Les cellules souches spermatogoniales (SSCs) constituent la population de cellules germinales initiales support de la production des spermatozoïdes tout le long de la vie d’un individu. Ces cellules caractérisées par leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation maintiennent ainsi une réserve et garantissent la production continue de cellules germinales différenciées. Chez les mammifères, plusieurs marqueurs permettant de reconnaitre cette population cellulaire au sein du testicule ont été identifiés. De plus, parmi ces marqueurs, certains permettent d’isoler et de purifier les SSCs. Ils ont ainsi permis d’aborder les mécanismes de régulation du devenir des SSCs par des expériences menées in vitro et in vivo. En revanche, la biologie de ces cellules est beaucoup moins connue chez les vertébrés non mammaliens, en particulier chez les poissons téléostéens. Notre modèle d’étude, la truite arc-en-ciel (Oncorynchus mykiss) est caractérisée par une spermatogenèse cyclique et fortement saisonnée. La croissance du testicule immature, la prolifération active des spermatogonies à la puberté, et la quiescence de ces dernières en fin de cycle semblent être des étapes clés de régulation du devenir des SSCs. Grâce à l’analyse des profils d’expression au cours du cycle spermatogénétique et dans des fractions de cellules testiculaires isolées, nous montrons la conservation d’expression de gènes décrit comme marqueurs de SSCs chez les mammifères (pou2, plzf, nanos2 et 3, gfra1) dans les populations de spermatogonies A indifférenciées de truite. En particulier, gfra1 et nanos2 identifient tous deux une sous-population de cellules au sein des spermatogonies. Nous proposons donc que les cellules gfra1+ et/ou nanos2+ sont des SSCs au sein du testicule de truite. Par ailleurs, nous montrons que l’orthologue truite de gdnf, ligand de gfra1 et régulateur majeur du maintien des SSCs chez la souris, est exprimé très fortement juste avant la fin de cycle spermatogénétique. Cette expression corrélée avec un pic de sécrétion plasmatique de Fsh suggérait une régulation positive de gdnf par cette hormone. Notre étude in vitro n’a pas permis d’aboutir aux mêmes conclusions, mais cette technique ne reflète pas toutes les régulations réciproques ni le rôle des autres facteurs in vivo. En conclusion, nous avons découvert des marqueurs probables de SSCs chez la truite. En particulier, gfra1 et nanos2 qui permettront une analyse plus approfondie de la biologie des SSCs chez les téléostéens. De plus, l’expression de gdnf et de son récepteur dans le testicule, régulée en fonction du stade du cycle spermatogénétique, nous permet d’envisager cette voie comme régulateur du devenir des SSCs chez la truite. / Spermatozoa production throughout life requires the presence of the initial germ cells, the spermatogonial stem cells (SSCs). Their self-renewal and their ability to differentiate assure to keep a reserve and to produce continuously differentiated germ cell. In mammals, several markers of the SSCs have been identified. Interestingly, some of them allow us to sort the SSCs population and further to analyze their fate in vitro and in vivo. By contrast, only scarce information has been obtained in non-mammalian vertebrates including the teleost fishes. Our model of study, the rainbow trout (Oncorynchus mykiss), presents a seasonal spermatogenesis. The growth of the immature testes, the active spermatogonial proliferation starting at puberty, and their quiescent state at the end of the cycle represent interesting stages to study the regulation on the SSCs fate. Using various testicular stages and purified testicular cell fractions we show that pou2, plzf, nanos2 and 3 and gfra1, all expressed by spermatogonial stem cells in mammals, are specifically expressed in the undifferentiated A spermatogonia population. In particular, gfra1 and nanos2 are expressed in a sub-population of these cells. Thus, we propose that the nanos2+ and/or gfra1+ cells are SSCs. Furthermore, in our study, gdnf, ligand of gfra1 regulating the SSCs fate in mouse, is highly expressed just before the end of the spermatogenetic cycle. Such expression correlates with Fsh peak of secretion. However a stimulation of gdnf expression by Fsh was not observed in our in vitro experiments, but this technique doesn’t represent reciprocal regulations nor the roles of all factors in vivo. To conclude, we discovered potent marker of SSCs in trout. In particular, gfra1 and nanos2 will allow us to investigate further the SSCs biology in teleosts. Moreover, gdnf and its receptor expression in the testis in a spermatogenetic-dependent way lead us to propose this pathway as a potent regulator of the SSCs fate in trout.

La perte de l’organe dentaire entraine une perte de substance de l’os alvéolaire. Les techniques mises en place pour reconstruire l’os alvéolaire préalablement à la pose d’implant utilisent des membranes (seules ou associées à une greffe osseuse), faisant d’une part office de barrière vis-à-vis des tissus mous environnants, et permettant d’autre part le maintien d’un espace nécessaire à l’ostéogénèse. Ce travail de thèse pluridisciplinaire vise à développer des matrices innovantes destinées à la régénération osseuse. Inspirés par la nature hybride du tissu osseux, des revêtements à base de phosphates de calcium et de polymères organiques (chitosane et acide hyaluronique) ont été élaborés par pulvérisation simultanée de solutions d’espèces réactives. La construction de ces revêtements a permis la précipitation d’un composé à base d’apatite carbonatée et de brushite sur des lamelles de verre (preuve de concept), tandis qu’un composé hybride complexe (brushite, phosphate octocalcique et apatite nanocristalline) a été construit sur des membranes de collagène d’origine porcine, utilisées en régénération osseuse. Sur le verre, les revêtements semblent posséder les propriétés intrinsèques (rugosité, élasticité) en faveur d’une différenciation ostéoblastique, ce qui a été confirmé par une différenciation ostéoblastique précoce des cellules souches. Sur la membrane, le revêtement n’induit pas de différenciation mais stimule les propriétés ostéo-immunomodulatrices des cellules souches, nécessaires à la régénération osseuse. De plus, le revêtement a démontré dans les deux cas une activité antibactérienne, le rendant très attractif pour des applications en régénération osseuse. Enfin, le développement d’un dispositif médical de classe II à partir de la gelée de Wharton a été envisagé. Cette source allogénique semble prometteuse en médecine régénératrice osseuse. / Bone loss following tooth extraction requires pre-implantory surgery techniques to regenerate bone. These techniques use an occlusive membrane positioned over a bone graft material or not, providing space maintenance and enabling to seclude soft tissue infiltration to promote bone regeneration. This pluridisciplinary thesis work aims at developing innovative biomaterials for bone regeneration applications. Inspired by bone hybrid composition, coatings made of calcium phosphates and organic polymers (chitosan and hyaluronic acid) were developed using simultaneous spray coating of interacting species process. Coating build-up led to precipitation of a compound made of carbonated apatite and brushite on glass coverslip (proof of concept), whereas a complex hybrid compound (brushite, octacalcium phosphate and nanocrystalline apatite) was formed on collagen membrane. Coating on glass coverslip seems to possess required properties (roughness, elasticity) for osteoblastic differentiation, which was confirmed by stem cells early osteoblast commitment. However, coating on collagen membrane did not induce osteoblastic differentiation, but stimulated stem cells osteo-immunomodulatory properties, required for bone regeneration. Interestingly, coating demonstrated in both cases antibacterial activities, which makes it very attractive for bone regeneration applications. Finally, Wharton’s jelly from umbilical cord was suggested as an innovative source for new biomaterials, to replace xenogeneic membranes.

Le gène H19 est soumis à l’empreinte génomique parentale et ne code aucune protéine. Le produit de ce gène, le long ARN non codant (lncRNA) H19, agit en tant qu’ARN et est impliqué dans le développement embryonnaire ainsi que dans la tumorigenèse. Le lncRNA H19 est le précurseur du miR-675. Mes travaux de thèse ont permis d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la tumorigenèse mammaire par le gène H19. Nous avons mis en évidence que le lncRNA H19 régule négativement la protéine p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux ont démontré que le lncRNA H19 interagit physiquement avec la protéine p53 et MDM2 afin d’induire sa dégradation et empêcher sa translocation dans le noyau. Ce nouveau mode d’action d’H19 dans les cancers du sein pourrait expliquer le manque de pertinence clinique de l’étude du statut mutationnel de p53 par immunohistochimie dans ce cancer. J’ai également mis en évidence que non seulement le lncRNA H19 est impliqué dans la régulation des cellules souches cancéreuses, mais également le miR-675-5p. En effet, les tumeurs exprimant des signatures géniques associées aux marqueurs de cellules souches cancéreuses sont des tumeurs qui surexpriment le gène H19. De plus, la modulation de l’expression du lncRNA H19 et de son microARN régule les capacités fonctionnelles associées aux cellules souches cancéreuses mammaires. Pour finir, j’ai initié un projet permettant l’identification, sans a priori, des gènes cibles du lncRNA H19 et de son microARN dans les cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, j’ai mis en évidence l’implication du lncRNA H19 et du miR-675-5p dans différents processus impliqués dans la tumorigenèse mammaire. / The H19 gene is subject to genomic imprinting and does not encode protein. The product of this gene, the long non coding RNA (lncRNA) H19, act as an RNA and is involved in development and the tumorigenesis. The H19 RNA is the precursor of miR-675. My thesis work identified new mechanism involved in the regulation of breast tumorigenesis by H19. We have demonstrated that the lncRNA H19 negatively regulates the p53 protein in breast cancer cell lines. My work revealed that H19 interacts with p53 and MDM2 to induce the degradation of p53 and impedes its nuclear localization. This new mechanism of H19 in breast cancer could explain the lack of clinical relevance of the p53 mutational state measured by immunohistochemistry in breast cancer. My work also revealed that not only the lncRNA H19 is involved in the regulation of breast cancer stem cells but also the miR-675-5p. Indeed, we have shown a correlation between overexpression of H19 and expression of a cancer stem cell phenotype in patient tumors. Furthermore, the modulation of H19 or miR-675 expression regulates the functional capacities associated with breast cancer stem cells. I also initiated a project that will allow the identification of H19 and miR-675 target genes in breast cancer cell lines. To conclude, I highlighted the implication of the lncRNA H19 and miR-675 in different process involved in breast cancer tumorigenesis.

Le traitement des ulcères cutanés constitue un défi majeur et les options thérapeutiques efficaces demeurent limitées. Le but du présent projet était de concevoir et d’évaluer le potentiel de pansements biologiques fabriqués à partir de cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA) à favoriser la guérison de plaies cutanées. Des pansements faits de CSTA ou de CSTA différenciées en adipocytes ont été mis au point en utilisant la technique d’auto-assemblage développée au LOEX et évalués sur un modèle d’étude in vitro adapté pour l’étude de pansements. L’effet de ces pansements a été évalué en mesurant la progression de la réépithélialisation des plaies in vitro, en caractérisant leur sécrétome et en réalisant des analyses histologiques et immunohistochimiques. Cette recherche suggère que les CSTA différenciées en adipocytes pourraient être utilisées en complément ou alternativement aux fibroblastes dermiques pour la production de recouvrements autologues utiles dans le traitement des plaies cutanées. / Treatment of chronic wounds remains a major challenge in clinic and efficient treatment options are still limited. The goal of this project was to create and evaluate the potential of bioengineered cellular wound dressings made of adipose-derived stem/stromal cells (ASCs) for cutaneous wound healing. Dressings made of ASCs differentiated or not towards the adipogenic lineage were produced using the self-assembly approach and were evaluated using an adapted in vitro wound healing model. The effect of these dressings was assessed by measuring the progression of reepithelialisation on in vitro wounds, by characterizing dressing’s secreted products and by histological and immunohistochemical analyses. This research suggests that ASCs could be used as an alternative or a complement to dermal fibroblasts for the production of autologous dressings useful for healing of chronic wounds.

Toutes les cellules de l’organisme relarguent de façon constitutive des nucléotides dans l’espace extracellulaire. Ces nucléotides extracellulaires agissent comme des molécules de signalisation, entre autres, via les récepteurs P2Y (P2YRs) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Les P2YRs sont exprimés, pour la majorité, de façon ubiquitaire dans l’organisme. L’analyse phénotypique des lignées de souris knockout pour les P2YRs (P2YR-/-) a permis de confirmer l’importance de cette voie de communication dans différents processus physio/pathologiques. Au sein de notre laboratoire, grâce à l’utilisation de souris P2YR-/-, nous étudions depuis quelques années le rôle de ces récepteurs dans la biologie des cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (MSCs). Ces cellules se caractérisent par une faible immunogénicité et surtout par la propriété de multipotence, i.e. capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires (adipocytes, chondroblastes, ostéoblastes). Cette dernière propriété suscite l’intérêt de la médecine régénérative qui vise à exploiter la multipotence de ces cellules en thérapie cellulaire. Toutefois, leur utilisation à des fins thérapeutiques est encore limitée, notamment parce que les mécanismes régulateurs de ces processus de différenciation sont encore mal compris. Il est donc fondamental de continuer à étudier les voies de signalisation régulant les processus de différenciation de ces cellules pour leurs applications cliniques.Dans ce travail de recherche, nous avons investigué l’implication de la signalisation dépendant des P2YR dans le modèle expérimental des MSCs dérivées du tissu adipeux sous-cutané inguinal (ATMSCs) murin. D’abord, nous avons montré que parmi les 7 sous-types connus de récepteur P2Ys, les ATMSCs expriment le P2Y2R (récepteur à l’ATP et l’UTP) et le P2Y6R (récepteur à l’UDP) et que ces récepteurs sont fonctionnels. Par une approche combinant l’analyse quantitative de leur expression, l’effet de leur activation pharmacologique et enfin l’effet de l’invalidation de leur gène (P2ry2 ou P2ry6), nous avons montré que ces deux récepteurs influencent à des degrés divers le processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs in vitro.Concernant le P2Y2R, nos données montrent que l’expression de son messager diminue dans les ATMSCs différenciées en adipocytes tandis que son activation et que l’invalidation de son gène sont sans effet sur l’intensité de différenciation adipogénique. Par ailleurs, après une différenciation ostéoblastogénique, le niveau d’expression du messager codant P2Y2R n’est pas modifié. Par contre, les ATMSCs P2Y2R-/- ont un potentiel de différenciation ostéoblastogénique diminué par rapport aux WT. Cet effet pourrait être lié à une diminution de l’expression de gènes codant des facteurs de signalisation des voies Wnt et/ou BMP, connues pour contrôler la production d’ostéoblastes à partir des MSCs.Le récepteur P2Y6R semble intervenir à la fois dans l’adipogénèse et l’ostéoblastogénèse des ATMSCs. En effet, l’expression du messager codant P2Y6R n’est pas modulée dans les adipocytes matures et l’activation du récepteur n’a pas d’effet sur le processus de différenciation adipogénique. Par contre, les ATMSCs P2Y6R-/- ont un potentiel de différenciation adipogénique réduit ce qui est corrélé à une diminution de l’expression du messager codant PPARγ2. D’autre part, nous avons constaté que l’augmentation de tissu adipeux est moindre chez les souris P2Y6R-/- âgées sous régime normal ou riche en graisse. Par ailleurs, l’expression du messager codant P2Y6R est diminuée après différenciation ostéoblastogénique. L’activation de P2Y6R par l’UDP altère la maturation complète des ATMSCs en ostéoblastes et l’invalidation du gène P2ry6 augmente l’activité principale de cette phase tardive, c’est-à-dire la production de minéralisation. Ces données suggèrent que la voie UDP-P2Y6R régule négativement le processus de différenciation ostéoblastogénique dans le modèle cellulaire étudié dans ce travail.Avec le modèle pathologique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs), modélisant une différenciation ectopique, nous avons montré que l’invalidation des gènes P2ry2 et P2ry6 affecte la transdifférenciation de ces cellules en cellules minéralisantes.En résumé, notre travail a permis de définir les rôles des P2Y2R et P2Y6R dans les processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs et de transdifférenciation des VSMCs en cellules calcifiantes. Des études complémentaires devront être réalisées pour établir la signification physio/pathologique de ces données expérimentales. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mutations affectant la fonction d'enzymes impliquées dans le cycle des purines sont responsables d'une multitude de syndromes pédiatriques, caractérisés par des atteintes neurologiques et comportementales. A ce jour, aucune stratégie thérapeutique n'a été réellement efficace pour contrôler ces symptômes. La maladie de Lesch-Nyhan (MLN), associée à la perte de fonction de l'enzyme de recyclage HGPRT, constitue un bon modèle d'étude. Mon travail a consisté à utiliser la technologie des cellules souches induites à la pluripotence, reprogrammées à partir de fibroblastes de patients atteints des formes sévères de la MLN, pour identifier des phénotypes neuronaux associés à la perte de fonction de l'HGPRT. Ces marqueurs phénotypiques ont ensuite été utilisés pour identifier, par une approche de criblage à haut débit, de nouvelles molécules chimiques capables de corriger ces défauts. Plus de 3000 molécules ont été testées et 6 composés, tous dérivés de l'adénosine, ont pu être identifiés comme compensant le métabolisme par un mécanisme d'action indépendant de l'HGPRT. De manière intéressante, un des composés, la S-adenosylmethionine (SAM) a par le passé déjà démontré des effets bénéfiques sur les symptômes comportementaux typiques de la MLN dans plusieurs études de cas. Cela démontre que la stratégie abordée ici a permis l'identification de cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les symptômes neurospychiatriques de cette pathologie et constitue un modèle réplicable pour différentes pathologies touchant le métabolisme cérébral. / Mutations in genes coding for enzymes involved in purine synthesis or recycling lead to dramatic neurological conditions with poor pharmacological options. Lesch–Nyhan disease (LND) is caused by deficiency of the salvage pathway enzyme HGPRT that compromises recycling of guanine and hypoxanthine into GMP and IMP. LND is characterized by severe neuropsychiatric symptoms that are out of reach of pharmacological treatments. Here we use human cortical neural stem cells and neurons derived from iPSC of children affected by severe forms of LND to identify neural phenotypes associated with HGPRT-deficiency and of interest to develop a target-agnostic based drug screening system. We screened more than 3000 molecules and identified 6 compounds, all possessing an adenosine moiety, that corrected LND related neuronal phenotypes by promoting metabolism compensations in a HGPRT-independent manner. One of these compound, S-adenosylmethionine (SAM), has already been reported as providing amelioration of behavioral symptoms in some LND cases, demonstrating that our screening allowed the identification of pathways that can be relevant therapeutic targets to ease the devastating neuropsychiatric symptoms associated with this pathology. Interestingly, these pathways can be activated in LND patients via simple food supplementation. This experimental paradigm can also be easily adapted to other purine associated neurological disorders affecting normal brain development.

Le mélanome est un cancer de la peau dont l’incidence est en continuelle augmentation dans le monde entier. Des progrès récents dans la compréhension des mécanismes cellulaires complexes régulant l’immunité du cancer ont conduit à l’élaboration de nouvelles stratégies visant des checkpoints spécifiques de la régulation des réponses immunes. Ipilimumab est un anticorps thérapeutique dirigé contre la molécule CTLA-4. Il a permis, chez les patients atteints de mélanome métastatique, d’augmenter la survie globale et a fait l’objet d’une approbation de la FDA en 2011. Cependant cette thérapie ne semble bénéficier qu’à un nombre restreint de patients et souvent de manière retardée. L’identification de marqueurs immunologiques précoces associés à la réponse clinique et à la survie s’avère donc être nécessaire afin d’apporter des éléments d’orientation. Dans ce contexte, nous avons suivi de manière longitudinale, prospective et retrospective une cohorte de 77 patients atteints de mélanome métastatique. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps aux molécules sériques reflétant soit l’importance de l’envahissement tumoral (LDH, S100B et MIA) soit l’implication de mécanismes d’échappement immunitaire (MICA soluble et anticorps anti-MICA). Nous montrons une association entre des faibles concentrations sériques de LDH et S100B, soutenues après première et deuxième dose d’ipilimumab, et la réponse au traitement et la survie. De plus, des niveaux élevés de MICA solubles avant le traitement sont associés à une fréquence plus faible de complications à type d’auto-immunité. Nous avons de plus suivi les populations lymphocytaires avec une attention particulière portée sur les compartiments naïf et mémoires T, les facteurs de transcription impliqués dans la différentiation des lymphocytes T mémoires, les cytokines produites et les récepteurs de chimiokines de lymphocytes T. Nos résultats montrent que le taux de lymphocytes avant l’introduction du traitement est un facteur prédictif de meilleure survie et de réponse positive à la semaine 16, indépendamment du taux de LDH et de la corticothérapie. De plus, un effet global de l'ipilimumab sur l'expansion des cellules T mémoires classiques a été observé, associé à la réponse au traitement. En revanche, les fréquences des cellules souches T mémoires (TSCM) récemment décrites diminuent malgré une augmentation de la prolifération, suggérant un processus de différenciation. L'ipilimumab induit aussi l'expansion de lymphocytes T exprimant CXCR3, CCR4 et CCR6, permettant une migration vers la peau et les tissus inflammés, avec augmentation de leur capacité à produire des cytokines effectrices. Une augmentation précoce des cellules T CD8+ exprimant le facteur de transcription Eomes s’est révélée être associée à un contrôle de la maladie. Enfin, et sur la base des résultats précédents, nous avons étudié la capacité des lymphocytes T mémoires de patients à proliférer après stimulation in vitro. Contrairement aux sujets sains, les patients présentent un défaut dans la capacité de prolifération des TSCM qui pourrait être liée à un défaut dans la régulation d’Eomes et Ki-67. Nous proposons ainsi un modèle permettant de suivre de manière précoce les étapes conduisant à la différentiation des TSCM en sous populations mémoires, associées à une réponse clinique sous ipilimumab, et impliquant le facteur de transcription Eomes. / Melanoma is a skin cancer with incidence increasing at dramatic rates worldwide. Ipilimumab, an anti-CTLA-4 therapy developed in the view of counter-balancing the inhibitory role of CTLA-4 in T lymphocytes, was the first immune checkpoint inhibitor demonstrating to extend overall survival in patients with metastatic melanoma, with FDA approval in 2011. However, biomarkers allowing the identification of the subset of patients that will more likely benefit from this immunotherapy or that may allow a good monitoring of patient clinical management during treatment are lacking. The principal objective of this work was to identify potential and early predictive biomarkers of ipilimumab response and/or survival in a cohort of 77 metastatic melanoma patients. Firstly, serum levels of melanoma markers such as LDH, S100B and soluble MICA (and its counter-part anti-MICA antibody), tumour markers associated with tumour development and/or immune escape, were assessed. A correlation between lower baseline levels of LDH and S100B, sustained after the first and second doses of ipilimumab, and treatment response and survival was observed, suggesting their potential utility in treatment monitoring. In addition, higher baseline levels of soluble MICA were found to be associated with a less frequency of immune-related adverse events, which might provide important information for the management of frequent ipilimumab-related adverse events. Secondly, immune markers with a special focus on transcription factors, cytokine secretion and chemokine receptors of T lymphocytes and memory T subsets were assessed. An association between baseline absolute lymphocyte counts and extended overall survival as well as better treatment response was found. In addition, a global effect of ipilimumab on the expansion of conventional memory T cells was observed, which was associated with treatment response. By contrast, frequencies of the recently described stem-cell memory T cells were shown to decrease despite increased proliferation, suggesting a process of differentiation. Additionally, ipilimumab induced the expansion of CXCR3, CCR4 and CCR6-expressing T lymphocytes and effector cytokines secretion capacity. Early increased levels of Eomes-expressing CD8+ T cells were found to be associated with disease control. Lastly, and based on the previous results, we investigated the ability of patients’ memory T cells to proliferate under in vitro stimulation. We found that, in contrast to healthy subjects, patients possess a defect in the ability of stem-cell memory T cells expansion in vitro, that might be related to a defect in Eomes and Ki-67 regulation.

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.

« Maîtrise en sciences cliniques et biomédicales - avec mémoire de l'Université Laval offert en extension à l'Université du Québec à Chicoutimi » / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie héréditaire dominante où le muscle squelettique est sévèrement affecté. Les personnes atteintes présentent une faiblesse musculaire, une perte progressive de la force musculaire et de l'atrophie. La fonction des cellules souches musculaires (CSM) est également altérée en DM1 en présentant notamment un profil de sénescence prématurée, une capacité de prolifération et de fusion diminuée, mais aussi une différenciation en myotubes retardée. Le profil inflammatoire élevé mesuré chez les individus atteints de DM1 pourrait être, du moins en partie, responsable de l'altération de leur fonction. Actuellement, cette maladie reste incurable, mais il y a un haut potentiel thérapeutique dans le développement de stratégies permettant de restaurer la fonction des CSM. De plus, cette avenue demeure inexplorée. Afin de permettre l'avancement des connaissances dans ce domaine de recherche, ce mémoire présente un travail de recherche visant à développer une nouvelle avenue thérapeutique ciblant la fonction altérée des CSM ainsi que l'inflammation potentiellement présente au niveau musculaire en DM1. Pour répondre à ces objectifs, la force musculaire de 4 groupes musculaires a été mesurée chez 103 participants atteints de DM1, exprimée en valeur prédite, puis comparée entre les individus présentant des niveaux sériques normaux ou anormaux de cytokines pro inflammatoires. De plus, à partir de biopsies musculaires prélevées chez 10 patients DM1 et 15 sujets sains, la densité de cellules inflammatoires (macrophages) a été quantifiée dans les tissus musculaires DM1 et comparée aux tissus contrôles. Des CSM ont aussi été isolées à partir de ces biopsies et utilisées afin d'évaluer le niveau d'expression de certains gènes inflammatoires par technique de séquençage de cellules uniques et d'évaluer l'effet de certains médiateurs lipidiques sur la fonction CSM et ainsi que sur l'expression de certains gènes de l'inflammation. Les résultats de cette étude ont été présentés dans la production d'un article original portant sur l'étude des médiateurs lipidiques sur la fonction des CSM en DM1. En plus de confirmer l'inflammation systémique (sang) documentée chez les individus atteints de DM1, les résultats obtenus démontrent une inflammation locale (tissu musculaire et CSM) chez ceux-ci. Aussi, l'ajout exogène de certaines molécules appartenant à cette famille de médiateurs, dont certaines résolvines et marésines, améliore la prolifération, la différenciation et la fusion des CSM, et diminue significativement l'expression de certains gènes de l'inflammation. Ainsi, cette classe de médiateurs représente un nouvel espoir thérapeutique dans le développement de thérapies ciblant les fonctions altérées des CSM, mais également dans la résolution de l'inflammation en DM1 et autres maladies inflammatoires. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a dominant disease characterized by severely affected skeletal muscles. Individuals with DM1 experienced muscle weakness, progressive loss of muscle strength and atrophy. The function of muscle stem cells (MSC) is also altered in DM1 and they exhibit a premature senescence profile, decreased proliferation and fusion capacity and delayed differentiation into myotubes. At least, the highly inflammatory profile could be responsible of the impairment of their functions. Currently, there is no cure for this disease, but there is a high therapeutic potential in the development of strategies to restore MSC function. Moreover, this avenue remains unexplored. To increase knowledge in this field of research, this thesis presents an original manuscript on the study of lipid mediators on MSC function in DM1. In addition to confirm the systemic inflammation (blood) documented in DM1 patients, the results obtained demonstrate a local inflammation (in muscle tissue and MSC) in DM1 patients. Also, the exogenous addition of lipid mediators including resolvin and maresins family improves the proliferation, differentiation and fusion of MSC and significantly decreases the expression of inflammation genes. Thus, this class of mediators represents a new therapeutic hope to rescue MSC function and decrease inflammatory profile associated with DM1.