La réparation des défauts osseux de taille importante (fracture, tumeur, nécrose de l'os) pour lesquelles une partie de l'os est manquante et doit être remplacée, demeure un défi important pour le domaine médical. Des matériaux synthétiques, comme des matériaux céramiques, métalliques, et polymères, sont ainsi développés comme substituts osseux. Mais ces matériaux n'interagissent pas suffisamment avec l'os du patient et finissent par être encapsulés par une couche de tissu fibreux, ce qui peut résulter en une fracture de l'os, de l'implant, ou de l'interface entre les deux. La recherche vise donc à étudier et comprendre les interactions entre les cellules et les matériaux, afin de développer des matériaux capables d'interagir avec les cellules, et de mettre au point des implants combinant un matériau bioactif, des cellules, et des facteurs bioactifs permettant la reconstruction du tissu osseux. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) ont gagné en popularité en médecine régénératrice compte tenu de leur capacité d'auto-renouvellement, leur multipotence, et leur taux de prolifération élevé. Cependant, une fois extraites du patient et cultivées in vitro, les MSCs ont tendance à se différencier de manière aléatoire, ce qui conduit à une population hétérogène de cellules avec laquelle il est difficile de reconstruire un tissu. Bien que les MSCs soient utilisées en clinique pour le traitement de diverses pathologies, une meilleure compréhension de leur comportement reste nécessaire pour permettre de contrôler leur différenciation vers une lignée spécifique et ainsi améliorer leurs performances en clinique. Les hydrogels ont émergé comme matériaux prometteurs pour la culture cellulaire puisqu'ils permettent de mimer la matrice extracellulaire naturelle des cellules. Notamment, de nombreuses études ont évalué l'impact de la rigidité des hydrogels sur la différenciation des MSCs et ont montré qu'une rigidité proche de celle d'un tissu naturel favorise la différenciation vers les cellules de ce tissu. Cependant, il est maintenant reconnu que les hydrogels et les tissus naturels ne sont pas caractérisés uniquement par leur rigidité, mais aussi par leur viscoélasticité. Or peu d'études ont été menées sur l'impact des propriétés viscoélastiques des hydrogels sur la différenciation des MSCs (15 articles sur les cinq dernières années via PubMed). Dans ce projet, il a été montré qu'il était possible de synthétiser des hydrogels de poly(acrylamide-co-acide acrylique) avec une rigidité et une viscoélasticité contrôlées, mesurées par compression et par AFM. Cinq hydrogels ont été choisis pour étudier l'impact des propriétés mécaniques sur la différenciation ostéogénique des MSCs en variant la rigidité et le pourcentage de relaxation : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, et 140 kPa-70%. Il a été montré que la fonctionnalisation de surface de ces hydrogels avec un peptide mimétique de la protéine BMP-2 a mené à une forme cellulaire étoilée après deux semaines de différenciation, sauf pour la rigidité la plus basse (15 kPa). Cette forme cellulaire étoilée correspondrait à une forme d'ostéocyte, qui est le dernier stade de différenciation ostéogénique des MSCs, et qui n'a jamais été obtenu in vitro à notre connaissance. De plus, une rigidité de 60 kPa a mené à une plus forte expression de marqueurs de différenciation ostéocytaires par rapport à des rigidités de 15 et 140 kPa, pour une même relaxation de 15%. Enfin, la plus forte expression de marqueurs de différenciation d'ostéoblastes et d'ostéocytes a été observée pour l'hydrogel présentant 70% de relaxation et une rigidité de 140 kPa. Ceci semble montrer qu'une viscoélasticité élevée favorise la différenciation ostéogénique des MSCs, même si elle est associée à une rigidité qui n'est pas la plus favorable. Ainsi, les propriétés viscoélastiques de la matrice auraient un impact non négligeable sur la différenciation des MSCs et devraient être considérées à l'avenir. / The repair of large bone defects, including large fracture, tumor, and necrosis for which a part of the bone is missing and has to be replaced, is still a challenge for the medical field. Synthetic materials, such as ceramic, metallic, and polymeric materials, have been developed as bone substitutes. However, these materials do not interact with the bone of the patient and generally end up being encapsulated by a layer of fibrous tissue, that might result in the fracture of the bone, the implant, or the interface between the two. The research therefore aims at studying and understanding cell-material interactions in order to develop materials capable of interacting with cells, and to create new implants combining a carrier material, cells, and bioactive factors, allowing bone reconstruction. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have gained high interest in regenerative medicine considering their self-renewal ability, multipotency, and high proliferative rate. However, once extracted from the patient and cultivated in vitro, MSCs tend to differentiate randomly, which leads to a heterogeneous population of cells with which it is difficult to reconstruct any tissue. Therefore, although MSCs are used in clinics for the treatment of various pathologies, a better understanding of their biological behavior is still required to provide the ability to control their in vitro differentiation into a specific lineage and improve their clinical performance. Hydrogels have emerged as promising materials for cell culture as they allow to mimic the natural extracellular matrix of cells. Particularly, many studies have evaluated the impact of hydrogels stiffness on MSCs differentiation and showed that a stiffness close to that of a biological tissue leads to a differentiation towards cells of this tissue. Nevertheless, it is now recognized that hydrogels as well as biological tissues are not only described by their stiffness, but also by their viscoelastic properties. However, only few studies have been conducted on the impact of hydrogels viscoelastic properties on MSCs differentiation (15 articles over the past five years from PubMed). In this project, it has been shown that it was possible to synthesize poly(acrylamide-co- acrylic acid) hydrogels with different controlled stiffness and viscoelasticity, evaluated using compression and AFM. Five hydrogels have been chosen to study the impact of hydrogels mechanical properties on MSCs osteogenic differentiation by varying the stiffness and the relaxation percent : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, and 140 kPa- 70%. It has been shown that the surface functionalization of these hydrogels with a mimetic peptide of the BMP-2 protein led to star-like cells, except for the lowest stiffness (15 kPa). This star-like shape would correspond to the shape of osteocytes, which is the last stage of osteogenic differentiation, and which has never been obtained in vitro to our knowledge. Moreover, a stiffness of 60 kPa led to a higher expression of osteocyte markers as compared to stiffnesses of 15 and 140 kPa, for a constant low relaxation of 15%. Finally, the strongest expression of osteoblast and osteocyte differentiation markers has been observed for the hydrogel with a high relaxation of 70% and a stiffness of 140 kPa. This shows that a high viscoelasticity would favor MSCs osteogenic differentiation, even if it is associated with a stiffness that is not the most favorable. Thus, the viscoelastic properties of the matrix would have a significant impact on MSCs differentiation and should be considered in the future.

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.

« Maîtrise en sciences cliniques et biomédicales - avec mémoire de l'Université Laval offert en extension à l'Université du Québec à Chicoutimi » / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie héréditaire dominante où le muscle squelettique est sévèrement affecté. Les personnes atteintes présentent une faiblesse musculaire, une perte progressive de la force musculaire et de l'atrophie. La fonction des cellules souches musculaires (CSM) est également altérée en DM1 en présentant notamment un profil de sénescence prématurée, une capacité de prolifération et de fusion diminuée, mais aussi une différenciation en myotubes retardée. Le profil inflammatoire élevé mesuré chez les individus atteints de DM1 pourrait être, du moins en partie, responsable de l'altération de leur fonction. Actuellement, cette maladie reste incurable, mais il y a un haut potentiel thérapeutique dans le développement de stratégies permettant de restaurer la fonction des CSM. De plus, cette avenue demeure inexplorée. Afin de permettre l'avancement des connaissances dans ce domaine de recherche, ce mémoire présente un travail de recherche visant à développer une nouvelle avenue thérapeutique ciblant la fonction altérée des CSM ainsi que l'inflammation potentiellement présente au niveau musculaire en DM1. Pour répondre à ces objectifs, la force musculaire de 4 groupes musculaires a été mesurée chez 103 participants atteints de DM1, exprimée en valeur prédite, puis comparée entre les individus présentant des niveaux sériques normaux ou anormaux de cytokines pro inflammatoires. De plus, à partir de biopsies musculaires prélevées chez 10 patients DM1 et 15 sujets sains, la densité de cellules inflammatoires (macrophages) a été quantifiée dans les tissus musculaires DM1 et comparée aux tissus contrôles. Des CSM ont aussi été isolées à partir de ces biopsies et utilisées afin d'évaluer le niveau d'expression de certains gènes inflammatoires par technique de séquençage de cellules uniques et d'évaluer l'effet de certains médiateurs lipidiques sur la fonction CSM et ainsi que sur l'expression de certains gènes de l'inflammation. Les résultats de cette étude ont été présentés dans la production d'un article original portant sur l'étude des médiateurs lipidiques sur la fonction des CSM en DM1. En plus de confirmer l'inflammation systémique (sang) documentée chez les individus atteints de DM1, les résultats obtenus démontrent une inflammation locale (tissu musculaire et CSM) chez ceux-ci. Aussi, l'ajout exogène de certaines molécules appartenant à cette famille de médiateurs, dont certaines résolvines et marésines, améliore la prolifération, la différenciation et la fusion des CSM, et diminue significativement l'expression de certains gènes de l'inflammation. Ainsi, cette classe de médiateurs représente un nouvel espoir thérapeutique dans le développement de thérapies ciblant les fonctions altérées des CSM, mais également dans la résolution de l'inflammation en DM1 et autres maladies inflammatoires. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a dominant disease characterized by severely affected skeletal muscles. Individuals with DM1 experienced muscle weakness, progressive loss of muscle strength and atrophy. The function of muscle stem cells (MSC) is also altered in DM1 and they exhibit a premature senescence profile, decreased proliferation and fusion capacity and delayed differentiation into myotubes. At least, the highly inflammatory profile could be responsible of the impairment of their functions. Currently, there is no cure for this disease, but there is a high therapeutic potential in the development of strategies to restore MSC function. Moreover, this avenue remains unexplored. To increase knowledge in this field of research, this thesis presents an original manuscript on the study of lipid mediators on MSC function in DM1. In addition to confirm the systemic inflammation (blood) documented in DM1 patients, the results obtained demonstrate a local inflammation (in muscle tissue and MSC) in DM1 patients. Also, the exogenous addition of lipid mediators including resolvin and maresins family improves the proliferation, differentiation and fusion of MSC and significantly decreases the expression of inflammation genes. Thus, this class of mediators represents a new therapeutic hope to rescue MSC function and decrease inflammatory profile associated with DM1.

L'activation de cathepsines et la présence de cellules cancéreuses dites souches (CSC) participeraient à l'évolution métastatique du cancer colorectal. L'effet d'inhibiteurs intracellulaire (CA-074 ME) et extracellulaire (CA-074) de la cathepsine B a été analysé dans un système de culture tridimensionnelle (3-D) reproduisant le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du côlon. Le CA-074 ME a été le seul à inhiber de façon significative le processus métastatique. Pour l'étude des CSC, le marquage immunohistochimique de CD 133, CD44 et CD24 a été évalué qualitativement et quantitativement dans la culture 3-D et dans des spécimens histologiques provenant de patients porteurs de cancer du côlon. L'expression de ces marqueurs dans les cellules cultivées en 3-D était variable. Par contre, le marqueur CD 133 était fortement exprimé dans les métastases hépatiques associées à des ganglions lymphatiques envahis, tel que démontré en combinaison avec une coloration fluorescente des noyaux. La conclusion reflète les corrélations possibles de ces résultats.

Les cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSCs) ont été conçues pour la première fois en 2007 par l’équipe du Docteur Yamanaka, au Japon. Ce sont des cellules somatiques reprogrammées par un virus permettant, par exemple, la différenciation neuronale à des fins d'étude de maladies neuro-développementales telle que la Schizophrénie. Le prélèvement des cellules somatiques se fait aujourd'hui majoritairement par des méthodes assez invasives, notamment les biopsies de peau ou prélèvements sanguins. Ceci peut représenter un frein à leur utilisation notamment chez les enfants et surtout les enfants malades. La différenciation neuronale privilégiée est la voie dopaminergique (DA) car c'est ce type cellulaire qui est principalement atteint chez les schizophrènes. C'est pourquoi on priorise pour ce projet l'utilisation de cellules contenues dans l'urine, qui seront reprogrammées via un virus non-intégratif, le virus de Sendaï (SeV). La différenciation neuronale nous permettra d'obtenir des neurones DA fonctionnels, caractérisés par électrophysiologie. Les expériences ont montré une très grande efficacité de reprogrammation cellulaire au niveau des cellules d'urine, ainsi qu'un grand potentiel de différenciation neuronale, malgré quelques différences observées entre les lignées saines et schizophréniques. Grâce à ce projet, la réalisation d'un modèle cellulaire pour la Schizophrénie a pu être établie. Les différences notées entre les lignées pendant la différenciation ouvrent une nouvelle voie pour approfondir l'étude de la maladie au niveau cellulaire et moléculaire. / Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) were conceived for the first time in 2007 in Japan, by Doctor Yamanaka’s team. These are somatic cells reprogrammed thanks to a retrovirus allowing, for example, neuronal differentiation for the purpose of neurodevelopmental disorders studies such as Schizophrenia. Today, the removal of somatic cells is mainly made by enough invasive methods, including skin and blood biopsies. This can represent a brake in their use predominantly children, mainly sick children. The preferred neuronal differentiation is the dopaminergic (DA) way because it's the mostly cell type affected in schizophrenics. That's why we prioritize the use of urine cells for this project, reprogrammed via a non integrative virus, the Sendai virus (SeV). The neuronal differentiation enables us to get functional DA neurons characterized by electrophysiology. Experimentations show a huge efficiency of urine cells reprogramming as well as a great potential of neuronal differentiation despite some distinctions between the two lines. Thanks to this project, the achievement of a cellular model for Schizophrenia could be established. The differences noticed between the two lines during the differentiation open up a new way to make cellular and molecular studies of this disease deeper.

Les fusions de MLL peuvent générer trois types de leucémies aiguës (LLA-B, LMA et LLA-T). Les cellules souches/progénitrices de sang de cordon humain purifiées par une méthode de sélection négative ont été infectées par un rétrovirus contrôle exprimant la EGFP ou un rétrovirus exprimant un gène de fusion de MLL et la EGFP, avant d’être injectées dans le fémur de souris immunodéficientes. Après 20 semaines, les souris ont été sacrifiées et les organes hématopoïétiques ont été analysés par FACS. MLL-ENL a généré exclusivement des LLA-B, MLL-ELL des LLA-B et LMA, et MLL-AF9 des LLA-B et mixte. Il semble que certains partenaires peuvent jouer un rôle important dans le phénotype et que le microenvironnement murin peut favoriser le phénotype LLA-B. Cette étude peut aider à comprendre le rôle instructif des MLL-ENL, MLL-ELL et MLL-AF9 sur le phénotype leucémique et leur capacité à initier la transformation des cellules normales en cellules leucémiques. / MLL fusion genes may generate three different types of acute leukemia (B-ALL, AML and T-ALL). Purified human cord blood cells by negative selection technique (Lin-CB) and having CD34+ > 70% were transduced by control retrovirus expressing the EGFP or other retrovirus expressing an MLL fusion gene and the EGFP, and then injected into the immune-deficient NSG mouse femur to test the leukemogenic potential. After 20 weeks, the mice were sacrificed and organs were analysed by FACS. MLL-ENL exclusively produced B-ALL, MLL-ELL B-ALL and AML, and MLL-AF9 B-ALL and mixed. It seems that some MLL partner genes may play an important role in phenotype, and the murine microenvironment of our in vivo model may promote the B-ALL phenotype. This study may help understand the instructive role of MLL-ENL, MLL-ELL and MLL-AF9 fusion genes in leukemic phenotype and their ability to induce the transformation of normal hematopoietic stem/progenitor cells into leukemic cells.

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Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / 5 vidéos en format mp4. MovieS1: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics formed on a typical MRC-5 cell adhering ; Movie S2A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, Untreated MRC-5 cell adhering ; MovieS2B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, MRC-5 cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS3A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, Untreated HeLa cell adhering ; MovieS3B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, HeLa cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS4: Time-lapse cell imaging of SIC inhibition and increased spreading of newly adhering MRC-5 cell treated with Y27632 (ROCK inhibitor). / La majorité des cancers proviennent du tissu épithélial. Lors de l'évolution d'une tumeur, les cellules cancéreuses épithéliales subissent une transition épithéliale à mésenchymateuse afin d'amorcer la progression tumorale. La migration et l'adhésion cellulaire sont des processus biologiques essentiels à l'établissement de métastases, qui sont la principale cause de décès associés au cancer. Ainsi, cibler l'un ou l'autre de ces processus et affecter la progression tumorale pourrait potentiellement améliorer le pronostic. Mon projet de doctorat s'est donc penché sur les mécanismes de régulation de l'initiation de l'adhésion spécifiques aux cellules ayant subi une transition épithéliale-mésenchymateuse. L'étude de l'initiation de l'adhésion a mis en lumière une structure impliquée dans la maturation des adhésions focales, les spreading initiation centers (SICs). Les SICs se situent au-dessus de futurs sites de formation d'adhésions focales et sont composés de complexes ribonucléoprotéiques confinés sous une gaine d'actine. Parmi les protéines faisant partie des SICs, on retrouve plusieurs protéines impliquées dans l'adhésion, mais également plusieurs protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous avons montré que les RBPs ainsi que les ARNm sont présents de façon enrichie dans les SICs, suggérant une traduction localisée. En effet, l'inhibition de la traduction freine l'adhésion spécifiquement chez les cellules de types mésenchymateuses et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse. Nous avons mis en lumière une régulation spatiotemporelle de la traduction, spécifique aux cellules mésenchymateuses. Au fil de l'adhésion, la machinerie traductionnelle est tout d'abord inhibée puis stimulée. Cette régulation spatiotemporelle permet une reprogrammation de la traduction vers une traduction localisée et spécifique de protéines impliquées dans la formation des adhésions focales. Nous avons montré que la régulation temporelle de la traduction est assurée par la phosphorylation de la sous-unité alpha de l'EIF2. L'inhibition de la traduction est donc un moyen direct d'étudier les différences dans l'initiation de l'adhésion entre les cellules épithéliales et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse lors de la progression tumorale. / Most cancers originate in epithelial tissue. Epithelial cancer cells then undergo an epithelial to mesenchymal transition to initiate tumor progression. Cell migration and adhesion are essential biological processes for metastasis formation. Metastases are the leading cause of cancer-associated deaths, so targeting any of these processes would greatly affect tumor progression, which could lead to a better prognosis. My doctoral project therefore centered on the mechanisms of regulation of adhesion initiation specific to cells that have undergone an epithelial to mesenchymal transition. The study of adhesion initiation has highlighted a structure involved in the maturation of focal adhesions called spreading initiation center (SIC). This structure has been shown to localize above the formation sites of focal adhesions and to be composed of ribonucleoprotein complexes confined under an actin sheath. Among the proteins identified as part of the SICs are several proteins involved in adhesion and several RNA binding proteins. We have shown that RNA binding proteins and mRNA are enriched within SICs, suggesting the presence of translational activity. We subsequently confirmed an enrichment in translation in the SICs during the initial phase of adhesion. Indeed, inhibiting translation only inhibits cellular adhesion in mesenchymal cells and in epithelial cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition. By further studying the translation dynamics during adhesion, we have highlighted a spatiotemporal regulation specific to mesenchymal cells. The translational machinery is first inhibited, after which there is an upsurge in translation. This spatiotemporal regulation allows a reprogramming of the translatome, inducing the specific translation of proteins involved in the formation of focal adhesions. We have shown that the temporal regulation of translation is regulated by the phosphorylation of the alpha subunit of eIF2. The initiation of translation is therefore an interesting target to study the differences between the adhesion initiation of epithelial cells and that of cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition during tumor progression.

L’hémine humaine, connue commercialement sous l’appellation Normosang® ou Panhematin® est un produit utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des attaques aigües de porphyrie, maladie génétique affectant la biosynthèse de l’hème. Récemment, le traitement d’une patiente atteinte d’anémie hémolytique auto-immune sévère et de réticulocytopénie a été pris en charge par un médecin hématologue d’Héma-Québec. Le traitement de cette patiente au Normosang® a entre autres contribué à l’augmentation de son nombre d’érythrocytes et a contribué au rétablissement de son état de santé. Nous avons ainsi entrepris ce projet dans le but d’évaluer les effets de l’hémine sur l’expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon dans un milieu de culture favorisant la différenciation érythroïde. Le suivi de l’expansion montre que l’hémine semble avoir un effet positif sur la croissance des cellules lors de leur différenciation érythroïde. Les résultats montrent que l’hémine semble aussi avoir un effet sur les précurseurs érythroïdes engagés dans ’érythropoïèse. L’analyse de la différenciation montre que l’hémine semble stimuler la différenciation érythroïde, ainsi que l’énucléation. L’approfondissement de ces connaissances pourrait ultimement permettre d’élargir le spectre d’application clinique du Normosang®. / Human hemin, commercialized as Normosang® or Panhematin®, is a therapeutic agent approved for the treatment of acute attacks of porphyria, a genetic disease causing a malfunction of the heme biosynthesis pathway. Recently, the treatment of a patient with severe autoimmune hemolytic anemia and reticulocytopenia was managed by a hematologist from Héma-Québec. The treatment of this patient with Normosang® has, among other things, contributed to the increasing erythrocyte levels and contributed to the complete recovery of this patient. The aim of this project was to evaluate the effects of hemin on the expansion and differentiation of hematopoietic cord blood stem cells in a culture media favoring erythroid differentiation. Results show that hemin has a positive effect on cell growth during their erythroid differentiation. The results show that hemin also appears to have an effect on erythroid precursors. Differentiation analysis points to a possible role for hemin in the stimulation of erythroid differentiation as well as enucleation. More knowledge on the subject could ultimately support a larger spectrum of clinical applications.