homeostatic proliferation and maintenance of CD8 T cells. Activated CD8 T cells are implicated in several autoimmune diseases, including Multiple Sclerosis (MS). Elevated levels of IL-15 have been reported in serum and on peripheral leukocytes of MS patients relative to controls, yet no study has addressed the effects of elevated IL-15 levels on CD8 T cells. To study the in vivo effects of any molecule, the animal model for MS, EAE, is used; the expression of IL-15 during the EAE disease course has not yet been elucidated. Thus the goals of our study were to characterize surface IL-15 expression on human B lymphocytes and determine the effects on human CD8 T cell functions; and to assess the in vivo expression of IL-15 in MS mouse models. We found that B cells are capable of up-regulating the expression of surface IL-15 upon CD40 stimulation, and CD8 T cell effector functions were significantly enhanced upon co-culture with alloreactive IL-15-expressing B cells. In the MS mouse models we used, we found IL-15-expressing immune cells present within the central nervous system (CNS) at various points of disease, and that CNS-infiltrating CD8 T cells were potentially responsive to IL-15. Here, we not only demonstrate the modulation of CD8 T cell responses by IL-15 presented by B cells, implying a role for B cells in MS pathogenesis, but also show the presence of IL-15-expressing cells within the inflamed CNS of EAE.

Le Streptocoque de groupe B (GBS) est un important agent d’infection invasive pouvant mener à la mort et demeure la cause principale de septicémie néonatale à ce jour. Neuf sérotypes ont été officiellement décrits basés sur la composition de la capsule polysaccharidique (CPS). Parmi ces sérotypes, le type III est considéré le plus virulent et fréquemment associé aux maladies invasives graves, telle que la méningite. Malgré que plusieurs recherches aient été effectuées au niveau des interactions entre GBS type III et les cellules du système immunitaire innées, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire adaptative dirigée contre ce dernier. Notamment, le rôle de cellules T CD4+ dans l’immuno-pathogenèse de l’infection causée par GBS n’a jamais été étudié. Dans cet étude, trois différents modèles murins d’infection ont été développé pour évaluer l’activation et la modulation des cellules T CD4+ répondantes au GBS de type III : ex vivo, in vivo, et in vitro. Les résultats d’infections ex vivo démontrent que les splénocytes totaux répondent à l’infection en produisant des cytokines de type-1 pro-inflammatoires. Une forte production d’IL-10 accompagne cette cascade inflammatoire, probablement dans l’effort de l’hôte de maintenir l’homéostasie. Les résultats démontrent aussi que les cellules T sont activement recrutées par les cellules répondantes du système inné en produisant des facteurs chimiotactiques, tels que CXCL9, CXCL10, et CCL3. Plus spécifiquement, les résultats obtenus à partir des cellules isolées T CD4+ provenant des infections ex vivo ou in vivo démontrent que ces cellules participent à la production d’IFN-γ et de TNF-α ainsi que d’IL-2, suggérant un profil d’activation Th1. Les cellules isolées T CD4+ n’étaient pas des contributeurs majeurs d’IL-10. Ceci indique que cette cytokine immuno-régulatrice est principalement produite par les cellules de l’immunité innée de la rate de souris infectées. Le profil Th1 des cellules T CD4+ a été confirmé en utilisant un modèle in vitro. Nos résultats démontrent aussi que la CPS de GBS a une role immuno-modulateur dans le développement de la réponse Th1. En résumé, cette étude adresse pour la première fois, la contribution des cellules T CD4+ dans la production d’IFN-γ lors d’une infection à GBS et donc, dans le développement d’une réponse de type Th1. Ces résultats renforcent d’avantage le rôle central de cette cytokine pour un control efficace des infections causées par ce pathogène. / Group B Streptococcus (GBS) is an important agent of life-threatening invasive infections and remains the leading cause of neonatal sepsis to this day. Nine serotypes have been officially described based on capsular polysaccharide (CPS) composition. Among them, capsular type III is considered one of the most virulent and frequently associated with severe invasive diseases, such as meningitis. Although extensive research has been done on the interactions between GBS type III and various cells of the innate immune system, no information is available on the regulation of the adaptive immune response against this pathogen. In particular, the role of CD4+ T cells in the immuno-pathogenesis of the infection caused by GBS has never been assessed. In this study, three different models of murine infection were developed to evaluate activation and modulation of responding CD4+ T cells against GBS type III: ex vivo, in vivo, and in vitro. Ex vivo analysis of total splenocytes showed that GBS induces the release of type-1 pro-inflammatory cytokines. A strong IL-10 production follows this inflammatory cascade, indicating the host effort to maintain homeostasis. Results also indicate that T cells were actively recruited by responding innate immune cells via the release of chemotactic factors such as CXCL9, CXCL10, and CCL3. More specifically, results obtained from isolated CD4+ T cells from ex vivo or in vivo infections showed that they actively participate in the production of IFN-γ and TNF-α, as well as IL-2, suggesting a Th1 profile of activation. On the other hand, isolated CD4+ T cells were not main sources of IL-10. This observation suggests that this immuno-regulatory cytokine is produced mainly by cells of the spleen innate immune system of infected animals. The CD4+ Th1 cell profile was confirmed using an in vitro model of infection. Our results also suggest that the GBS CPS plays an immuno-modulatory role in the development of a Th1 response. In summary, this study addresses for this first time the contribution of CD4+ T cells in IFN-γ production during GBS infection, and thus, in the development of a Th1 response. Our data further highlight the central role of this cytokine for effective control of GBS infections.

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun. / Immune tolerance is dependent on the immune system discriminating between self and non-self. A break in immune tolerance results in autoimmunity, which can lead to the destruction of healthy organs, glands, joints or the central nervous system. Any disease that results from such an aberrant immune response is termed an autoimmune disease. Autoimmune diabetes, which is also referred to as juvenile diabetes and type 1 diabetes, results from an autoimmune attack on the insulin-producing β cells located within the islets of Langerhans of the pancreas. Although autoimmune diabetes is treatable through a combination of insulin therapy, diet and exercise, many chronic complications may arise in patients, including, but not limited to, blindness, cardiovascular disease, kidney failure and amputation. Due to the many complications associated with long-term autoimmune diabetes, research continues to better understand all the factors implicated in disease progression in order to develop new therapies that will prevent, reverse and/or cure this disease. A prominent role in the generation and maintenance of immune tolerance has been attributed to the number and function of regulatory cell subsets. One of these regulatory cell populations, namely CD4-CD8- (double negative, DN) T cells, have been studied in both mice and humans for their contribution to peripheral tolerance, disease prevention and their potential for use in cellular therapy. DN T cells are of particular therapeutic interest because they exhibit an antigen-specific immunoregulatory potential in various experimental settings, including the prevention of autoimmune diabetes. Indeed, using a transgenic system, we have shown that autoimmune diabetes-prone mice carry fewer DN T cells and that this phenotype contributes to autoimmune diabetes susceptibility, where a single transfer of DN T cells is sufficient to prevent diabetes progression in otherwise autoimmune diabetes-prone mice. These results suggest that DN T cells may be of therapeutic interest for diabetic patients. However, we must first validate these results using a non-transgenic setting, which is more physiologically relevant to humans. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells as well as the therapeutic potential of these cells in the prevention of autoimmune diabetes in the non-transgenic setting. Here, we show that diabetes-resistant mice present with a higher proportion and cell number of DN T cells than diabetes-susceptible mice in the non-transgenic setting, which associates a deficiency in DN T cell number with disease susceptibility. We determine that DN T cells eliminate activated B cells in vitro via a perforin/granzyme-dependent pathway, where the function of DN T cells is equal between the diabetes-resistant and -susceptible mice, demonstrating that the association to autoimmune diabetes is due to a deficiency in DN T cell number rather than function. Interestingly, we show that non-transgenic DN T cells eliminate B cells loaded with islet antigen, but not B cells loaded with an irrelevant antigen, in vitro. Importantly, we establish that the transfer of activated DN T cells could prevent autoimmune diabetes development in the non-transgenic setting. Interestingly, we reveal that DN T cells migrate to the pancreatic islets and undergo preferential activation and proliferation within the pancreatic lymph nodes. Moreover, the transfer of DN T cells results in a decrease in both germinal center B cells directly within the pancreatic islets as well serum insulin autoantibody levels, which correlates with the aforementioned findings. Altogether, the results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the function of DN T cells both in vitro and in vivo as well as demonstrate the therapeutic potential for DN T cells as a novel cellular therapeutic for autoimmune diabetes.

Le transfert de gènes dans les cellules souches hématopoïétiques par des vecteurs lentiviraux s’inscrit dans les protocoles actuels de traitement par thérapie génique de plusieurs maladies monogéniques (B-thalassémie, Adrénoleucodystrophie, SCID…). De même, le transfert de gènes dans les lymphocytes T et B ouvre des perspectives tant au niveau de la thérapie génique que pour l’immunothérapie. Nous avons mis au point des vecteurs lentiviraux pseudotypés par des glycoprotéines chimérique (BaEV/TR) et mutante (BaEVRLess) du rétrovirus endogène de babouin. Nous avons montré que ces nouveaux vecteurs peuvent transduire de manière plus efficace les cellules souches hématopoïétiques stimulées et quiescentes que les vecteurs pseudotypés par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). Il en est de même pour les vecteurs développés récemment et pseudotypés par les Glycoprotéines H et F du virus de la rougeole. Nous avons aussi comparé la capacité de ces derniers vecteurs à ceux pseudotypés par les glycoprotéines BaEV/TR et BaEVRLess dans le transfert de gènes dans les lymphocytes B et T ainsi que dans l’ensemble des cellules de la lignée T. Nous sommes désormais en mesure de proposer des vecteurs adaptés au transfert de gènes à chaque étape de la différenciation des cellules CD34+ en thymocytes ainsi qu’en lymphocytes T matures. Ceci pourrait permettre de proposer de nouveaux protocoles cliniques en thérapie génique avec une co-transplantation de cellules souches génétiquement modifiées et de cellules T différenciées à partir de ces cellules. Ceci permettrait notamment de réduire les phases d’aplasie actuellement nécessaires pour la greffe de cellules souches. / Lentiviral vectors and their ability to transfer gene into hematopoietic stem cells are currently evaluated for the cure of several single-gene diseases (eg : B-thalassemia, Adrenoleucodystrophy, SCID). Likewise, gene transfer into B and T lymphocytes is of major interest in gene therapy and immunotherapy. We engineered new lentiviral vectors pseudotyped by some chimeric (BaEV/TR) and mutant (BaEVRLess) glycoproteins from the baboon endogenous retrovirus. We demonstrated that these new vectors can transduce more efficiently resting and mild stimulated hematopoietic stem cells than obtained with lentivectors pseudotyped by the glycoprotein G from the vesicular stomatitis virus (VSV-G). It is the same with the recently developed lentiviral vectors pseudotyped by the H and F glycoprotein from measles virus (H/F-LVs). We also compared the ability of the H/F-LVs with the BaEV/TR and BaEVRLess lentiviral vector pseudotype to transfer genes into B and T lymphocytes and into the whole T lineage. From now on, we are able to propose adapted vectors for gene transfer at each stage of differentiation from CD34+ cells to thymocytes and mature T cells. This could allow us to propose some new clinical protocols in gene therapy with a co-transplantation of genetically modified stem cells and their differentiated T progenitors in order to reduce the aplasia stage induced by current transplantation protocols.