Le développement embryonnaire est un processus complexe finement régulé spatio-temporellement par de nombreux acteurs, qu’ils soient ADN, ARN ou protéines. De récents résultats suggèrent un rôle clef dans le développement et les maladies pour une sous-catégorie des ARNs impliqués dans ces mécanismes, les longs ARNs non-codants (lncRNAs). Caractérisés par leur incapacité à produire des protéines, ils sont difficiles à étudier par leur manque de conservation en séquence et leur expression tissu-spécifique. Ici, nous étudions un lncRNA conservé, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), nécessaire au maintien de l’état pluripotent des cellules souches et essentiel à leur différenciation en neurones. Toutefois, les mécanismes dans lesquels cet ARN est impliqué restent inconnus. Pour y répondre, nous avons analysé des données de séquençage d’ARN de différenciation neuronale d’ESCs murines. Nous avons identifié deux nouvelles isoformes spécifiquement exprimées dans les ESCs, sht.Tuna et alt.Tuna. Cette dernière est le résultat de l’épissage alternatif de l’exon 1 de Tuna. Cet épissage alternatif est également observé chez l’humain, démontrant une conservation du traitement de l’ARN entre la souris et l’Homme. Ces deux isoformes sont plus courtes d’environ 1,5kb à l’extrémité 3’ que le transcrit prédit de Tuna (full.Tuna). En effet, l’isoforme full. Tuna n’a pas pu être détectée dans les ESCs, et la surexpression de sht.Tuna a permis d’améliorer la reprogrammation vers l’état pluripotent. Ceci suggère que le rôle de Tuna est mécanistiquement différent dans les ESCs et les neurones. D’autre part, Tuna présente une région hautement conservée (~200bp) contenant un potentiel cadre de lecture pour un peptide de 48 acides aminés, détectable par surexpression de constructions tagguées FLAG. La mutation du codon AUG de cette séquence codante a abrogé l’effet de l’ARN sur la reprogrammation. Ceci implique un rôle du peptide dans l’acquisition de la pluripotence. Par ailleurs, Tuna a été détecté dans les fractions poly-ribosomales et cytoplasmiques d’ARN, supportant son éventuel potentiel codant. Ensemble, ces résultats démontrent que l’épissage alternatif et le potentiel codant d’un locus propre à un lncRNA est complexe et que cet ARN pourrait avoir de multiples fonctions dépendantes de l’état cellulaire / Embryonic development is a complex process finely regulated in time and place by numerous actors such as DNA, RNA, and proteins. Emerging evidence suggests a key role in development and disease for a subcategory of RNAs implicated in those mechanisms, the long non-coding RNAs (lncRNAs). Characterized by their incapacity to produce proteins, they have proven to be challenging to study due to the lack of sequence conservation and their tissue-specific expression. Here, we focus on a conserved lncRNA, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), that is required for maintaining embryonic stem cells (ESCs) in an undifferentiated state but is also essential for their differentiation towards a neuronal cell fate. However, the mechanism behind this dual role remains largely unknown. To address this, we analyzed available RNA-seq data on mouse ESC differentiation towards neurons. We identified two novel isoforms specifically expressed in ESCs, sht.Tuna and alt.Tuna. The latter isoform was the result of alternative splicing of the exon 1 of Tuna. This alternative splicing was also observed in human ESCs demonstrating a conserved processing of the RNA between mouse and human cells. Both new isoforms were ~1.5kb shorter at the 3'-end than the predicted full transcript of Tuna (full.Tuna). In fact, we failed to detect the full.Tuna isoform in ESCs, and overexpression of sht.Tuna isoform enhanced reprogramming to a pluripotent stem cell state. This suggests that the role of Tuna is mechanistically different in ESCs than in neurons. Besides, Tuna also contains a highly conserved region (~200bp) harboring a predicted 48-amino-acids coding sequence that is detectable upon overexpression if FLAG-tagged. Mutating the start codon of this peptide's coding sequence abrogated the enhanced reprogramming effect. This infers a role for the peptide in the acquisition of a pluripotent state. Moreover, Tuna was detected in poly-ribosomal and cytoplasmic RNA fractions further supporting a peptide coding potential. Taken together, our results demonstrate that alternative splicing and coding potential of a particular lncRNA locus is complex and that a lncRNA may have multiple functionality depending on cell state.

Les cellules souches neurales (CSNs) persistent dans la zone sous ventriculaire dans le cerveau adulte. Elles transitent d’un état quiescent à un état prolifératif afin de produire de nouveaux neurones. Les mécanismes régulant cette transition restent cependant méconnus. Les CSNs adultes étant enrichies en gènes calciques, nous avons déterminé si la transition d’un état quiescent vers un état de prolifération était calcium-dépendant. Pour ce faire, nous avons utilisé des mini-endoscopes miniatures pour observer la division cellulaire et sa régulation par la signalisation calcique chez la souris en mouvement libre. Nos données révèlent différents dynamiques calciques et niveaux intracellulaires calciques lors de la division des CSNs. Les expériences pharmacologiques et la technique d’édition génomique CRISPR-Cas9 montrent que les réserves intracellulaires calciques IP3-dépendant et les régulateurs à la protéine G régulent la transition d’un état quiescent vers l’état prolifératif. Nous avons aussi utilisé une approche optogénétique in vivo afin de mimer la dynamique calcique des CSNsquies centes pour maintenir les CSNs dans un état de quiescence et bloquer son activation vers un stade prolifératif. Nos résultats démontrent que les dynamiques calciques et le niveau intracellulaire calcique jouent un rôle important dans l’activation des CSNs. Ensuite, nous avons investigué le microenvironnement des CSNs notamment les vaisseaux sanguins et leur rôle dans la physiologie des CSNs. Les CSNs étendent un long prolongement basal et contactent les vaisseaux sanguins. Le contact direct et la libération de facteurs par les cellules endothéliales influencent le comportement des CSNs. Ici, nous avons utilisé des souris transgéniques pour altérer la communication entre les vaisseaux sanguins et les CSNs. Comme la signalisation Notch joue un rôle clé dans la signalisation des vaisseaux sanguins, nous avons inhibé in vivo la signalisation Notch spécifiquement dans les cellules endothéliales. Nous avons trouvé que l’inhibition de la signalisation Notch dans les cellules endothéliales à des stades précoces (P0) ou à des stades tardifs (P30) augmentait le nombre de CSNs. L’analyse morphologique des vaisseaux sanguins révèle aucune altération quand Notch est inhibé à des stades tardifs (P30). Ces résultats montrent que l’inhibition de la signalisation Notch maintient lesCSNs dans un état de quiescence. / Neural stem cells (NSCs) persist in the subventricular zone of adult brain and transit from the quiescent to the proliferative states to produce new neurons. The mechanisms regulating the transition froma quiescent to a proliferative state remain unclear. Since adult NSCs are enriched in genes associated with Ca2+ signalling pathways, we aimed to determine whether the transition from quiescence to aproliferative state is Ca2+ dependent. Here, we used miniature endoscopes (mini-endoscopes) to monitor NSC division and their regulation by Ca2+ signalling in freely behaving mice. Our data revealeddifferent Ca2+ dynamics and steady-state Ca2+ intracellular levels during NSC division. Pharmacological and in vivo CRISPR-Cas9 gene editing showed that IP3-sensitive intracellular stores and G-proteins regulators regulate the transition from quiescence to proliferation. We further used in vivo optogenetics to mimic Ca2+ dynamics of quiescence state to maintain NSCs in this state and prevent NSCsto transit into proliferative state. Our results demonstrate that Ca2+ dynamics and Ca2+ intracellularlevels play an important role in NSC activation. Next, we investigated NSCs microenvironmentmainly blood vessel and their role in their physiology. The NSCs contact the blood vessels by extending their basal processes. Direct cell-cell contact and the release of factors such as VEGF (vascularendothelial growth factor) by endothelial cells (EC) influence the NSC behaviour. As Notch pathwayis a key player in vasculature signalling, we inhibit in vivo the Notch signalling specifically in EC.We found that inhibition of Notch signalling in EC at early stage (P0) or later stage (P30) increasesNSC number. Morphological analysis of blood vessel reveals no alteration when Notch signalling isinhibited at later stages (P30). These finding showed that inhibition of Notch signalling in EC maintains NSC in quiescence state.

Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans les phénomènes de résistance aux traitements et de récidives dans les cancers du sein. Les neurotrophines comprennent le NGF et le BDNF, synthétisés sous forme de pro-neurotrophines. Elles se lient au récepteur commun p75NTR et à TrkA ou TrkB, fixant préférentiellement une (pro)neurotrophine. Récemment, le laboratoire Inserm U908 a démontré que le NGF/proNGF sont capables d’enrichir plusieurs lignées épithéliales cancéreuses de sein en CSC. L’objectif de ma thèse était de comprendre le rôle des neurotrophines dans la régulation des CSC de sein chez l’homme et dans le modèle canin. Nous avons montré que le BDNF/proBDNF peuvent également enrichir des lignées cancéreuses de sein en CSC in vitro. De plus, l’enrichissement en CSC induit par le NGF implique p75NTR et TrkA tandis que les effets du proNGF impliquent également EphA2.Sur 96 tumeurs mammaires canines issues de la biobanque d’OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), nous avons montré par immunohistochimie que le phénotype CD44+/CD24- seul n’est pas adapté pour détecter les CSC. CD24 est associé à des paramètres clinicopathologiques défavorables. Le proNGF, TrkA, et le BDNF sont exprimés dans une majorité des tumeurs, mais ne sont pas associés avec des paramètres clinicopathologiques. P75NTR et TrkB sont associés à des paramètres clinicopathologiques favorables et à une meilleure survie globale. De plus, p75NTR semble être un marqueur de cellules myoépithéliales. Ces résultats sont en accord avec les données obtenues dans le cancer du sein, soulignant la pertinence du modèle canin dans le développement de nouvelles thérapies ciblées. / Cancer stem cells (CSC) are implied in resistance to treatment and recurrences in breast cancer. Neurotrophins include NGF and BDNF, synthetized as proneurotrophins. They bind to common receptor p75NTR and to TrkA or TrkB, which bind specifically one (pro)neurotrophin. Recently, INSERM U908 demonstrated that NGF/proNGF are able to enrich several breast cancer cell lines in CSC. The objective of my PhD was to better understand the role of neurotrophins in the regulation of breast cancer stem cells both in human breast cancer and in the canine model.We showed that BDNF/proBDNF could also enrich the pool of CSC in several breast cancer cell lines in vitro. Furthermore, the action of NGF on the enrichment of CSC pool is mediated by p75NTR and TrkA, while the effects of proNGF also depend on EphA2. On 96 paraffin-embedded canine mammary tumors samples coming from the biobank of OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), we showed by immunohistochemistry that the phenotype CD44+/CD24- alone is not suitable to detect CSC. CD24 is associated with poor clinicopathological parameters. ProNGF, TrkA and BDNF are expressed in a majority of tumors, but are not associated with clinicopathological parameters. Positive correlation between P75NTR and TrkB expression and favorable clinicopathological parameters as well as better overall survival has been observed. Moreover, p75NTR seems to be a marker of myoepithelial cells. These results are consistent with the results obtained in human breast cancer, which underlines the relevance of the canine model in the development of new targeted therapies.

Sur le plan neuropathologique, les glioblastomes sont des lésions complexes, composées de cellules tumorales pléomorphes et migrantes, de vaisseaux anormaux en prolifération, de macrophages associés aux tumeurs et de plages de nécrose. Plus récemment, la démonstration de lexistence de cellules de glioblastome présentant des propriétés de cellules souches permit de relier ces éléments ensemble en suggérant pour la première fois une vision globale de la tumeur et de son interaction parfois fine avec son microenvironnement (Singh et al., 2004), puisque ces cellules sont même capables dadopter un destin endothélial et vasculaire (Bautch, 2010). Lexistence de ces cellules-initiatrices de gliome suggèrent en effet une hiérarchie cellulaire générant une organisation complexe et adaptative de la tumeur. Les mécanismes moléculaires à la base de lapparition, de la croissance et de la résistance thérapeutique de ces cancers ne sont cependant pas encore clairs et la compréhension de leur biologie reste donc une priorité. Dans ce travail, nous sommes partis de lhypothèse originale que les CIGs pourraient avoir des relations privilégiées avec les zones neurogéniques dans un cerveau adulte. Cest la raison pour laquelle nous avons réalisé une injection striatale droite de 50.000 cellules de glioblastome humain dans le cerveau de souris immunodéficientes adultes. Une fraction limitée des cellules injectées envahit spécifiquement les ZSVs de lhôte. Nous navons par contre jamais observé une migration vers le GD, lautre région neurogénique du cerveau adulte. Tout comme les progéniteurs neuronaux de la ZSV migrent le long du RMS vers le BO, ces cellules tumorales peuvent gagner le BO via la même route. De plus, ces cellules localisées dans la ZSV répondent aux principaux critères didentification dune CIG. Il semble donc y avoir une attirance particulière de la ZSV vis-à-vis de CIGs localisées à distance. Etant donné cette activité migratoire spécifique, nous avons tenté de caractériser le rôle éventuel de lOPN dans des cellules souches de gliome. Dans les cellules cancéreuses en général, lOPN est impliquée dans lactivité migratoire, lenvahissement tissulaire et la propagation des métastases. En collaboration avec le laboratoire de Vincent Castronovo, nous avons pu montrer que linhibition de lexpression de lOPN dans des cellules U87MG en culture maintenait lexpression des ARNm codant pour Sox2, Oct3/4 et Nanog à leur niveau de base et empêchait la formation de sphères en présence dun milieu de culture constitué de DMEM F12/B27 suppléé de EGF et bFGF. Ces premiers résultats obtenus in vitro suggérant un rôle de lOPN dans l'acquisition dun phénotype «souche» ont été confirmés par une étude in vivo, puisque la xénogreffe de cellules U87MG déficientes pour lOPN conduit à la perte de leur capacité à initier une tumeur. Enfin, toujours dans ce contexte de répartition de rôles pour différentes cellules au sein de la tumeur (hiérarchie), nous avons également étudié certains aspects des rapports existant entre les cellules tumorales. En collaboration avec le laboratoire de Pierre Robe, nous avons ainsi pu suggérer un rôle de «suppresseur de tumeur» pour une protéine impliquée dans le couplage cellulaire, en loccurrence la Cx30. En plus de la diminution de la prolifération tumorale dans des modèles expérimentaux in vitro et in vivo induite par une expression forcée de la Cx30, nous avons observé que le nombre de copie du gène codant pour la Cx30, soit GJB6 sur le chromosome 13q12, était fréquemment diminué dans les glioblastomes. De même, lexpression du transcrit de la Cx30 est plus faible dans les glioblastomes que dans les gliomes de bas grade ou encore chez les patients sains et son absence est corrélée à une altération des voies PI3K/Akt et ERK-MAPK.

Rapport de recherche bibliographique Diplôme d'études supérieures spécialisées : Ingénierie documentaire : Villeurbanne, ENSSIB : 2003. Rapport de recherche bibliographique Diplôme d'études supérieures spécialisées : Ingénierie documentaire : Lyon 1 : 2003.

Thèse doctorat : Médecine. Biologie cellulaire : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. 138-175 f. [350 réf.].

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé. Neurosciences : Paris 12 : 2004. / Thèse électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 80-93.

Thèse doctorat : Neurosciences : Paris 12 : 2003. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 349 réf.

Mémoire de Sage-femme : Médecine : Nantes : 2007. / Bibliogr.