Dans le domaine de l'ingénierie du cartilage, les hydrogels à base d'alginate (Alg) et de cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont utilisés comme biomatériaux pouvant être utilisés pour combler des lésions cartilagineuses plus ou moins profondes. Cependant, pour reproduire l’organisation zonale du cartilage, des biomatériaux multiphasiques sont nécessaires. Afin de guider la différenciation des CSM dans les différentes strates du biomatériau, sans apports de facteurs de croissance, des composants naturels du cartilage (acide hyaluronique, HA) ou de la matrice osseuse (hydroxyapatite, Hap) peuvent être ajoutés à l’alginate. L’objectif de ce travail de thèse consiste à analyser l’impact de la composition de biomatériaux à base d’alginate enrichi soit en HA soit en Hap sur le comportement des CSM. La première partie de notre travail à consister à évaluer le comportement des CSM issues de la gelée de Wharton dans ces hydrogels. Nos résultats mettent en évidence que les hydrogels d’Alg/Hap possèdent non seulement de meilleures propriétés mécaniques que les hydrogels Alg/HA et favorisent la viabilité des CSM ainsi que leur différenciation par rapport aux CSM ensemencées dans un hydrogel d’Alg/HA. La méthode de stérilisation du biomatériau représente une étape incontournable, dont on doit impérativement évaluer les multiples effets, en particulier pour ce qui touche au comportement des cellules, mais aussi au maintien de l’intégrité des propriétés physicochimiques de l'hydrogel. Ainsi, dans une seconde partie du travail, nous avons montré que le traitement de stérilisation par autoclave induisait un effet négatif sur les caractéristiques initiales de l'hydrogel à base d'alginate. Il ressort également de cette investigation sur les modes de stérilisation, que la stérilisation des hydrogels avec des UV est plus efficace et permet de préserver au mieux les propriétés spécifiques de l'hydrogel, notamment de l’Alg/HA. Enfin, dans une troisième partie de notre travail, nous avons évalué l’évolution des propriétés mécaniques au cours de la différenciation et l’impact de celles-ci sur la différenciation des CSM ainsi que sur leurs propriétés immunomodulatrices. À partir de ces résultats, nous avons montré que les caractéristiques physico-chimiques des hydrogels d’Alg/ha et Alg/hap influençaient non seulement le potentiel de différenciation des CSM-GW mais également la sécrétion des facteurs solubles impliqués dans l’immunomodulation. Ces propriétés physico-chimiques étant influencées dès le procédé de stérilisation, il est alors conseillé de les prendre en compte dans toutes les étapes de l’ingénierie tissulaire / In the field of cartilage engineering, alginate (Alg)-based hydrogels and mesenchymal stem cells (MSC) are widely used as raw biomaterials and stem cells which can be used to fill cartilage lesions of varying depth. However, to reproduce the zonal organization of articular cartilage, a graft multilayer is necessary. In order to guide the differentiation of MSCs in different strata of the biomaterials, without input of growth factors, natural cartilage components (hyaluronic acid, HA) or bone matrix (hydroxyapatite, Hap) can be added into the alginate. The aim of this work is to analyze the impact of the composition of alginate enriched either in HA or in Hap on the behavior of MSCs. The first part of our work is to evaluate the behavior of WJ-MSCs into these hydrogels. Our results have shown that Alg/ Hap hydrogels not only possess better mechanical properties than Alg/HA hydrogels, but also promote the viability of MSCs and their differentiation from MSC seeded into the Alg/HA hydrogel. The sterilization method of biomaterial is an essential step, the multiple effects of which must be evaluated, in particular as regards the behavior of the cells, but also to maintain the integrity of the physicochemical properties of hydrogel. Thus, in a second part of this work, we showed that the autoclave sterilization treatment induced a negative effect on the initial characteristics of alginate hydrogel. It is also apparent from this investigation of the sterilization modes that the sterilization of hydrogels with UV is more efficient and makes it possible to preserve the specific properties of the hydrogel as best as possible, in particular Alg/HA. Finally, in a third part of our work, we also evaluated the evolution of the mechanical properties during the differentiation and the impact of these on the differentiation of MSCs and their immunomodulatory properties. From these results, we have shown that the physico-chemical characteristics of Alg / ha and Alg/hap hydrogels influence not only the differentiation potential of WJ-MSC but also the secretion of soluble factors involved in immunomodulation. Since these physicochemical properties are influenced by the sterilization process, it is advisable to take them into account in all stages of tissue engineering

La thérapie cellulaire suscite de grands espoirs dans le domaine cardiovasculaire. Cependant les premières études humaines sont décevantes. Parmi les explications avancées, citons un mauvais choix de cellules, une méthode de délivrance inadéquate, une préparation des cellules et des tissus hôtes insuffisante ou une trop grande mortalité cellulaire après injection.Durant ce travail nous avons voulu explorer 3 pistes d’optimisation de la thérapie cellulaire à visée pro-angiogénique utilisant les cellules souches mésenchymateuses (MSC) et contribué à l’exploration des mécanismes mis en jeu, en particulier en explorant le rôle du système Wnt/Frizzled.Nous avons tout d’abord étudié un système original de délivrance de cellules utilisant un « patch » musculaire cousu en regard d’un myocarde infarci de souris. Puis nous avons étudié l’effet d’une surexpression de sFRP1, inhibiteur de la voie Wnt, sur un modèle de matrice sous cutanée. Enfin, nous avons testé l’hypothèse qu’un préconditionnement hypoxique des cellules permettrait une meilleure survie cellulaire et améliorerait la réparation vasculaire et tissulaire après ischémie de patte chez la souris.Nos résultats permettent notamment de montrer que les MSC ont des capacités d’invasion des tissus ischémiques et qu’elles se différencient en péricytes en formant un réseau tridimensionnel de soutien aux cellules endothéliales. Par ailleurs, via sFRP1, nous mettons en évidence un rôle du système Wnt/Fzd dans l’effet pro-angiogénique. Enfin, nous montrons l’intérêt du préconditionnement hypoxique dont les effets sont médiés par Wnt4.L’ensemble de ces données permet d’envisager des voies d’optimisation de la thérapie cellulaire. / Some of the challenges facing stem-cell therapy for cardiac disease are which type of stem cell or progenitor cell is the best candidate for therapy, how to survive in the low oxygen environment of ischemic myocardium. Here we studied the potential of mesenchymal stem cells (MSCs) as vascular progenitor cells in vitro and in vivo, and we studied the effects of sFRP-1/Wnt signaling modulation or hypoxia on MSC properties. First, we demonstrated the beneficial effect of MSC application on ischemic heart repair using an original surgical model (patch) to deliver stem cells. This study showed that the contribution of the MSCs in the mouse infarcted myocardium was beneficial either on the scar (increase in angiogenesis, in cell proliferation, reduction in ventricular remodeling) or on the trophicity of the patch.Then we characterized the angiogenic properties of MSC in vitro and in vivo. Our data demonstrate that MSCs could be recruited and formed vascular structures around endothelial tubes. We showed in vivo that the surexpression of sFRP-1 (regulating factor of the Wnt system) in MSCs increased their potential of pericyte-like cells correlated with an increased maturation of the vessels via an intracellular GSK-3 dependent pathway in MSCs. Our next objective was to investigate the effects of hypoxia exposure on MSC before implantation for vascular and tissue regeneration in mice with hind limb ischemia. Our data suggest that hypoxic preconditioning has a critical role on MSC dynamic functions, shifting MSC location in situ to enhance ischemic tissue recovery, facilitating vascular cell mobilization and skeletal myoblast regeneration via a paracrine Wnt dependent mechanism.

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) de l’adulte constituent des affections sévères du poumon distal, avec un pronostic sombre pour les patients. A ce jour, aucun traitement n’est réellement efficace. De manière intéressante, une hypoxie alvéolaire est retrouvée dans ces pathologies.La thérapie cellulaire utilisant des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) pourrait représenter un intérêt thérapeutique chez l’Homme. Cependant, leurs mécanismes d’action sont multiples et encore mal définis. Aussi, nous avons testé in vitro l’hypothèse selon laquelle les CSMh pourraient exercer un effet cytoprotecteur paracrine sur les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) soumises à l’hypoxie.Dans une première étude, nous avons montré qu’une exposition prolongée à l’hypoxie telle que celle rencontrée au cours de la FPI induisait des modifications phénotypiques des CEA primaires de rat, évocatrices d’une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). On observe une perte progressive d’expression des marqueurs épithéliaux (TTF1, AQP5, ZO-1 et E-Cadhérine), couplée à l’apparition tardive de marqueurs mésenchymateux (α-SMA et Vimentine). Ces modifications phénotypiques s’accompagnent de l’expression dès les premières heures d’hypoxie de facteurs de transcription impliqués dans la TEM (SNAI1, TWIST1 et ZEB1) ou induits par l’hypoxie (HIF-1α et HIF-2α), et de protéines induisant la TEM (TGF-β1 et CTGF). La co-culture des CEA avec des CSMh en fond de puits prévient les modifications phénotypiques induites par l’hypoxie ainsi que l’expression des facteurs pro-TEM TWIST1, ZEB1, TGF-β1 et CTGF. Cet effet bénéfique des CSM est en partie expliqué par la sécrétion d’un facteur de croissance épithélial, le KGF.Dans une deuxième étude, nous avons confirmé que les CEA entraient en apoptose en condition hypoxique, via l’induction de deux voies de signalisations hypoxiques pro-apoptotiques. D’une part, les facteurs de transcription induits par l’hypoxie HIF sont stabilisés, et une cible pro-apoptotique, Bnip3, est induite. D’autre part, l’hypoxie induit une accumulation d’espèces réactives à l’oxygène délétère pour la cellule, perturbant l’équilibre redox de la cellule, endommageant l’ADN, et conduisant à l’apoptose. Cette accumulation pourrait résulter notamment d’une diminution de l’activité des enzymes anti-oxydantes SOD, en hypoxie. Le manque d’oxygène entraine également l’expression de CHOP, facteur de transcription pro-apoptotique impliqué dans le stress du réticulum endoplasmique, qui va13inhiber l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. Nous avons montré que la culture des CEA en présence de milieu conditionné de CSMh (mc-CSMh) permet de prévenir partiellement l’apoptose des CEA en hypoxie, en modulant la voie de signalisation HIF, et en prévenant l’accumulation et les effets délétères des ROS. L’effet protecteur des CSM impliquerait le KGF comme observé lors de la première étude, mais également le HGF.Ces deux études indiquent que les CSMh sont susceptibles d’exercer des effets cytoprotecteurs paracrines vis-à-vis des CEA soumises à l’hypoxie aiguë ou prolongée, en limitant d’une part les modifications phénotypiques évocatrices de TEM, et d’autre part l’apoptose des CEA via la modulation des voies de signalisations hypoxiques. La sécrétion par les CSMh de KGF et de HGF, facteurs de croissance épithéliaux connus pour leurs effets bénéfiques sur les CEA, explique en partie les effets protecteurs paracrines des CSMh. Nos résultats suggèrent que les effets cytoprotecteurs des CSMh vis-à-vis des CEA pourraient contribuer aux effets bénéfiques des CSMh observés in vivo dans différents modèles animaux de fibrose induite, ou lors d’agressions alvéolaires aiguës. / Acute or chronic alveolar injuries provoke massive apoptosis of alveolar epithelial cells (AEC) that compromises an efficient repair of the alveolar epithelium and leads to lung diseases such as ARDS or IPF. These disorders are commonly associated with local alveolar hypoxia aggravating their progression through the stimulation of AEC apoptosis. Administration of allogenic mesenchymal stem cells (MSCs) has been shown to limit lung inflammation and fibrosis in murine models of alveolar injury, through a still poorly understood paracrine mechanism. In a first study, we showed that long term exposure of AEC in hypoxia leads to phenotypic alterations which looks like epithelio-mesenchymal transition (EMT). Co-culture with MSCs prevent hypoxia-induced EMT.In a second work, we studied whether MSC could protect AEC from hypoxia-induced apoptosis and the mechanisms involved. hMSC-conditioned media (hMSC-CM) significantly reduced hypoxia-induced apoptosis of AEC. Such a anti-apoptotic effect was also obtained with ROS scavenger N-acetylcystein or HIF1a inhibitor YC-1. hMSC-CM decreased the protein expression of HIF1α and HIF2α and of their pro-apoptotic target Bnip3 in hypoxic AEC. hMSC-CM also reduced ROS accumulation in hypoxic AEC by enhancing the activity of anti-oxidant enzymes and prevented the induction of CHOP, a pro-apoptotic factor induced by ROS signaling. The paracrine effect of hMSC was partly dependent on KGF and HGF secretion. hMSC prevent via a paracrine effect hypoxia-induced apoptosis of AEC by modulating hypoxic and ROS signaling.These two studies show that MSCs exert cytoprotective effects in vitro against hypoxia-induced apoptosis and EMT in AEC

La castration représente le traitement de référence du cancer de la prostate à un stade avancé. Cependant, la plupart des patients rechute du fait notamment de l’émergence de variants tronqués constitutivement actifs du récepteur des androgènes (RA). Le microenvironnement tumoral, en particulier les fibroblastes associés au cancer (CAFs), favorisent largement la progression tumorale. Ils sont très hétérogènes et dérivent de plusieurs types cellulaires dont les cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Afin de mettre à jour l’impact des variants du RA sur le microenvironnement tumoral, mon projet de thèse a porté sur l’étude des effets de ces variants du RA sur la différenciation des MSCs en CAFs. Les résultats obtenus m’ont permis de démontrer un impact positif du variant RA Q641X sur l’expression du facteur de différenciation VEGF par les cellules tumorales, ainsi que sur l’expression des marqueurs de différenciation en CAFs FSP-1, CXCL12, PDGFR-β, ainsi que VEGF, au niveau des MSCs. Ces données suggèrent que le variant RA Q641X est capable d’induire la différenciation des MSCs en CAFs, soulignant ainsi l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces variants du RA. / Androgen ablation therapy remains the most common treatment for patients with advanced prostate cancer. However, most patients will relapse due to the emergence of truncated constitutively active androgen receptor (AR) variants. The tumor microenvironment is another necessary feature driving prostate cancer progression. Cancer associated fibroblasts (CAFs) are the major specialized stromal cells that favor tumor progression. These cells are very heterogeneous and derive from several other cell types as mesenchymal stem cells (MSCs). In order to highlight the impact of AR variants on surrounding tumor stroma, the aim of my project was to investigate the effects of these AR variants on MSCs differentiation into CAFs. I noticed that the expression of VEGF, a CAF differentiation factor, was upregulated in tumor cells expressing AR Q641X variant. Similarly, the expression of CAF differentiation markers FSP-1, CXCL12, PDGFR-β, and VEGF was enhanced in MSCs in presence of AR Q641X variant. These data highlight an unknown property of AR Q641X variant in prostate tumor cells that is its ability to induce MSCs differentiation into CAFs, underlining the urgent need to develop novel strategies targeting these AR variants.

Un traumatisme de la moelle épinière (TME) est une condition dévastatrice entraînant la perte permanente de fonctions neuronales. L’objectif de cette thèse est de formuler de microsupports pharmacologiquement actif (MPAs) avec une surface de fibronectine (FN), libérant le« brain-derived neurotrophic factor » (BDNF) de façon controlée. Nous voulons combiner ce système avec des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) pour la réparation de TME. Le BDNF nanoprécipité a été encapsulé dans les FN-MPAs et le profil de libération in vitro a été évaluée. Elle a montré une libération biphasique et prolongée de BDNF bioactifs. Nous avons combinés des cellules souches humaines mésenchymateuse issues de la moelle osseuse adulte (cellules MIAMI) et FN-MPAs avec un hydrogel non-toxique silanisés-hydroxypropylméthylcellulose (Si-HPMC). Nous avons démontré que les FN-MPAs et le Si-HPMC augmentait l'expression de marqueurs neuraux/neuronaux de cellules MIAMI après 1 semaine. En outre, l'environnement 3D (hydrogel ou FN-MPAs) a augmenté le sécrétome thérapeutique de cellules MIAMI. Pour avoir un système facile à appliquer en clinique, nous avons choisi d’utiliser les cellules souches de la papille apicale (SCAP) et FN-MPAs libérant ou non du BDNF pour la thérapie du TME. Plus de 90 % du SCAP complexée avec FN-MPAs (libérant ou pas BDNF) demeurent viables pendant 7 jours et il y a augmentation de l'expression des gènes neuronaux/oligodendrogliaux in vitro. La récupération de la fonction locomotrice a été significativement améliorée après la transplantation du SCAP complexée avec FN-MPAs-BDNF avec une coordination cohérente du membre postérieur après 28 jours de traitement. / Traumatic spinal cord injury (SCI) is a devastating condition resulting in permanent loss of neural functions. The objective of this thesis is to develop pharmacologically active microcarriers (PAMs) with a fibronectin (FN) surface that deliver biologically active brain derived neurotrophic factor (BDNF) in a controlled manner. We want to combine this system with adult mesenchymal stem cells (MSCs) for SCI repair. The nanoprecipitated BDNF was encapsulated in FN-PAMs and the in vitro release profile was evaluated. It showed a prolonged, bi-phasic, release of bioactive BDNF, without burst effect. We combined human marrow-isolated adult multilineage-inducible (MIAMI) stem cells and FN-PAMs with an injectable non-toxic silanized-hydroxypropylmethylcellulose (Si-HPMC) hydrogel. We demonstrated that FN-PAMs and the Si-HPMC hydrogel increased the expression of neural/neuronal differentiation markers of MIAMI cells after 1 week. Moreover, the 3D environment (FN-PAMs or hydrogel) enhanced the therapeutic MIAMI cell secretome. To have a clinically translatable system, we chose to use stem cells of the apical papilla (SCAP) and FNPAMs releasing or not BDNF for SCI therapy. More than 90% of SCAP complexed with FN-PAMs (releasing or not BDNF) remained viable for 7 days and an increased neuronal-oligodendroglial gene expression in vitro. The recovery of locomotor function was significantly improved after transplantation of SCAP complexed with FN-PAMs-BDNF with frequent to consistent forelimb-hindlimb coordination after 28 days of treatment.

Les cellules souches ont été présentées comme la clé d’une médecine régénératrice, où la réparation d’un organe, la guérison de maladies dégénératives et la création de nouveaux tissus seraient des objectifs réalisables à court ou moyen terme. Les cellules souches isolées chez un adulte ont un certain degré de spécialisation limitant leur potentiel à leur organe d’origine. Mais l’une d’elles, la cellule souche mésenchymateuse (MSC), possède une versatilité qui en fait une candidate idéale pour plusieurs traitements. Il est communément accepté que les MSC exercent leur effet grâce à la production de facteurs solubles. Toutefois, leur mécanisme d’action reste jusqu’à maintenant imprécis. Ces facteurs ayant le potentiel d’agir dans plusieurs maladies dégénératives, nous avons voulu évaluer leur effet régénératif dans l’une des maladies oculaires les plus répandues, le glaucome à angle ouvert. Cette maladie est caractérisée par une destruction des cellules ganglionnaires de la rétine suite à une élévation de la pression intraoculaire. Cette hausse de pression est souvent engendrée par une dysfonction du trabéculum, le tissu régulant la sortie de l’humeur aqueuse de l’œil. Actuellement, la progression du glaucome peut être contrôlée, mais la maladie ne peut pas être guérie. Or la régénération du trabéculum pourrait arrêter la progression de la maladie et même renverser le processus. Ainsi, l’objectif de cette thèse était de vérifier si les MSC ont le potentiel de favoriser la régénération oculaire dans des cas de glaucome et de comprendre les mécanismes sous-jacents. Pour ce faire, nous avons injecté des MSC ou leurs facteurs sécrétés dans un modèle de glaucome induit par trabéculoplastie laser. Nous avons démontré que les MSC peuvent régénérer le trabéculum endommagé et abaisser la pression oculaire en réactivant des cellules progénitrices dans le corps ciliaire. Ces cellules prolifèrent et s’implantent dans le trabéculum une semaine après le traitement. Nous avons aussi démontré que les facteurs produits par les MSC cultivées en conditions hypoxiques induisent l’activation des cellules progénitrices. Par contre, les MSC cultivées dans un environnement normoxique n’induisent pas cet effet. Nous avons aussi observé que les facteurs produits dans des conditions hypoxiques sont incapables de réactiver les cellules progénitrices ex vivo. Nous avons donc voulu vérifier si d’autres facteurs régénératifs sont engendrés in situ suite à l’injection des MSC. Nous avons ainsi découvert qu’un facteur produit par les macrophages migrant dans la zone endommagée permet de réguler l’activation des cellules progénitrices. Cette production requiert cependant une exposition des macrophages aux facteurs paracrines des MSC. Nous avons aussi observé que l’effet régénératif des MSC était inhibé suite à l’élimination des macrophages de l’organisme. Ceci positionne les macrophages comme un intermédiaire essentiel de l’effet régénératif exercé par les MSC. Les résultats présentés dans cette thèse constituent une avancée importante pour l’utilisation des MSC en médecine régénératrice. Ils ont permis d’établir les bases d’un traitement potentiel pour le glaucome à angle ouvert et d’ajouter une pièce importante à la compréhension des mécanismes régénératifs des MSC. Ces connaissances devraient avoir un impact significatif sur la régénération du tissu oculaire et de plusieurs autres organes. / Stem cells have been presented as the key to regenerative medicine, where organ repair, cures for degenerative diseases and even the creation of new tissue could be achieved. Adult stem cells already possess a certain level of differentiation, which limits their potential effect to the organ where they were isolated. But one subtype, mesenchymal stem cells (MSC), possess a versatility which makes them ideal candidates for many treatments. It is commonly accepted that MSCs exert their effect through paracrine factors, but their precise mechanism of action remains uncertain. As such factors could have a positive effect in many degenerative diseases, we wanted to study their regenerative potential in one of the most widespread ocular disease, open angle glaucoma. This disease is characterised by the destruction of retinal ganglion cells following a rise in intraocular pressure. This pressure rise is mostly caused by a dysfunction of the trabecular meshwork, the tissue regulating the outflow of aqueous humor from the eye. Glaucoma progression can currently be controlled, but the disease cannot be cured. Meanwhile, trabecular regeneration could halt and even reverse disease progression. Thus, the objective of this thesis is to evaluate MSC potential in the regeneration of the trabecular meshwork and to understand any underlying mechanisms. To this end, we injected MSC or their secreted factors in a model of trabeculoplasty induced glaucoma. We demonstrated that MSC can regenerate the damaged trabeculum and lower ocular pressure by reactivating progenitor cells located in the ciliary body. These cells proliferate and restore the trabeculum within one week after the initial treatment. We also demonstrated that MSC factors produced under hypoxic conditions induce progenitor cell activation. Such activation does not occur with MSC factors produced under normoxic conditions. We have also observed that factors produced under hypoxic conditions are incapable of reactivating progenitor cells in an ex vivo setting. Thus, we wanted to verify if any other regenerative factors are produced in vivo after MSC injection. We have discovered that macrophages produce one such factor after their migration in the area of damage. Production of the macrophage factor requires contact with MSC paracrine factors. We have also observed that MSC regeneration was completely blocked following macrophage elimination from the organism. This positions macrophages as an essential intermediate in MSC-mediated tissue regeneration. The results presented in this thesis represent an important step forward for the use of MSC in regenerative medicine. They have established a basis for an open angle glaucoma treatment and added an important element for the comprehension of MSC regenerative mechanisms. This knowledge should have a significant impact for the treatment of ocular diseases and other illnesses in many different organs.

Dans ce travail de thèse, la texturation de surface d‟alliages de titane a été étudiée en utilisant un procédé d'écriture directe par laser femtoseconde dans le but d'améliorer la mouillabilité d‟implants dentaires et orthopédiques par les fluides biologiques et la minéralisation de la matrice (formation osseuse) tout en réduisant l'adhésion bactérienne et la formation de biofilmes. Des surfaces de titane (Ti-6Al-4Vet cp Ti) ont été micro-, nano-texturées par laser femtoseconde et une biofonctionnalisation de ces surfaces a été ajoutée ou non par greffage de peptides d'adhésion cellulaire (peptides RGD) en surface de ces différents matériaux. Les textures de surface peuvent être classées comme suit: (a) structures périodiques de surface induites par laser (LIPSS); (b) étalage de nanopiliers (NP); (c) étalage de micro colonnes recouvertes de LIPSS (MC-LIPSS) formant une distribution bimodale de rugosité. Nous avons montré que la texturation de surface par laser améliore la mouillabilité des surfaces avec de l'eau ainsi qu‟une solution saline tamponnée Hank's (HBSS) et amène une anisotropie de mouillage. Une minéralisation cellulaire est observée pour toutes les surfaces des deux alliages de titane lorsque des Cellules Souches Mésenchymateuses humaines (hMSC) sont cultivées dans un milieu ostéogénique. La minéralisation de la matrice et la formation de nodules osseux sont considérablement améliorées sur les surfaces texturées LIPSS et NP. Parallèlement,l'adhésion de Staphylococcus aureus et la formation de biofilmes sont considérablement réduites pour les surfaces texturées LIPSS et NP. La biofonctionnalisation des différentes surfaces texturées (cp Ti) par laser a été réalisée et caractérisée par spectroscopie de photoélectrons (XPS) et par microscopie à fluorescence en utilisant des peptides fluorescents. L‟ensemble des résultats obtenus suggèrent que la texturation de surface d'alliages de titane (Ti-6Al-4V et cp Ti) en utilisant une technique d‟écriture directe par laser femtoseconde est un procédé prometteur pour l'amélioration de la mouillabilité de la surface d'implants dentaires et orthopédiques par les fluides biologiques et leur ostéointégration (différenciation ostéoblastique et minéralisation de la matrice), tout en réduisant l‟adhésion de Staphylococcus aureus et la formation de biofilmes. Enfin, la combinaison de la texturation par laser et du greffage covalent d‟un principe actif (ici un peptide d‟adhésion cellulaire comme le peptide RGD) amènera indéniablement une bioactivité utile pour favoriser l'adhésion des hMSC et faciliter laformation osseuse. / In the present thesis the surface texturing of Ti alloys using femtosecond laser direct writing method is explored as a potential technique to enhance the wettability of dental and orthopaedic implants by biological fluids and matrix mineralisation (bone formation), while reducing bacteria adhesion and biofilmformation. The surface texture was combined with biofunctionalisation by covalent grafting of a RGD peptide sequence as well. The surface textures can be classified as follows: (a) Laser-Induced Periodic Surface Structures-LIPSS; (b) nanopillars arrays(NP); (c) arrays of microcolumns covered with LIPSS (MC-LIPSS), forming a bimodal roughness distribution. Laser texturing enhances surface wettability by water andHank‟s balanced salt solution (HBSS) and introduces wetting anisotropy, crucial incontrolling the wetting behaviour. Matrix mineralisation is observed for all surfaces of both Ti alloys when human mesenchymal stem cells (hMSCs) are cultured in osteogenic medium. Matrix mineralisation and formation of bone-like nodules are significantly enhanced on LIPSS and NP textured surfaces. On the contrary, Staphylococcus aureusadhesion and biofilm formation are significantly reduced for LIPSS and NP textured surfaces. The biofunctionalisation of the laser textured surfaces of cp Ti is sucessfully achieved. In general, these results suggest that surface texturing of Ti alloys using femtosecond laser direct writing is a promising method for enhancing surface wettability of dental and orthopaedic implants by biological fluids and their osseointegration (osteoblastic differentiation and matrix mineralisation), while reducing Staphylococcus aureus adhesion and biofilm formation. Finally, the combination of laser texturing and covalent grafting of a RGD peptide sequence may be potentially useful for increasing cell adhesion and facilitating bone formation.

Nous avons déterminé la capacité de régénération du tissu vasculaire in vivo des CSM traitées avec BMP2 à la dose de [100 ng.mL-1] dans un modèle rat. Nous avons ainsi rapporté qu’une prothèse revêtue de CSM traitée par BMP2 pendant 1 semaine et implantée 14 jours chez le rat permettait la reconstitution des trois tuniques de la paroi mimant la structure de l’aorte. La capacité proangiogénique des CSM était augmentée par BMP2 grâce à la mise en jeu de voies intracellulaires impliquant le facteur induit par l’hypoxie (HIF-1α) via JAK/STATs. Nous avons montré que les CSM migraient sous l’influence de BMP2 par stimulation de l’activité du complexe enzymatique NADPH oxydase via l’augmentation de l’expression des protéines PAK1, Vav2 et RAC1 GTPase/PI3K. Ce travail a confirmé l’intérêt de l’utilisation de CSM conjointement à rh-BMP2, une protéine impliquée dans l’embryogénèse vasculaire, pour la bioingénierie de la régénération vasculaire. / We determined the capacity to regenerate vascular tissue in vivo, of MSC treated with BMP2 at a dose of [100 ng.mL-1] in a rat model. We have reported that a prosthesis coated with CSM treated 1 week with BMP2 and implanted in rats 14 days allowed the reconstruction of the three tunics of the wall that mimic the structure of the aorta. The proangiogenic capacity of MSCs was increased by BMP2 through the intracellular pathways involving hypoxia inducible factor (HIF-1α) via JAK / STAT. We have shown that MSCs migrated under the influence of BMP2 by stimulating the activity of the enzyme complex NADPH oxidase via the increased expression of PAK1 protein, Vav2 and RAC1 GTPase/PI3K. This work confirmed the interest of the use of MSC in conjunction with rh-BMP2, a protein involved in vascular embryogenesis for bioengineering for vascular regeneration.

Résumé soumis à confidentialité / Not available

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une hémopathie myéloïde rare du sujet âgé. Les caractéristiques cliniques, génétiques et moléculaires de la maladie sont bien connues. L’expression très hétérogène de la maladie ne peut être expliquée par la seule hétérogénéité génétique du clone leucémique. Les altérations épigénétiques jouent manifestement un rôle important. Le rôle de facteurs extrinsèques issus du microenvironnement est plus obscur. La niche hématopoïétique est le siège d’interactions entre cellules. Deux schémas non-exclusifs d’altération primaire ou secondaire de la niche sont proposés. Le premier implique que l’émergence d’un clone hématopoïétique modifie son environnement. Le second postule que le premier évènement dans l’émergence d’une hémopathie clonale est une altération de l’environnement. Mon travail de thèse a étudié les altérations du microenvironnement médullaire chez les patients et leur impact sur la physiopathologie de la maladie selon 2 axes: 1) la mise au point d’un modèle murin de reconstitution de la niche hématopoïetique humaine et 2) la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses des patients. Dans une première partie, j’ai transposé un modèle rapporté en 2016 à l’étude de la LMMC. Ce modèle de greffe de cellules médullaires humaines chez la souris immunodéprimée s’est avéré difficilement reproductible. Dans la seconde partie, j’ai analysé les cellules souches mésenchymateuses de patients atteints de LMMC. J’ai identifié la production excessive d’IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2), conséquence probable d’une dérégulation épigénétique. Le séquençage des CSM à l’échelle unicellulaire a révélé une restriction de l’hétérogénéité de ces cellules dont une fraction seulement produit IGFBP2. Finalement, j’ai montré qu’IGFBP2 favorise la différenciation des progéni-teurs myéloïdes vers la lignée monocytaire. IGFBP2 pourrait donc contribuer à amplifier la monocytose caractéristique de cette maladie.En conclusion, la LMMC s’accompagne de modifications des cellules de la niche hématopoÏétique dont certaines produisent des quantités excessive d’IGFBP2. La recherche de l’origine de ce dérèglement et de son importance dans la progression de la maladie permettra d’évaluer l’intérêt potentiel d’une neutralisation de cette cytokine à des fins thérapeutiques. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML, is a rare myeloid hemopathy of the elderly. Clinical, genetic and molecular characteristics of the disease are well-known. The highly heterogeneous expression of the disease can’t be solely explained by genetic heterogeneity of the leukemic clone. Epigenetic alterations obviously play an important role. However, the role of extrinsic factors from the medullar microenvironment in CMML physiopathology is still poorly understood. The hematopoietic niche hosts a lot of bi-directionnal interactions between cells. Two non-exclusive schemes of primary and secondary alterations of the niche can be proposed. First postulate implies that the emergence of a hematopoietic clone alters its environment. The second one supposes that the first event causing the emergence of a clonal hemopathy is an alteration of the environment. My PhD work consisted of studying medullar alterations in patients and their impact on CMML physiopathology upon 2 axes: 1) to set up a murine model of human hematopoietic niche reconstitution 2) to caracterise mesenchymal stem cells from CMML patient ex vivo. During the first part of my PhD, I adapted a model published in 2016 to CMML. This model of human MSC graft in immunodeficient mice proved to be hardly reproducible. During the second part, I analysed of CMML patients MSC. I identified an excessive production of IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2) probably secondary to an epigenetic disregulation. Single cell RNA sequencing revealed a restriction of MSC heterogeneity of which only a fraction produces IGFBP2. Finally, I showed that IGFBP2 favors myeloid progenitors differenciation towards monocytic lineage. IGFBP2 could therefore contribute to the amplification of CMML characteristic monocytosis.To conclude, CMML goes along with modifications of hematopoietic niche cells, some of which produce excessive amounts of IGFBP2. Investigation on the origin of this alteration and its significance in disease progression should allow to evaluate the potential interest of its neutralization for therapeutic strategies.