Le choc septique est actuellement la dixième cause de mortalité à travers le monde à égalité avec les infarctus du myocarde. Sa physiopathologie extrêmement complexe, entrelaçant un état pro-inflammatoire et anti-inflammatoire, rend caduque l’action des thérapeutiques conventionnelles. En ce sens, les recherches s’orientent vers les thérapeutiques innovantes et notamment les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM). En effet, les études murines ont mis en évidence que les CSM étaient en mesure, notamment par leurs actions paracrines, d’améliorer la survie, la défaillance d’organes mais également la bactériémie de souris soumises à un choc septique. Cependant, les propriétés des CSM varient en fonction du tissu dont elles sont issues et particulièrement selon qu’elles proviennent de tissus fœtaux (cordon ombilical, placenta, liquide amniotique) ou adultes (moelle osseuse, tissu adipeux...). Ainsi, notre premier objectif a été de comparer, dans un modèle murin de choc septique, l’action des CSM issues de la moelle osseuse (MO) à celle des CSM issues de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical. Cette étude murine a permis de mettre en évidence une action quelque peu différente, entre les CSM-GW et les CSM-MO, sur la physiopathologie du choc septique sans que pour autant, l’une des deux sources de CSM, ne se dégage significativement de l’autre en termes d’efficacité. Cependant, en raison de leur importante capacité de prolifération et de l’accessibilité du tissu source, les CSM-GW apparaissent comme étant nettement plus avantageuses que les CSM-MO. En conséquence, notre deuxième objectif a été d’évaluer l’action des CSM-GW dans un modèle porcin de péritonite afin de se rapprocher un peu plus près de la clinique humaine. Cette étude, menée en double aveugle et en présence continue d’un médecin réanimateur expérimenté, a permis de mettre en évidence que les CSM-GW, produites en grade clinique et utilisées juste après décongélation, étaient en mesure d’améliorer la survie, les paramètres hémodynamiques ainsi que les défaillances d’organes, selon un mécanisme d’action différent de celui rapporté par les études murines / Septic shock, equal to the myocardial infraction, is currently the tenth cause of death in the world. The pathophysiological complexity of this syndrome, with a simultaneous pro and anti- inflammatory state, results in the failure of conventional treatments. In this sense, research is focusing on innovative therapeutics agent, including mesenchymal stem cells (MSC). Indeed, murine studies of septic shock showed that MSC improve organ injuries, bacteremia and survival by notably a paracrine mechanism. However, MSC properties vary according to the source tissue, especially if they are derived from a fetal tissue (Wharton’s jelly (WJ), placenta amniotic fluid) or an adult tissue (bone marrow (BM), adipose tissue...). Our first objective was to compare, in a septic shock murine model, the effect of BM-MSC with that of WJ-MSC. Although some differences were observed, the same efficiency was demonstrated between these two sources. However, WJ-MSC present large advantages in comparison to BM-MSC due to their important proliferation capacities and potential quantities of umbilical cord donation. Consequently, our second objective was to investigate the effect of WJ-MSC administration in a relevant pig model of peritonitis in order to better mimic a clinical approach in humans. This study, conducted in double-blind and in presence of an experimented intensivist, showed that WJ-MSC produced in clinical grade and used immediately after thawing, improve survival, hemodynamic parameters and organ injuries by another action than that described in murine studies

L’ingénierie tissulaire osseuse a pour objectif de repousser les limitesexistantes de la régénération osseuse. Les stratégies proposées consistent àassocier à une matrice tridimensionnelle (3D) des cellules autologues, capables derégénérer en 3D un tissu fonctionnel. Le but de ce travail a été d’étudier l’importancede la communication cellulaire entre les cellules du compartiment stromal et lescellules endothéliales au sein d’une matrice tridimensionnelle poreuse constituée depolysaccharides naturels biodégradables. Nos résultats montrent que l’architecture etla nature de cette matrice permettent de guider la différenciation ostéoblastique descellules humaines mésenchymateuses issues de la moelle osseuse. L’organisationcellulaire en agrégats observée stimule les interactions cellulaires, et plusparticulièrement la formation de jonctions communicantes de type GAP et l’activitédes Connexines 43. Nous avons en également étudié la fonction des Pannexines 1et 3 dans la culture 3D. En conclusion, l’ensemble de nos travaux démontre que lesinteractions cellule-cellule constituent des événements majeurs dans cesmécanismes de régénération tissulaire. Les données cellulaires et expérimentalestémoignent de l’intérêt d’utiliser la totalité de la suspension de moelle osseuse pourfavoriser à la fois l’ostéoformation et la vascularisation du tissu. / Bone tissue engineering aims to resolve the existing limitations of boneregeneration methods. One of the proposed strategies consists on the association,within a three-dimensional (3D) matrix, with autologous cells able to regenerate afunctional 3D tissue. The purpose of this study was therefore to investigate theimpact of cellular communication, between cells of the stromal compartment andendothelial cells, within the three-dimensional porous matrix made of biodegradablenatural polysaccharides, focusing on bone repair. Our results show that thearchitecture and the nature of the 3D macroporous matrix promotes the guidance ofmesenchymal stems cells, derived from human bone marrow, towards theosteoblastic lineage. Also, that the organization in aggregates, promoted by the 3Dmatrices, stimulated cell communication, evidenced by the formation of GAPjunctions and activity of Connexins 43. We also focused on the function ofPannexines 1 and 3 for the 3D culture in these matrices of polysaccharides. Inconclusion, this work shows that cell-cell interactions play a major role in order toimprove bone tissue regeneration. Also, cellular and experimental data demonstratesthe advantage of using a total fraction of bone marrow cells to promote both boneformation and vascularization.

Le cartilage articulaire est un tissu avasculaire et non innervé, ce qui lui confère des capacités de réparation très limitées. Les traitements chirurgicaux actuels ne permettent pas d’obtenir un tissu de réparation similaire au cartilage natif. Les recherches s’orientent depuis de nombreuses années vers l’ingénierie cellulaire et tissulaire du cartilage selon le type de lésions à traiter, focale ou diffuse. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) constituent une source cellulaire intéressante pour l’ingénierie du cartilage. Elles sont facilement accessibles et ont des potentialités de différenciation chondrogénique. Les CSMs issues de la moelle osseuse sont les plus étudiées et constituent la référence. D’autres sources de CSMs sont également très prometteuses. Notre choix s’est porté sur les CSMs issues de la membrane et du liquide synovial. Ces deux tissus articulaires présentent l’avantage de pouvoir être prélevés facilement lors d’un examen arthroscopique et leurs CSMs sont adaptées au microenvironnement (hypoxie, inflammation) de l’articulation. Ce travail a porté sur l’étude de deux sources cellulaires d’origine synoviale dans le traitement des lésions focales et diffuses du cartilage. Ces CSMs d’origine synoviale ont d’abord été caractérisées selon leurs phénotypes et leurs capacités de différenciation vers les voies ostéogénique, adipogénique et chondrogénique, par rapport aux CSMs issues de la moelle osseuse. Ensuite, les capacités chondrogéniques de ces CSMs synoviales destinées à produire un substitut cartilagineux consacré aux traitements des lésions focales du cartilage articulaire ont été étudiées. Les CSMs ont été ensemencées dans un biomatériau collagénique et différentes conditions environnementales (facteurs de croissance et oxymétrie) ont été évaluées afin de définir les conditions de culture les plus appropriées. La chondrogenèse a été induite avec succès par l’utilisation de facteurs de croissance tels que TGF-1 et TGF-3 seuls ou en association avec la BMP-2. L’hypoxie n’a pas montré d’effet bénéfique sur la synthèse matricielle au sein des substituts cartilagineux. Enfin, nous avons évalué les capacités des CSMs issues du liquide synovial à traiter les lésions diffuses du cartilage induites par un modèle de section du ligament croisé antérieur chez le rat athymique. Les deux injections intra-articulaires de CSMs issues du liquide synovial à 1 et 2 semaines après chirurgie n’ont pas permis de prévenir les lésions arthrosiques. / Joint cartilage is avascular and not innervated, which gives it very limited repair capabilities. Current surgical treatments do not provide repair tissue similar to native cartilage. For many years, research has been focused on cellular and tissue engineering of cartilage depending on the type of lesions to be treated, focal or diffuse. Mesenchymal stem cells (MSCs) are an interesting cellular source for cartilage engineering. They are easily accessible and have the potential for chondrogenic differentiation. MSCs from bone marrow are the most studied and are the gold-standard. Other MSCs sources of are also very promising. We chose MSCs from the synovial membrane and synovial fluid. These both joint tissues have the advantage of being easily retrievable during arthroscopic examination and their MSCs are adapted to the microenvironment (hypoxia, inflammation) of the joint. This thesis work focused on the study of two cellular sources of synovial origin in the treatment of focal and diffuse cartilage lesions. These synovial-derived MSCs were first characterized according to their phenotypes and their ability to differentiate to the osteogenic, adipogenic and chondrogenic pathways, compared to bone marrow derived MSCs. Then, the chondrogenic capacities of these synovial MSCs to produce a cartilage substitute for the treatment of focal lesions of joint cartilage were studied. The MSCs were seeded in a collagenic biomaterial and different environmental conditions (growth factors and oximetry) were evaluated to define the most appropriate culture conditions. Chondrogenesis has been induced with success by the use of growth factors such as TGF-β1 or TGF-β3 alone or in combination with BMP-2. Hypoxia has not exerted a beneficial effect on matrix synthesis in cartilage substitutes.Finally, we evaluated the ability of CSMs from human synovial fluid to treat diffuse cartilage lesions induced by an anterior cruciate ligament section model in athymic rats. The two intra-articular injections of synovial fluid MSCs, 1 and 2 weeks after surgery did not prevent osteoarthritic lesions.

Dans cette thèse, nous avons combiné les approches des cultures single-cell, de cytométrie en flux,des analyses de métabolisme énergétique et de génétique moléculaire afin d’explorer les effets del’Acétate d’α-Tocopherol (α-TOA) sur les cellules stromales mésenchymateuses (MStroC) et leurs souspopulations fonctionnelles (cellules souches et progénitrices mésenchymateuses). L’autre but était de tester une molécule de miR-210 par rapport à son utilisation potentielle comme « hypoxia mimicking molecule ». Après avoir démontré l’hétérogénéité de la population MStroC et conclu que la population de premier passage est appropriée pour des expérimentations ultérieures, nous avons trouvé que l’α-TOA présentait un effet positif sur le maintien de la capacité proliférative élevée des cellules souches mésenchymateuses. Cet effet est accompagné d’une atténuation de l’activité de la chaîne de transport d’électrons (ETC) qui pourrait d’autre part expliquer l’accroissement modéré du niveau des Reactive Oxygen Species mitochondriales (mtROS) que nous avons détectées. L’augmentation du niveau de mtROS pourrait être associée à une dégradation de protéine HIF-1 dans la population MStroC exposée à l’α-TOA. Bien que nous n’ayons pas détecté d’augmentation compensatoire de la glycolyse, les phénomènes observés représentent en partie la réponse cellulaire complexe au faible niveau d’O2. Il a été établi que ce phénomène était relié au maintien de primitivité des cellules souches. Le mécanisme exact reste à clarifier ainsi que son potentiel translationnel. En outre, nous avons apporté la preuve que miR-210 fait partie intégrante de la réponse des MStroC à la faible concentration en O2. Dans cette étude, nous avons montré que l’augmentation de l’expression de miR-210 sur une période courte (jusqu’à 24 heures) et après une période étendue (jusqu’à 72 heures) d’exposition des MStroC à une faible concentration en O2. De plus, nous avons prouvé que ce micro ARN pouvait être régulé par les deux facteurs transcriptionnels HIF-1 et HIF-2, nous laissant penser que ceci faisait partie intégrante de la réponse des MStroC à une faible concentration en O2. Jusqu’à présent, nos données suggèrent que miR-210 est digne d’intérêt en tant que bonne molécule « hypoxia mimicking ». / In this thesis, we combined approaches of single-cell cultures, flow-cytometry, energetic metabolismanalysis and molecular genetics in order to get insight in the effects of α-Tocopherol-Acetate (α-TOA)on Mesenchymal Stromal Cells (MStroC) and their functional subpopulations (mesenchymal stem and progenitor cells). The other aim was to test a miR-210 molecule with respect to its potential use as hypoxia mimicking molecule. After defining MStroC population heterogeneity and concluding that the first passage population is convenient for further experiments, we demonstrated that α-TOA exhibits a positive effect on the maintenance of high proliferative capacity of mesenchymal stem cells. This effect could be associated with an attenuation of electron transport chain (ETC) activity, which, on the other hand could explain moderate increase in the level of mitochondrial Reactive Oxygen Species (mtROS) we detected. The increase in mtROS level could be associated with a decreased HIF-1 alpha protein degradation in MStroC exposed to α-TOA. Although we did not detect a compensatory increase in glycolysis, the observed phenomena depict part of a complex cellular response to the low O2 that is demonstrated to be related with maintenance of stem cell primitiveness. The exact mechanism remains to be elucidated as well as its translational potential. In addition, we provided new evidences that miR-210 is integral part in MStroC response to low O2. In the study, we showed increased in miR-210 expression in a short-term (up to 24 hours) and after extended (up to 72 hours) MStroC exposed to low O2. Moreover, we demonstrated that this micro- RNA could be regulated by both HIF-1 and HIF-2 transcriptional factors, suggesting it as integral part of MStroC response to low O2. So far, our data suggest that miR-210 is worthy to be considered as good hypoxia mimicking molecule.

L’objectif de ce travail a consisté à évaluer le rôle d’un microenvironnement avec une haplo-insuffisance hétérozygote du gène BRCA1 dans les événements précoces de la transformation tumorale du cancer du sein. Dans ce but, nous avons modélisé un stroma BRCA1-muté en utilisant des cellules souches / stromales mésenchymateuses (MSCs) obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) issues d’une patiente porteuse de la mutation (MSCs BRCA1+/-). Ces cellules mutées pour BRCA1 ont été comparées à des MSCs sans la mutation (MSCs BRCA1+/+) générées à partir d’iPSCs BRCA1+/+. Ce travail de thèse a porté sur l’influence du stroma BRCA1-muté à travers deux axes : le caractère pro-angiogénique des MSCs BRCA1+/- et l’induction d’une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) sur des cellules mammaires normales (HME1).Nous montrons que les MSCs BRCA1-muté présentent des propriétés pro-angiogéniques significativement augmentées en surexprimant le facteur hypoxique HIF-1α et des facteurs de la famille du VEGF, PDGF et Angpt se traduisant par des capacités augmentées à former des structures vasculaires in vitro et in vivo. Les MSCs BRCA1-muté présentent également des capacités migratoires supérieures en produisant et sécrétant la périostine (POSTN), une protéine de la matrice extracellulaire impliquée dans l’adhésion, la motilité et la migration cellulaires. Ces capacités ont été validées par une approche de siRNA spécifique pour la POSTN. In vivo, nous montrons que la co-injection de MSCs BRCA1-muté et de cellules malignes mammaires murines (4T1-Luc-GFP) a permis d’augmenter significativement la croissance tumorale et la formation de métastases pulmonaires. Ces résultats sont corrélés avec la détection de la POSTN in situ et avec la formation d’un réseau vasculaire tumoral développé, quantifié par marquage du CD34. Par ailleurs nous avons démontré qu’un surnageant de MSCs BRCA1+/- peut induire une TEM des cellules HME1 en favorisant l’acquisition d’un phénotype souche cancéreux (CD24Low/CD44High) et en accélérant leur migration. Enfin nous avons initié la production in vitro d’organoïdes mammaires en utilisant des MSCs et des HME1 afin d’étudier plus précisément les mécanismes moléculaires de cette TEM après contact et des possibles événements précoces de la transformation maligne. Nos résultats indiquent que les MSCs peuvent participer à l’initiation tumorale et à la progression métastatique dans un contexte d’une mutation hétérozygote du gène BRCA1. La POSTN pourrait représenter à la fois un marqueur pronostique mais également une cible thérapeutique pour ces cancers du sein héréditaires. / The aim of this study was to evaluate the role of a BRCA1 heterozygous haplo-deficient microenvironment in the early events of tumour transformation of breast cancer. For this purpose we modeled a BRCA1-mutated stroma using mesenchymal stem / stromal cells (MSCs) obtained by differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from a patient carrying the mutation (MSCs BRCA1+/-). These BRCA1-mutated cells were compared to MSCs without the mutation (MSCs BRCA1+/+) generated from iPSCs BRCA1+/+. This study focuses on two aspects of BRCA1-mutated stroma, namely the pro-angiogenic properties of BRCA1+/- MSCs and the induction of an epithelial-mesenchymal transition (EMT) on normal breast cells (HME1).We have shown that BRCA1-mutated MSCs exhibit enhanced pro-angiogenic properties by overexpressing the hypoxic factor HIF-1α and factors from VEGF, PDGF and Angpt families resulting in increased capacities to form vascular structures in vitro and in vivo. BRCA1-mutated MSCs exhibit also higher migratory capabilities by production and secretion of periostin (POSTN), an extracellular matrix protein, which is involved in cell adhesion, motility and migration. These capacities have been validated by a specific siRNA approach for POSTN. In vivo, the coinjection of BRCA1-mutated MSCs with murine breast cancer cell line (4T1-Luc-GFP) promotes tumour growth and the formation of lung metastases. These results are correlated with in situ POSTN detection and with the formation of a developed tumour vascular network, quantified by CD34 staining. We also demonstrated that supernatant of BRCA1+/- MSCs can induce an EMT on HME1 cells by promoting the acquisition of stemness properties (CD24Low/CD44High) and accelerating their migration. Finally we initiated the in vitro production of mammary organoids using MSCs and HME1 in order to study more precisely the molecular mechanisms of this EMT after contact and possible early events of the malignant transformation. These results indicate that MSCs can participate to tumour initiation and metastatic progression in heterozygous BRCA1-mutated background. POSTN could represent a prognostic marker and a therapeutic target for these hereditary breast cancers.

L'ingénierie tissulaire du ligament constitue une approche prometteuse pour réparer ou remplacer un ligament endommagé. Les trois piliers essentiels de l'ingénierie tissulaire ligamentaire sont la matrice de support (aussi appelée scaffold), la source cellulaire, ainsi que l'apport de stimulations biomécaniques/biochimiques : ces trois piliers ont été partiellement étudiés par le passé dans le but de s’orienter vers une régénération ligamentaire. Dans la présente étude, le polymère synthétique poly (L-lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) et la soie ont été proposés et comparés comme de potentiels candidats pour la constitution d’une matrice de support. Une série de matrices tressées multicouches à base de PLCL et de soie, ainsi qu'un nouveau composite soie/PLCL ont été développés et comparés. Les caractérisations physico-chimiques et biologiques ont démontré que le PLCL et la soie constituent des candidats pertinents, tant sur les plans mécaniques que biologiques, pour la constitution d’une matrice de support. De plus, nous avons montré que le composite soie/PLCL offrait des propriétés mécaniques et une biocompatibilité accrue par rapport aux autres matrice testées, et constituait probablement le candidat le plus approprié pour l'ingénierie tissulaire du ligament. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la gelée de Wharton (WJ-MSCs) ainsi que les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BM-MSCs) ont été évaluées et comparées en tant que sources cellulaires potentielles pour la régénération ligamentaire. Les caractéristiques biologiques de ces cellules incluent l’adhésion cellulaire, la prolifération, la migration et la synthèse de matrice extracellulaire. Ces deux types de cellules ont montré une bonne biocompatibilité dans leurs interactions avec les matrices de support en PLCL et en soie. Aucune différence significative n'a été observée entre les WJ-MSCs et les BM-MSCs. Enfin, l'effet de la stimulation biomécanique sur la différentiation des CSM en tissu ligamentaire a été évalué par le biais d’un bioréacteur de traction-torsion. Bien que peu de cellules aient été détectées la matrice après 7 jours de stimulation, des CSM de forme allongée le long des fibres ont été détectées, ce qui permet de penser qu'il est possible de promouvoir la différenciation des biosubstituts matrice-cellules grâce à la stimulation mécanique en bioréacteur. En conclusion, cette étude démontre le potentiel prometteur de l’association de cellules souches mésenchymateuses issues de la gelée de Wharton ou de la moelle osseuse avec une matrice de support composite soie/PLCL pour la régénération ligamentaire dans le futur. / Ligament tissue engineering offers a potential approach to recover or replace injured ligament. The three essential elements that have been investigated towards ligament regeneration consist in a suitable scaffold, an adapted cell source, and the supply of biomechanical/biochemical stimulations. In the current study, synthetic polymer poly (L-lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) and silk have been evaluated as suitable candidates to constitute an adapted scaffold. A series of multilayer braided scaffolds based on PLCL and silk, as well as an original silk/PLCL composite scaffold, have been developed and compared. The conducted physicochemical and biological characterizations have demonstrated that both PLCL and silk constitute adapted candidate material to form ligament scaffolds from the mechanical and biological points of view. Moreover, it has been observed that silk/PLCL composite scaffold resulted in adequate mechanical properties and biocompatibility, and therefore could constitute suitable candidate scaffolds for ligament tissue engineering. Both Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) and Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) have been evaluated to be cell source for ligament regeneration. MSCs behaviors including cell attachment, proliferation, migration and extracellular matrix synthesis have been investigated. In the present study, both MSCS showed a good biocompatibility to interact with PLCL and silk scaffolds. No significant differences have been detected between WJ-MSCs and BM-MSCs. Finally, the effect of biomechanical stimulation on MSCs differentiation towards ligament tissue has been carried out with a tension-torsion bioreactor. Although few cells were detected on scaffold after 7 days of stimulation, MSCs were observed to exhibit an elongated shape along the longitudinal direction of fibers, which may indicate that an adapted mechanical stimulation could promote MSC-scaffold constructs differentiation towards ligamentous tissue. As a conclusion, this study demonstrates the potential of WJ-MSCs and BM-MSCs combined with a new silk/PLCL composite scaffold towards ligament regeneration.

L’évolution d’une cellule tumorale initiée à une tumeur solide nécessite, à chaque étape, un microenvironnement favorable à sa survie et à sa croissance. Le microenvironnement tumoral est comparé à un foyer d’inflammation chronique dont la composition cellulaire et moléculaire est complexe. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) représentent l’un des principaux acteurs cellulaires présents. Elles migrent vers les sites tumoraux où elles soutiennent l’inflammation, l’angiogenèse et le développement tumoral en activant plusieurs voies de signalisation. Une des voies majeures qui contribuent à l’inflammation est la voie de signalisation NF-B. L’initiation de cette voie provient de la membrane cellulaire entre autres des cavéoles. Nous soumettons l’hypothèse que l’une des cavines, protéines associées aux cavéoles, modulerait le phénotype inflammatoire etou migratoire dans les CSM traitées à la cytokine TNF- (facteur de nécrose tumorale ) en modulant la voie de signalisation NF-B. En effet, nous avons observé une régulation à la hausse de l’expression de la COX-2 (cyclooxygénase-2) et une diminution de l’expression d’IκB qui sont synonymes de l’activation de la voie NF-B dans les CSM que nous avons traitées au TNF-. Nous avons trouvé que le TNF- induit la migration des CSM, et que la répression génique de la Cavine-2 augmente significativement la migration des CSM traitées par le TNF-. La répression génique de la Cavine-2 vient aussi amplifier la tubulogenèse dans les CSM en réponse au TNF-. D’un point de vue moléculaire, la répression génique de la Cavine-2 a montré une très forte amplification de l'expression protéique de la COX-2 dans les CSM en réponse au TNF-. Dans ces mêmes cellules où la Cavine-2 a été réprimée, et suite à un traitement au TNF-, le pic de phosphorylation est plus intense et la courbe de phosphorylation est plus prolongée dans le temps. Ces observations nous permettent d’affirmer que la Cavine-2 a un rôle répresseur sur l’expression de COX-2. Collectivement, nos résultats montrent que la Cavine-2 peut être proposée comme un gène suppresseur de tumeur et est de ce fait, une bonne cible thérapeutique dans les CSM qui permettraient d’agir à des stades précoces du développement tumoral. / The evolution of an initiated tumor cell into a solid tumor requires at each stage a favorable microenvironment for its survival and growth. The tumor microenvironment is compared to a chronic inflammation site with a cellular and molecular complex composition. Mesenchymal stem cells (MSC) have important roles in tumor microenvironment. They migrate to tumor sites where they maintain the inflammation, angiogenesis and tumor development by activating multiple signaling pathways. One of the major pathways that contribute to inflammation is the NF-B signaling pathway. The initiation of this pathway comes from the cell membrane and caveolae. Our hypothesis is that one of cavins, proteins associated to caveolae, modulates the inflammatory phenotype and migration in MSC treated with TNF-. We suggest that this process is modulated by a NF-B signaling pathway. Indeed, we observed an up-regulation of the expression of the cyclooxygenase-2 (COX-2) and a decrease in the expression of IκB which suggest that activation of the NF-B pathway is involved in the MSC treated with TNF. We found that the TNF- induced migration in the MSC, and the knockout of Cavin-2 significantly increased migration of MSC treated with TNF-. The silencing of Cavin-2 considerably increased tubulogenesis of MSC treated with TNF-. At the molecular level, knockout of Cavin-2 showed a very strong amplification of protein expression of COX-2 in the MSC in response to TNF-. In these same cells where Cavin-2 was repressed and treated with TNF-, the peak of phosphorylation of pIB is more intense and the phosphorylation curve is sustained in time. These observations allow us to assert that Cavin-2 has a repressing role on the expression of COX-2. Collectively, our results show that the gene encoding Cavin-2 can be proposed as tumor suppressor gene. This study allowed us to identify new therapeutic targets: Cavins proteins.

Il est possible de perméabiliser la membrane plasmique des cellules par des agents chimiques (tels que les polyéthylènes glycols ou le diméthylsulfoxyde) ou par des agents physiques (tels que les ultrasons ou les impulsions électriques). Cette perméabilisation peut être réversible ou non, ce qui signifie qu’après la perméabilisation, la membrane retrouve son intégrité et ses propriétés d’hémi-perméabilité ou pas. Ces techniques peuvent être utilisées pour faire rentrer des médicaments ou des acides nucléiques dans les cellules ou pour générer des fusions cellulaires. Une approche récente, la dynamique moléculaire, utilise des simulations numériques pour prédire les effets des agents perméabilisants sur les membranes à l’échelle moléculaire, et permet d’apporter de nouvelles données pour comprendre les mécanismes moléculaires, encore peu connus à ce jour.Les impulsions dites « classiques » en électroperméabilisation, de l’ordre de la dizaine de millisecondes à la centaine de microsecondes et d’amplitude de champ de l’ordre de 100 kV/m, perméabilisent la membrane plasmique uniquement. Cependant, récemment, des impulsions plus courtes, dites impulsions nanoseconde (quelques nanosecondes) et de plus grande amplitude de champ (de l’ordre de 10 MV/m) ont été utilisées et permettent d’affecter également les membranes des organites cellulaires. Les travaux de cette thèse portent dans un premier temps sur les effets perméabilisants d’un agent chimique (le diméthylsulfoxyde, DMSO) en comparant les modèles prédictifs de la dynamique moléculaire avec des expériences in vitro sur des cellules. Le modèle numérique prédit trois régimes d’action en fonction de la concentration du DMSO. Utilisé à faible concentration, il y a déformation de la membrane plasmique. L’utilisation d’une concentration intermédiaire entraîne la formation de pores membranaires et les fortes concentrations de DMSO ont pour conséquence la destruction de la membrane. Les expériences in vitro faites sur des cellules ont confirmé ces résultats en suivant l’entrée de marqueurs de perméabilisation. Cette étude a été comparée avec la perméabilisation par un agent physique (les impulsions électriques). Dans un deuxième temps, ces travaux traitent du développement et de l’utilisation d’un nouveau dispositif d’exposition des cellules aux impulsions nanoseconde qui permet d’appliquer des champs électriques très élevés et d’observer par microscopie leurs au niveau cellulaire. Pour finir, ce dispositif a été utilisé avec des impulsions nanoseconde pour générer des pics calciques dans de cellules souches mésenchymateuses qui présentent des oscillations calciques spontanées liées à leur état de différenciation. Ces pics induits sont dus à la libération de calcium stocké dans les organites et/ou à la perméabilisation de la membrane plasmique permettant l’établissement d’un flux de calcium intramembranaire. Il est aussi possible d’utiliser des impulsions microseconde pour générer des pics calciques dans ces cellules. Dans ce cas, les pics calciques ne sont dus qu’à la perméabilisation de la membrane plasmique. En jouant sur l’amplitude des champs électriques appliqués et sur la présence ou l’absence de calcium externe, il est possible de manipuler les concentrations calciques cytosoliques en mobilisant le calcium interne ou externe. Une des particularités de ces nouveaux outils est de pouvoir être déclenchés et arrêtés instantanément, sans réminiscence, contrairement aux molécules chimiques permettant de produire des pics calciques. Ces outils pourraient donc permettre de mieux comprendre l’implication du calcium dans des mécanismes comme la différenciation, la migration ou la fécondation. / It is possible to permeabilize the cellular plasma membrane by using chemical agents (as polyethylen glycols or diméthylsulfoxyde) or physical agents (as ulstrasounds or electric pulses). This permeabilization can be reversible or not, meaning that after the permeabilization, the membrane recovers its integrity and its hemi-permeable properties. These techniques can be used for the uptake of medicines or nucleic acids or to generate cellular fusions. A recent approach, the molecular dynamics, uses numerical simulations to predict the effects of permeabilizing agents at the molecular scale, allowed generating of new data to understand the molecular mechanisms that are not completely known yet.The pulses so called “classical” in electropermeabilization, from the range of the ten of milliseconds to the hundred of microseconds and with a field amplitude in the range of 100 kV/m, can only permeabilize the plasma membrane. However, more recently, shorter pulses, so called nanopulses (few nanosecondes) and with an higher field amplitude (in the range of 10 MV/m) have been used and allow to affect also cellular organelles membranes.This thesis is, in a first time, about the permeabilizing effects of a chemical gent (the diméthylsulfoxyde, DMSO) by comparing predictive models from molecular dynamics with experiments in vitro on cells. The numerical model predicts three regimes of action depending on the DMSO concentration. Used at low concentration, there is a plasma membrane deformation. The use of an intermediate concentration lead to membrane pores formation and higher DMSO concentrations resulted in membrane destruction. The experiments done in vitro on cells confirmed these results using the following of permeabilization markers. This study has been compared to permeabilization due to a physical agent (electric pulses).Secondly, it is about the development and the use of a new cell exposure device for nanopulses that permit to apply very high electric fields and to observe induced cellular effects simultaneously by microscopy.To finish, this device has been used with nanopulses to generate calcium peaks in mesenchymal stem cells that are presenting spontaneous calcium oscillations in correlation to their differentiation state.. These induced peaks are due to the release of the calcium stored in organelles and/or to plasma membrane permeabilization leading to a intramembrane calcium flux establishment. It is also possible to use microsecond pulses to generate calcium peaks in these cells. In this case, the calcium peaks are due to the plasma membrane permeabilization . By changing the amplitude of the applied electric fields and the presence or the absence of external calcium, it is possible to manipulate cytosolic calcium concentrations by mobilizing internal or external calcium. One feature of these new tools is to be triggered and stopped instantly without reminiscence, unlike chemical molecules permitting the production of calcium peaks. These tools could therefore lead to a better understanding of the involvement of calcium in mechanisms such as differentiation, migration or fertilization.

L'insuffisance cardiaque (IC) chronique représente la pathologie la plus fréquente nécessitant l'hospitalisation chez les patients de plus de 65 ans. La mortalité à 5 ans est estimée à plus de 50% et les enjeux en terme d’économie et de santé publique sont immenses. Parmi de nombreuses étiologies, les cardiopathies ischémiques sont la cause principale de l’IC. Sur les quinze dernières années, de nombreuses études précliniques et cliniques ont confirmé le potentiel thérapeutique des cellules souches d’améliorer la fonction cardiaque et d’atténuer le remodelage ventriculaire. Néanmoins, beaucoup de questions fondamentales liées à la thérapie régénératrice avec les cellules souches restent à résoudre. Parmi les raisons expliquant l'inefficacité de la thérapie cellulaire figurent l'intégration et la survie compromises des cellules greffées dans un microenvironnement défavorable au sein de tissus infarcis ainsi que la présence d'inflammation, de stress oxydatif, d'hypoxie sévère et de privation des nutriments. Une des approches pour améliorer la thérapie cellulaire serait d’adapter le milieu de culture des cellules in vitro en terme de concentration en oxygène afin qu’il soit plus proche des conditions in vivo. Notre étude a bien montré que le préconditionnement des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) à l’hypoxie permettait de promouvoir la croissance cellulaire tout en gardant leur potentiel de différenciation trilignée. De plus, notre étude in vivo montrait que les CSMs cultivées en hypoxie, par rapport à celles cultivées en normoxie, présentaient un meilleur potentiel thérapeutique : amélioration de la viabilité dans la zone infarcie, augmentation de la contractilité intrinsèque et favorisation du processus d’angiogénèse, etc. Force est de constater que la récupération de la fonction cardiaque sous dispositifs d'assistance ventriculaire (bridge to recovery) pose un jalon dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. Le phénomène « bridge to recovery » nous a permis d'approfondir la connaissance sur la physiopathologie du remodelage ventriculaire, qui était considéré comme un processus unidirectionnel. Cependant, plusieurs controverse existent sur la stratégie ‘Bridge to Recovery’. Une des questions les plus soulevées est s'il y a une limite à la durée et à l'intensité de la décharge ventriculaire afin d'éviter ses effets secondaires. Pour simuler les décharges mécaniques ventriculaires d'intensités différentes, nous avons mis au point deux modèles de transplantation cardiaque hétérotopique (TCH), cœur seul ou cœur-poumon, mimant respectivement la décharge complète et la décharge partielle. Notre étude montrait que la décharge mécanique résultait d’une atrophie myocardique, d’une réduction du métabolisme glucidique, d’une fibrose cardiaque et d’une altération de fonction cardiaque diastolique. Les effets étaient tous dépendants des intensités de décharge. Notre travail s'insère dans la thématique générale du laboratoire, qui est de développer un programme de recherche sur les approches thérapeutiques innovantes pour traiter l'infarctus du myocarde et l'IC chronique. Dans la première partie de notre projet, nous avons cherché à clarifier les effets de l'injection intramyocardique de CSMs d'origine médullaire dans la zone infarcie sur la perfusion et la fonction cardiaque (étude n°1). Nous avons ensuite étudié l'impact de la culture cellulaire en hypoxie des CSMs dérivées de moelle osseuse sur leurs caractéristiques biologiques et leur potentiel thérapeutique (étude n°2). Enfin, nous avons caractérisé les effets de décharges mécaniques d'intensités différentes sur le remodelage ventriculaire du cœur sain, sur le plan morphologique, fonctionnel et métabolique (étude n°3) / Heart failure (HF) represents one of the most frequent disease requiring hospitalization in the old population (>65 years old). The 5-year survival rates associated with heart failure are less than 50% and it results in a huge cost on social economy and public health. Ischemic heart diseases represent one of the most frequent etiologies of the heart failure. Over the last fifteen years, many preclinical and clinical studies have confirmed the therapeutic potential of stem cells to improve heart function and reduce ventricular remodeling. The failure of cell therapy can be ascribed to some extent to the poor integration and compromised survival of grafted cells in an unfavorable microenvironment in infarcted tissue which is complicated by the presence of inflammation, oxidative stress, hypoxia and severe deprivation of nutriments. Furthermore, bone marrow stem cells are physiologically located in a hypoxic environment. The adaptation of the in vitro culture medium, in terms of oxygen concentration, to the in vivo natural niche as well as the targeted area, might be one of solutions to improve the efficacy of cell therapy. One of our studies has demonstrated that preconditioning of mesenchymal stem cells (MSCs) with hypoxia could promote cell proliferation without altering the differentiation potential. What’s more, our in vivo study showed that hypoxia-preconditioned MSCs, compared with those cultured in normoxia, presented with better therapeutic efficiency, such as improvement of the myocardial viability in the infarcted area, increase of intrinsic contractility and favoring the processes of angiogenesis. The recovery of cardiac function with ventricular assist devices (bridge to recovery) is a milestone in the treatment of heart failure. The phenomenon "bridge to recovery" has enabled us to deepen the knowledge on the physiopathology of ventricular remodeling, which was considered to be a one-way process. However, the strategy of ‘Bridge to Recovery’ causes many controversies. One of the arisen questions is if there exists a limit in terms of the duration and intensity regarding the mechanical unloading in order to minimize its secondary complications. To simulate ventricular mechanical unloading of different intensities, we have developed two models of heterotopic heart transplantation (TCH), namely, heterotopic heart transplantation (HHT) and heterotopic heart-lung transplantation to simulate complete and partial unloading, respectively. Our study revealed that mechanical unloading resulted in myocardial atrophy, cardiac fibrosis and diastolic dysfunction. These secondary effects were dependent on the intensity of unloading. Our work fits into the general theme of the laboratory, which is to develop a research program on innovative therapeutic approaches to treat myocardial infarction and chronic heart failure. In the first part of our study, we sought to clarify the effects of bone marrow-derived MSCs following intramyocardial injection on the perfusion and function of the infarcted myocardium (study 1). We then investigated the impact of long-term hypoxic culture on the biological characteristics and therapeutic potential of MSCs (study 2). Finally, we explored the effects of mechanical unloading of different intensities on the structure, function and metabolism of healthy myocardium (Study 3)

Les pathologies vasculaires représentent aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité mondiale et leur nombre ne cesse d’augmenter. Les greffons autologues (disponibilité faible) et les prothèses synthétiques inadaptées pour des vaisseaux de diamètre inférieur à 6 mm ne répondent pas à la demande et il existe aujourd’hui, un réel besoin en substitut vasculaire pour les petits vaisseaux. Ainsi, le concept de l’ingénierie vasculaire semble très prometteur. Cette approche est fondée sur l’utilisation de matrices « scaffold » associées à une composante cellulaire pour construire, dans des conditions environnementales adaptées, un vaisseau qui réponde et réagisse aux contraintes physiologiques. Dans cet objectif, la fonctionnalisation d’une media vasculaire constituée de cellules musculaires lisses (CML) est prérequise. Aux CML matures qui ne sont pas de bons candidats (perte de leur phénotype contractile lors de la culture), nous avons identifié les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la gelée de Wharton (tissu conjonctif du cordon ombilical) comme source cellulaire majeure. Leur facilité de récupération, leur présence en grand nombre, leur faible immunogénicité et leur capacité de prolifération et différenciation en font d’excellents candidats en ingénierie tissulaire. Dans ce travail nous avons déterminé les conditions favorables à l’obtention d’un phénotype CML fonctionnelles et montré l’impact de différents paramètres environnementaux (apport en oxygène, facteurs de croissance, teneur en sérum…) sur le comportement des CSM de la gelée de Wharton. Nous avons pu montrer que 1) ces cellules étaient capables de se différencier en cellules au phénotype contractile comparable à celui des CML matures. 2) L’utilisation des films multicouches de polyéléctrolytes (FMP) en tant que support d’adhérence cellulaire a montré que les CSM de la gelée de Wharton avaient un comportement spécifique selon la charge de surface conduisant vers une cultures tridimensionnelle inadaptée sur (PAH-PSS)3 PAH et en monocouche sur films (PAH-PSS)4, 3) Ces cellules pouvaient être cultivées sur des hydrogels d’alginate fonctionnalisés par les FMP pour fournir un feuillet cellulaire susceptible de recréer une media vasculaire. / Vascular diseases represent today one of the leading causes of global mortality and the number is increasing. Autologous transplants (limited availability) and synthetic prostheses unsuitable for vessels with a diameter less than 6 mm are not sufficient and there is now a real need of vascular substitute for small vessels. Thus, the concept of vascular engineering seems very promising. This approach is based on the use of "scaffold" associated with a cellular component to build in suitable environmental conditions, a vessel that reacts with the physiological constraints. To this aim, the functionalization of an incorporated media vascular smooth muscle cells (SMC) is a prerequisite. Insteag of using Mature CML which are not good candidates (loss of contractile phenotype in culture), we identified mesenchymal stem cells (MSCs) from Wharton's jelly (connective tissue of the umbilical cord) as a major cellular source. Their easiness of recovery, their presence in large numbers, their low immunogenicity, their proliferation and differentiation capacity make them excellent candidates for tissue engineering. In this work we determined the conditions for obtaining a functional CML phenotype and showed the impact of different environmental parameters (oxygen level, growth factors, serum content ...) on the behavior of CSM jelly Wharton. We have shown that: 1) these cells were able to differentiate into cells in contractile phenotype comparable to that of mature SMC. 2) The use of multilayer films of polyelectrolytes as cell adhesion support has shown that MSCs from the Wharton jelly had a specific behavior according to surface charge leading to an inappropriate three-dimensional cultures (PAHPSS)3-PAH and monolayer films on (PAH-PSS)4, 3) These cells could be grown on functionalized alginate hydrogels to provide a cellular sheet which may recreate a vascular media