Des études récentes ont relevés que les CSMn pouvaient être in vivo des cellules périvasculaires avec des caractéristiques des péricytes. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons cultiver des CSMn issues de MO dans des conditions spécifiques pour l'expansion des péricytes puis nous avons testé leur potentiel de souchitude. De plus, nous les avons comparées avec des CSMs cultivées dans des conditions standards en maintenant les même donneurs. Des échantillons de MO ont été cultivés dans un milieu pro-Pericytaires (milieu EGM2) ou dans un milieu standard. Après culture, les cellules ont été caractérisées. Les cellules de caractère péricytaire avaient exprimé une upregulation des marqueurs de souchitude d’OCT4, NANOG et SOX2 pour un potentiel neuronal. Ces cellules ont démontré un grand potentiel in vivo. / Native mesenchymal stem cells were found tore perivascular cells with pericyte features. This suggests that pericyte phenotype is crucial for the stenness of MSC. We cultured MSC from bone marrow upon in vitro conditions (EGM2 versus standard mediums). They all express MSC, markers and character. Cells cultivated into ECM2 were found to be more immature than cells obtained from standard conditions (expressed OCT4, NANOG and SOX2), with high neuronal and engraftment potential

La radiothérapie induit des séquelles aigues puis tardives affectant les tissus sains inclus dans le volume irradié. D'une façon générale, le processus lésionnel se caractérise par une ischémie vasculaire, une apoptose cellulaire et une fibrose cicatricielle. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire à l'aide de cellules souches mésenchymateuses médullaires CSMM pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique séduisante, les CSMM ayant une capacité intrinsèque à promouvoir l'angiogenèse et une implication dans les processus naturels de réparation tissulaire. La première partie de ce travail a consisté à la mise au point de modèles murins présentant un processus de dégénérescence tissulaire similaire à celui survenant après radiothérapie. L'objectif étant d'affiner la compréhension des mécanismes physiopathologiques des lésions tissulaires radio-induites et de déterminer une stratégie thérapeutique la plus adaptée possible. La seconde partie de ce travail a été consacrée à l'évaluation de la faisabilité d'une autogreffe de CSMM dans le modèle murin d'irradiation précédemment établi en répondant à deux pré-requis : la rétention des cellules injectées au niveau du tissu cible et l'évaluation de la greffe sur le métabolisme osseux. Cette investigation préclinique sur un modèle murin a permis de réaliser une étape essentielle dans l'évaluation du traitement des lésions tissulaires radio-induites par thérapie cellulaire. Les données issues de ces travaux pourraient à terme permettre la mise en place d'études cliniques. / Radiation therapy induced acute and late sequelae within healthy tissue included in the irradiated area. In general, lesions are characterized by ischemia, cell apoptosis and fibrosis. In this context, cell therapy using bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) might represent an attractive new therapeutic approach, based partly on their angiogenic ability and their involvement in the natural processes of tissue repair. The first part of this work consisted in the development of experimental mouse model of radio-induced tissue degeneration similar to that occurring after radiotherapy. The aim was to better understand the physiopathological mechanisms of radiation-induced tissue damage and to determine the best treatment strategy. The second part of this work investigated the feasibility of autologous BMSC therapy on the murine model of radiation previously established with emphasis on two pre-requisites : the retention of the injected cells within the target tissue and the evaluation of the graft on bone metabolism. This preclinical investigation in a mouse model constitutes an essential step allowing an evaluation of the benefit of cell therapy for the treatment of radiation-induced tissue injury. Data from these studies could allow the proposal of clinical studies.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) issues de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical sont immuno-privilégiées et immunosuppressives. Dans le cadre d’une utilisation en ingénierie vasculaire, la persistance de ces propriétés après différenciation endothéliale a été explorée. La différenciation a été induite par ensemencement des CSM-GW sur des films multicouches de polyélectrolytes en présence du milieu EGM-2. L’immunogénicité des cellules endothéliales-« like » (CEL) a été vérifiée en évaluant l’expression de 2 marqueurs immunologiques HLA-DR et CD86. Afin d’évaluer l’effet immunosuppresseur des CSM-GW avant et après différenciation, celles-ci ont été cultivées en premier lieu en présence de cellules mononucléées stimulées en contact cellulaire direct ou séparées, puis avec des cellules Natural Killer (NK) et lymphocytes T (LT). Les résultats ont montré que les CEL expriment les marqueurs endothéliaux, n’expriment pas HLA-DR et CD86 et qu’elles inhibent la prolifération des différentes populations immunitaires selon un mécanisme dépendant de facteurs solubles tels que IDO, les IL-6 et -1β et de la PGE2, et de contacts cellulaires. La co-culture de LT avec les CEL a induit l’apparition d’une population de LT régulateurs de manière similaire aux CSM-GW. La co-culture des cellules NK en présence de CEL a induit une diminution du récepteur activateur NKG2D et a aussi induit un transfert du CD73 à leur surface, suggérant leur capacité à produire de l’adénosine, un puissant immunosuppresseur. Les CEL maintiennent le caractère immunoprivilégié et immunosuppresseur des CSM-GW, suggérant leur possible utilisation en ingénierie vasculaire / Umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) are immune-privileged and immunosuppressive. Our study sought to determine the effect of endothelial differentiation on the immunomodulatory capacities of WJ-MSC. Endothelial-like cells (ECL) differentiation was performed by seeding MSC on polyelectrolyte multilayer films as substrate and stimulating them by EGM-2 culture medium. The expression of two immunological markers HLA-DR and CD86 was followed during the differentiation time. The effect of co-culture with ELC or MSC either in contact or separated by a transwell on different immune cells (peripheral blood mononuclear cells, T Lymphocytes (LT), Natural Killer (NK) cells) was assessed by evaluating immune cells proliferation. The results showed that ELC expressed endothelial markers, expressed low level of HLA-DR and CD86 and inhibited the proliferation of the different immune cell populations, and this inhibition is thought to be mediated by soluble factors as IDO, IL-6, IL-1β and PGE2, and by direct cellular contact. We reported also the capacity of ELC to generate a population of regulatory T cells and to decrease the expression of activating receptor NKG2D by NK cells. Moreover, we demonstrated that co-cultures with ELC induce CD73 expression on NK cells, a mechanism that may induce adenosine (a potent immunosuppressor) secretion by NK cells. Thus, ELC maintain the hypo-immunogenic and immunosuppressive characters of WJ-MSC suggesting their possible use in vascular engineering

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse ont été intensivement étudiées pour leur capacité de régénération et leurs propriétés immunomodulatrices. Beaucoup d’études ont montré que la thérapie qui utilise les CSM améliore les fonctions de tissu ostéo-articulaire particulièrement le cartilage en vue de leur capacité de différenciation en chondrocytes. Les CSM présentent un certain nombre d'avantages pour la médecine régénérative, ces cellules peuvent être facilement isolées et multipliées en culture pour obtenir un nombre approprié pour la thérapie cellulaire. De plus, elles ont une faible immunogénicité, ce que les rende aptes à la transplantation allogénique. Depuis les années 1960, de nombreuses études ont souligné les propriétés médicinales des polysaccharides notamment les β-glucanes qui ont une place particulière du fait de leurs effets immunostimulants. L’objectif de notre travail était de mettre en évidence les capacités d’un β-glucane particulier, la laminarine, sur la prolifération et la différenciation des CSM dans la perspective d’applications dans l’arthrose. Les CSM ont été cultivés dans les milieux de croissance et de différenciation chondrocytaire. La viabilité et l'apoptose des cellules ont été explorées par le comptage, les tests MTT et la coloration à l'annexine V. En outre, l'analyse des protéines spécifiques de la prolifération a été effectuée par le western blott. De plus, l'expression des marqueurs spécifiques des CSM et des chondrocytes a été étudiée à l'aide de la RT-qPCR et de l’immunofluorescence. Nos résultats ont démontré que la stimulation des CSM à la laminarine avec la dose de 1 mg/ml soit en condition de culture de croissance basique ou en chondrogenèse a inhibé la prolifération des cellules sans induire leur apoptose. Encore, dans les conditions de culture chondrogénique, la laminarine à une dose similaire a empêché la différenciation des CSM en chondrocytes. / Mesenchymal stems cells (MSCs) are a population of multipotent cells residing in several readily available adult tissue compartments, thus allowing for their ex vivo expansion. MSCs have a reliable potential for differentiation (plasticity) into cells of the mesodermal lineage (chondrocytes, osteoblasts, adipocytes). Bone marrow-derived MSCs have been a focus of stem cell research in light of their relative ease of isolation and expansion and of their high potential for differentiation. Herein, the aim of the present PhD is to explore the potential of a β-glucan (laminarin) on Mesenchymal stem cell proliferation and differentiation for future benefit for osteoarthritis treatment. MSCs were cultured in MSC growth and chondrogenic differentiation mediums. Cells viability and apoptosis were explored by cell count, MTT assays and Annexin V staining. In addition, Analysis of the specific protein of cell proliferation was performed by western blott. Furthermore, mRNA and protein expression of specifics markers for MSCs and chondrocytes were studied using qPCR and immunofluorescence. Our results demonstrated that stimulation of MSC with laminarin at a dose of 1 mg/ml in either basic growth culture or chondrogenesis inhibited cell proliferation without inducing their apoptosis. Furthermore, under chondrogenic culture conditions, laminarin at a similar dose prevented the differentiation of MSC into chondrocytes.

L’accident vasculaire cérébral (AVC) représente une des plus importantes causes d’handicap acquis de l’adulte. A l’heure actuelle, après les premières heures de l’AVC, aucun traitement efficace en dehors de la rééducation n’est disponible, renforçant l’importance de la recherche des traitements alternatifs. La thérapie de reperfusion à la phase aigüe est conditionnée par une détection et une prise en charge très précoce. Pour cette raison, seulement environ 10% des patients peuvent en bénéficier. L’application des nouvelles techniques d’imagerie cérébrale peut être de grande utilité dans la compréhension des mécanismes de l’ischémie aiguë et l’identification des candidats potentiels à la reperfusion. Dans le cadre de notre première étude dans un modèle expérimental d’ischémie cérébrale chez le rat (par occlusion de l’artère cérébrale moyenne oACM), nous avons caractérisé les altérations micro-vasculaires, hémodynamiques et la saturation locale en oxygène (StO2) à la phase aigüe de l’AVC (dans la première heure) par IRM multiparamétrique. Les résultats de cette étude ont montré le potentiel de la cartographie par IRM de la StO2 dans la détection du cœur ischémique sans l’inclusion d’aucune zone potentiellement récupérable.Au-delà de la phase aigüe, le réel besoin de disposer de thérapies avec une fenêtre thérapeutique plus étendue s’impose. La thérapie cellulaire présente un potentiel dans le traitement de l’AVC. La thérapie cellulaire semble promouvoir une réduction du handicap après un AVC par des mécanismes de neuroprotection et de régénération du tissu cérébral. Malgré ces résultats encourageants, l’importante mort cellulaire quand les cellules exogènes sont administrées dans la cavité de l’infarctus doit être améliorée. Nous avons évalué un biomatériau hydrogel in vivo et son potentiel à protéger les cellules greffées à long terme. Dans notre étude pilote chez le rat sain, nous avons démontré que l’hydrogel à base d’acide hyaluronique (HA) HyStemTM-HP (Sigma-Aldrich, France) pouvait rester dans le tissu cérébral pendant 28 jours sans être dégradé, ce qui représente une protection potentielle pour des cellules greffées.La greffe intracérébrale de HA combinée à des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) issues de la moelle osseuse), 7 jours après l’oACM, a favorisé la survie cellulaire et a augmenté les marqueurs angiogéniques. Les cellules RECA1+ (marqueur des cellules endothéliales vasculaires) ont été augmentées. Les cellules Collagen-IV+ (membrane basale des vaisseaux) étaient également augmentées par le traitement. L’angiogenèse est un processus clé dans la récupération post-AVC. Malgré ces effets pro-angiogéniques bénéfiques, aucun des traitements (CSMh+HA ou CSMh seules) n’a permis une récupération fonctionnelle 3 semaines après l’injection (évaluation par deux test sensori-moteurs: échelle d’évaluation neurologique (mNSS) et test du retrait d’adhésif). / As the leading cause of disability in adulthood, stroke remains an important subject of study because no effective treatments except by rehabilitation are currently available after the first hours. The acute phase therapy reperfusion is conditinated to a rapid detection and management. For this reason, just around 10% of patients benefit of this. The application of new brain imaging techniques can be relevant for the comprehension of acute stroke mechanism and for a more accurate identification of candidates for acute phase reperfusion therapies. In our first study in a rat model of ischemic stroke (by occlusion of middle cerebral artery, MCAo) we characterized the microvascular, hemodynamic and local saturation in oxygen (StO2) alterations in the acute phase (around one hour after stroke onset), using multiparametric MRI. We demonstrated the potential of StO2 MRI map for detecting the ischemic core without the inclusion of any reversible ischemic damage.Therapeutic approaches that can be applied beyond acute phase are urgently needed. Most evidences suggest that cell therapies have the potential to reduce post-stroke disability through neuroprotection and brain remodelling mechanism. Despite of beneficial effects were demonstrated, some issues need to be addressed, such as the important loss of grafted cells reported when cells are administrated into infarct cavity. We evaluated an innovating biomaterial hydrogel in vivo and their potential to promote long term protection of grafted cells. In a pilot study, we demonstrated that hyaluronic acid-based hydrogel (HA) HyStemTM-HP (Sigma-Aldrich, France) presented a long lasting (over 28 days) in healthy brain suggesting to be a good candidate for cell therapy.When co-administrated by intracerebral route combined with human Mesenchymal Stem Cells (hMSC from bone marrow) seven days after MCAo, the HAhydrogel promoted an increase of hMSC survival and improved angiogenic process. In the immunohistological study, RECA1+ (vessel endothelial cells makers) were increased. Collagen-IV+ cells (vessel basal membrane) were also increased. Post stroke angiogenesis is a key process for brain recovery. No difference in lesion volume was detected among the ischemic groups by in vivo MRI. Despite the pro-angiogenic beneficial effect, neither hMSC+HA nor hMSC alone were able to improve functional results 3 weeks after intracerebral injection (assessed by modified neurological severity score (mNSS), and adhesive removal test).

L’arthrose est une maladie ostéoarticulaire fréquente et sans traitement curatif. Elle se manifeste par une dégénérescence du cartilage, associée à une altération des autres tissus de l’articulation. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent un effet thérapeutique. Afin d’identifier de nouveaux médiateurs de l’homéostasie articulaire, nous avons analysé le secrétome des CSM en nous focalisant sur les membres de la famille du facteur de croissance transformant β (TGFβ), une voie centrale dérégulée dans l’arthrose.Cette approche nous a permis d’identifier la protéine induite par le TGFβ (TGFβI ou βIGH3), pour laquelle nous avons évalué le rôle dans la différenciation des CSM et comparé l’expression dans les tissus articulaires de patients arthrosiques et de sujets sains.Nous montrons l’importance du TGFβI dans la régulation des processus de différenciation osseuse et chondrogénique des CSM. Nous mettons également en évidence une dérégulation au niveau transcriptionnel et protéique de ce facteur dans le cartilage, l’os sous-chondral ainsi que les CSM de patients arthrosiques. En testant son implication dans l’effet thérapeutique des CSM sur des modèles d’arthrose in vitro et in vivo, nous montrons que la diminution de son expression dans les CSM annule leur effet thérapeutique dans les modèles d’arthrose. Cet effet chondroprotecteur du TGFβI est associé à une inhibition du remodelage osseux et de la calcification des tissus mous articulaires.L’ensemble de nos résultats démontrent l’importance de la régulation de la voie TGFβ, et plus particulièrement du TGFβI, dans l’homéostasie articulaire. En parallèle, nos travaux illustrent le rôle de ce facteur dans l’effet thérapeutique des CSM, et suggèrent que l’altération de son expression dans les CSM de patients arthrosiques soit à l’origine d’une diminution de leur potentiel régénératif. / Osteoarthritis (OA) is the most common form of joint diseases without curative treatments. The disease is mainly characterized by the degradation of articular cartilage which is associated with other pathological changes in joint tissues. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have demonstrated a therapeutic effect. In order to identify new mediators involved in articular homeostasis, we analyzed MSC secretome, focusing on the transforming growth factor β (TGFβ) members, a central pathway dysregulated in OA.This approach allows us to identify the TGFβ induced protein (TGFβI or βIGH3). In the present study, we evaluated its role in the differentiation of MSC and compared its expression in articular tissues from OA patients and healthy donors.We highlight the importance of TGFβI in the regulation of differentiation of MSC towards bone and cartilage. We also demonstrate its dysregulation at both transcript and protein level in cartilage, bone and MSC from OA patients. We then evaluated its role in the therapeutic effect of MSC in vitro and in vivo and demonstrated that its decreased expression in MSC is associated with a loss of their therapeutic effect in OA models. The chondroprotective effect of TGFβI is associated with an inhibition of bone remodeling and calcification of soft articular tissues.Together, our results highlight the importance of the TGFβ pathway, and specially of TGFβI regulation, in joint homeostasis. Moreover, our work demonstrates its role in the therapeutic effect of MSC, suggesting that its dysregulation in OA MSC could lead to a decreased regenerative potential.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie rare et incurable, caractérisée par une fibrose cutanée et la production d’auto-anticorps (maladie auto-immune). Le pronostic vital est engagé dans les formes diffuses et rapidement progressives de la maladie, responsables de fibrose pulmonaire. Par leurs propriétés immunomodulatrices et anti-fibrotiques, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) constituent une approche prometteuse pour traiter la ScS. Ce travail a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique des CSM dans un modèle préclinique de forme diffuse de la maladie (d-ScS).Patients et Méthodes : Nous avons évalué l’effet de différentes modalités d’injections des CSM par voie intraveineuse dans le modèle murin de ScS-HOCl. Ce modèle, basé sur l’injection d’acide hypochloreux (HOCl), induit un phénotype proche des formes d-ScS. Nous avons notamment comparé un traitement préventif et curatif, des approches syngénique, allogénique et xénogénique, et l’utilisation de CSM d’origine adipocytaire (ASC) à celle de CSM de moelle osseuse (CSM-MO).Résultats : Le modèle ScS-HOCl est caractérisé par l’installation d’un phénotype de d-ScS, avec fibrose cutanée, pulmonaire et production d’anticorps anti-topoisomérase 1. Nous montrons l’effet bénéfique d’une injection préventive ou curative de CSM syngéniques, réduisant la fibrose cutanée et pulmonaire. Cet effet thérapeutique passe par une diminution de la réponse immune réduisant l’inflammation tissulaire et la production d’auto-anticorps, ainsi que par l’induction du remodelage tissulaire via l’activation de métalloprotéases, et l’augmentation des défenses anti-oxydantes. Un bénéfice similaire est obtenu lors d’approches allogénique et xénogénique. Les ASC présentent des capacités immunosuppressives et de remodelage supérieures aux CSM-MO.Discussion et conclusion : Nos travaux démontrent l’effet anti-fibrotique des CSM dans un modèle préclinique pertinent de ScS, mimant les formes diffuses et rapidement progressives de la maladie, pour lesquelles les besoins thérapeutiques sont importants. Le mode d’action pléiotropique des CSM, combinant propriétés anti-inflammatoires, pro-remodelage et anti-oxydantes, est prometteur en vue des applications cliniques à venir dans cette maladie.Mots-clés : sclérodermie systémique, cellules souches mésenchymateuses, HOCl / Systemic sclerosis (SSc) is a rare intractable disease characterized by skin fibrosis and autoimmunity. Diffuse and rapidly progressive SSc (d-SSc) is associated with life-threatening involvements such as lung fibrosis, where there still is an unmet medical need. Displaying immunomodulatory and antifibrotic properties, mesenchymal stem cells (MSC) are an attractive cure for SSc. In this study, we aim at evaluating the therapeutic potential of MSC in a preclinical model of d-ScS.Patients and Methods: We evaluated the effects of MSC infusion in the murine model of ScS-HOCl, based on repeated injections of hypochlorite (HOCl). We compared several approaches using MSC in a preventive and curative approach, in syngeneic, allogeneic and xenogeneic settings, and using MSC isolated from adipose tissue (ASC) or bone marrow (BM-MSC).Results: ScS-HOCl is close to d-ScS phenotype, leading to skin and lung fibrosis, together with anti-topoisomerase 1 antibody production. We show beneficial effects of a preventive or curative injection of syngeneic MSCs, reducing tissue fibrosis. Fibrosis reduction following MSC treatment involves immunosuppressive effects, tissue remodeling via metalloprotease activation, and anti-oxydant activity. Similar benefits are observed in allogeneic and xenogeneic settings. ASC display greater immunosuppressive and remodeling capacities than BM-MSCs.Discussion and conclusion: Our study demonstrates the anti-fibrotic effects of MSCs in a relevant preclinical model of ScS, mimicking diffuse and rapidly progressive ScS. Pleiotropic capabilities of MSCs, combining anti-inflammatory, remodeling and antioxidant properties, are promising for future clinical applications in this disease.Keywords: systemic sclerosis, mesenchymal stem cells, HOCl

Le glaucome est une neuropathie optique associée à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO). L’élévation de la PIO est due à la dégénérescence progressive du trabéculum. Les traitements antiglaucomateux vise à réduire la PIO, cependant il n’existe aucun traitement ciblant la dégénérescence du trabéculum. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) sont utilisées comme outils thérapeutiques dans différentes pathologies dégénératives. Elles sécrètent un panel de molécules qui sont décrit comme atténuant les processus dégénératifs. L’objectif de ce travail a été d’évaluer l’intérêt des CSMs dans la prise en charge du glaucome. La caractérisation des CSMs ont été mis au point à partir de culture primaire de moelle osseuse de rat. En parallèle, un modèle expérimental de glaucome par cautérisation des veines épisclérales (EVC) a été réalisé. Nous nous sommes intéressés à l’effet de l’injection intracamérulaire des CSMs dans ce modèle. Les CSMs sont retrouvées incorporées aux tissus autour et dans le trabéculum. Les résultats obtenus in vivo montrent une diminution de la PIO par l’injection des CSMs préservant ainsi les cellules ganglionnaires périphériques de la rétine (CGRs). Par une approche in vitro, nous avons également caractérisé les effets du sécrétome des CSMs sur les cellules impliquées dans la pathologie glaucomateuse: les cellules trabéculaires et les cellules ganglionnaires de la rétine. Ces résultats ont permis de montrer que l’injection intracamérulaire de CSMs permettrait de protéger la fonction de régulation de la PIO et de protéger les CGRs dont la mort est responsable de la diminution de l’acuité visuelle chez le patient glaucomateux. / Glaucoma is a sight-threatening retinal neuropathy associated with elevated intraocular pressure (IOP) due to degeneration and fibrosis of the trabecular meshwork (TM). Glaucoma medications aim to reduce IOP without targeting the specific TM pathology, which could explain treatment failure observed in some cases. Bone-marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are used today in various clinical studies to treat various degenerative processes. Here, we investigated the potential of MSC therapy in an ocular hypertension model. We demonstrated a rapid and long-lasting in vivo effect of MSC transplantation that significantly reduced IOP in hypertensive eyes induced by episcleral vein cauterization (EVC). MSCs were found located to the ciliary processes and the TM and are able to survive at these places. Enumeration of retinal ganglion cells (RGCs) on whole flat-mounted retina highlighted a protective effect of MSCs on RGC death. In vitro, the effect of MSC-conditioned medium (MSC-CM) on both the primary human trabecular meshwork (hTM) and RGCs showed that MSC-CM promotes: (i) hTM survival by activating the antiapoptotic pathway, Akt, (ii) hTM decontractibility as analyzed by the decrease in myosin phosphorylation and (iii) inhibition of TGF-β2-dependent profibrotic phenotype acquisition in hTM, (iiii) RGC survival and neuritic outgrowth in vitro. Finally, MSCs injection in the ocular anterior chamber in a rat model of ocular hypertension provides a neuroprotective effect in the glaucoma pathophysiology directly on RGC and indirectly via TM protection. These results originally demonstrate that MSCs represent promising tool for treating ocular hypertension and retinal cell degeneration.

Le cartilage articulaire est un tissu possédant une faible capacité de réparation intrinsèque. Dès lors, la répétition de traumatismes articulaires induit un microenvironnement propice à la dégradation du cartilage et, in fine, l’émergence de l’arthrose. Les traitements utilisés à l’heure actuelle visent uniquement à soulager la douleur, réduire l’inflammation et la progression de l’arthrose. Ainsi, le traitement des lésions chondrales équines revêt une importance majeure puisque les affections locomotrices constituent la première cause de baisse de performances et d’arrêt prématuré de la carrière du cheval sportif. De plus, le cheval est le modèle animal qui possède le cartilage articulaire le plus semblable à celui de l’Homme et, en conséquence, représente un modèle d’étude pertinent pour les lésions chondrales humaines. Dans ce contexte, notre étude s’est attachée à développer de nouvelles stratégies pour le traitement des lésions chondrales basées sur la différenciation chondrogénique de CSM en vue de produire in vitro un substitut cartilagineux implantable en site articulaire. Ainsi, nous avons d’abord isolé et caractérisé des CSM équines à partir de prélèvements de moelle osseuse (MO) et de sang de cordon ombilical (SCO), puis, nous avons réalisé la différenciation en cultivant les CSM durant 14 jours en hypoxie ou normoxie au sein d’un biomatériau (éponges de collagène de types I/III), en présence de BMP-2 et TGF-β1 et de siRNA ciblant le collagène de type I et HtrA1, molécules atypiques du cartilage hyalin. Bien que ce protocole nous ait permis d’obtenir un substitut cartilagineux riche en marqueurs du cartilage hyalin comme le collagène de type II et l’agrécane, la présence du collagène de type I persistait. Nous avons donc tenté d’optimiser le protocole en allongeant le temps de culture, en utilisant le TGF-β3, et en modifiant la stratégie d’interférence par l’ARN. Cette étape nous a permis de conclure sur l’effet bénéfique de l’allongement de la culture à 28 jours et l’efficacité des facteurs chondrogéniques initialement utilisés. Néanmoins, la stratégie d’interférence par l’ARN demeure encore perfectible. Finalement, nous avons comparé la qualité du substitut cartilagineux obtenu après différenciation en fonction de la source de CSM utilisée. Les CSM de MO semblent les plus adaptées mais le protocole que nous avons utilisé n’est probablement pas le plus efficace pour induire la différenciation des CSM de SCO. Dans une partie complémentaire, bien que ces résultats soient préliminaires, nous avons montré que le sécrétome des CSM pourrait être un formidable outil afin d’améliorer le traitement des lésions chondrales. Dans leur ensemble, les résultats obtenus permettent d’avoir un regard optimiste concernant la mise en place de thérapies cellulaire et tissulaire du cartilage, aussi bien en médecine équine qu’humaine. / Articular cartilage is a tissue with low intrinsic repair abilities. Therefore, repeated traumas lead to cartilage degradation and ultimately, to the emergence of osteoarthritis (OA). Current therapies aim to reduce pain, inflammation and to prevent the progression of OA. Thus, treatment of equine chondral lesions is of major importance since locomotor disorders are the main causes of poor performance and early retirement of the athlete horses. In addition, the horse is an animal model with the most human-like articular cartilage and, therefore, represents the best relevant model to study human chondral lesions and arthropathies. In this context, our study focused on developing new strategies for the treatment of chondral lesions based on the chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells (MSC) in order to produce an in vitro neo-synthetized cartilaginous substitute, which could be implantable in the chondral lesion site. Thus, we first isolated and characterized equine MSC derived from bone marrow (BM) and umbilical cord blood (UCB). Then, we have differentiated MSC by culturing them for 14 days in hypoxia or normoxia, in a biomaterial (types I / III collagen sponges), in the presence of BMP-2 and TGF-β1 and siRNA targeting type I collagen and HtrA1, two atypical hyaline cartilage molecules overexpressed in OA. Although this protocol allowed us to obtain a cartilaginous substitute composed of large amounts of hyaline cartilage markers such as type II collagen and aggrecan, the presence of type I collagen persisted. We therefore tried to optimize the protocol by extending the culture time, using TGF-β3, and modifying the RNA-interference strategy. We have concluded on the beneficial effect of the lengthening of the culture to 28 days and the effectiveness of the chondrogenic factors initially used. Nevertheless, the RNA-interference strategy still remains perfectible. Finally, we compared the quality of the neo-synthetized cartilaginous substitute according to the source of MSC used. BM-MSC seem to be the most suitable, but the protocol we used is probably not the most effective for inducing UCB-MSC differentiation. In a complementary part, although these results are very preliminary, we have shown that the MSC secretome could be a tremendous tool to improve current therapies of chondral lesions. Overall, the results obtained make it possible to look ahead with optimism, in order to obtain future efficient cartilage tissue engineering therapies, both in equine and human medicines.

Introduction : Les cellules souche mésenchymateuse (CSM) présentent une puissante activité immunomodulatrice sur les lymphocytes T et les Natural Killer (NK), impliquées dans les réactions allogéniques. Les propriétés immunomodulatrices des CSM dépendent de contacts cellulaires et des facteurs secrétés. Ainsi les exosomes produits par ces cellules pourraient constituer des nouveaux produits thérapeutiques.L’objectif de ce travail est d’étudier, in vitro, l’effet d’exosomes dérivés de CSM sur les lymphocytes B, T et les NK.Méthodologie : Les CSMs utilisées sont issues de foies fœtaux humains. Les exosomes ont été isolés à partir du milieu de culture des CSMs par une série d’ultracentrifugation à 100000g.Résultats : Contrairement aux CSMs qui inhibent la prolifération des lymphocytes T et B, leurs exosomes n'ont pas d'effet sur leur prolifération. Cependant ils inhibent la prolifération, l’activation et la cytotoxicité (expresion CD107a) des NK. Nous avons mit en évidence, par FACS, la présence de TGFbeta; à la surface des exosomes. De plus leur fonction inhibitrice est abrogé en présence d’un anticorps bloquants anti-TGFbeta;. Réciproquement l’exposition de cellules NK à du TGFbeta; inhibe la cytotoxicité et la prolifération de cellules. Enfin, en présence d'exososmes nous avons montré, par IF, une translocation de Smad 2/3 (messager du signal TGFbeta;) dans les noyaux des cellules NK, inhibé par l'ajout d'anticorps anti-TGFbeta;.Conclusion: Ces résultats suggère que les propriétés immunomodulatrices de CSMs sur NK pourraient dépendre de TGFβ présenté ou associé aux exosomes. / Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) are powerful immunomodulators regulating the function of B and T lymphocytes and natural killers cells (NK) involved in allogeneic reactions. Their immunomodulatory properties depend on cell contact and secretion factors produced by MSCs. Thus exosomes produced by these cells could provide new therapeutic tools.Objective: The objective of this work is to study the effect of MSC derived exosomes in vitro on B and T lymphocytes and NK cells.Method: MSCs used for this study are isolated from human fetal liver. Exosomes were isolated from MSC culture medium by a serie of ultracentrifugation at 100000g.Results: MSCs inhibit the proliferation of T lymphocytes. Unlike MSCs, their exosomes do not abrogate the proliferation of T and B cells. However they inhibit the proliferation, activation and cytotoxicity (CD107a expression) of NK cells. By FACS analysis we showed a surface expression of TGFb; by exosomes. Inhibition of NK cells activation by exosomes is altered by a neutralizing anti-TGFb; antibody. Contrary when NK cells are cultured with TGFb; the same effect qs exosomes is demonstrated. By IF, we found a nuclear translocation of Smad 2/3 (TGFb; signal transducer) in NK cells cultured with exosomes, which is inhibited by the qddition of anti-TGFb; antibody.Conclusion: These results suggest that the immunomodulatory properties of MSCs on NK could depend on exosome presentation or association with TGFb;.