Isolées à l'origine de la moelle osseuse , les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont depuis été obtenues à partir de divers tissus fœtaux, postnataux et adipeux et font l'objet d'un nombre croissant d'essais cliniques en tant que traitement potentiel d’un large éventail de maladies dégénératives et de troubles autoimmuns. En effet, les CSM se sont révélées comme étant une alternative de premier plan pour la réparation tissulaire et la modulation immunitaire. Des recherches intensives ont visé à élucider leurs caractéristiques et les mécanismes par lesquelles elles provoquent leurs effets thérapeutiques. Plus précisément, dans le cadre de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) allogéniques chez des patients pédiatriques atteints de leucémie, les CSM ont été utilisées pour favoriser la greffe et/ou pour induire une immunosuppression dans la maladie du greffon contre l’hôte (GVH), une complication fréquente et mortelle de la greffe pour laquelle il n’y a que très peu à offrir aux patients qui en sont touchés. En effet, la première indication thérapeutique d’un produit à base de CSM approuvée par Santé Canada a été indiquée pour la gestion de la GVH chez des patients pédiatriques ayant une maladie résistante aux traitements de première intention. Traduire la recherche fondamentale en applications cliniques nécessite un approvisionnement régulier en CSM viables et préalablement évaluées quant à leur sécurité et leurs propriétés fonctionnelles. La cryopréservation des CSM est l’élément clé qui permet de répondre à ces exigences. Suivant l'exemple des CSH, qui ont été cryoconservées et transplantées avec succès ultérieurement, les CSM ont donc été entreposées et décongelées selon les besoins des études cliniques de phase III pour le traitement de la GVH réfractaire aux traitements classiques. Ces études ayant obtenu des résultats mitigés et contrastants avec les résultats obtenus à partir de cellules fraîches dans des études cliniques de phases I et II, la cryopréservation a rapidement été reconnue coupable de leur échec. Une quantité remarquable de recherches et de ressources ont ensuite été consacrées à l'optimisation des protocoles, à la composition des milieux de congélation, aux dispositifs de refroidissement et aux conteneurs de stockage, ainsi qu'au développement de bonnes pratiques de fabrication afin de garantir que les CSM conservent leurs caractéristiques thérapeutiques après la cryoconservation et qu’elles soient sécuritaires pour une utilisation clinique. L’objectif principal de cette thèse était de clarifier l’impact de la cryopréservation sur les propriétés immunosuppressives des CSM. Alors que les études publiées sur le sujet faisaient, d’une façon assez équilibrée, l’état d’une réussite ou d’un échec à la cryopréservation des CSM en lien avec la conservation de leurs différentes fonctions in vitro et/ou in vivo dans des modèles animaux, mes travaux ont permis de revisiter l'impact de la cryoconservation sur les CSM en démontrant que des épisodes de réchauffement cellulaire survenant après leur congélation, plutôt que la cryoconservation en elle-même, étaient responsables de leurs altérations fonctionnelles. Si des précautions ne sont pas prises pour éviter le réchauffement des échantillons lors du processus d’entreposage dans l’azote liquide, ceux-ci vont subir une iii importante variation de température et ce, de façon étonnamment rapide et dommageable. Mes travaux ont démontré que l’inhibition de la prolifération lymphocytaire par les CSM diminuait drastiquement et de façon proportionnelle au réchauffement subi par les CSM pendant l’entreposage des produits cellulaires. Étonnamment, la viabilité des CSM n’était pas significativement diminuée par ces variations de température alors qu’elle est depuis toujours la principale mesure utilisée pour quantifier l’intégrité cellulaire postdécongélation. Dans une perspective de pouvoir prédire la présence d’une atteinte fonctionnelle des CSM induite par la cryopréservation, la suite de mes travaux a permis d’identifier la capacité d’adhésion des CSM comme étant un marqueur rapidement et facilement mesurable en laboratoire, mais surtout étant significativement liée à la capacité des CSM à inhiber une réponse lymphocytaire, laquelle est au cœur des symptômes de la GVH. Une grande rigueur pendant tout le processus de fabrication et de congélation des CSM ainsi que la génération de données reproductibles et fiables sont indispensables à l’obtention de preuves scientifiques de l'efficacité et de la qualité de cette thérapie cellulaire à grand potentiel dans le traitement des maladies auto-immunes. / Originally isolated from the bone marrow, mesenchymal stromal cells (MSC) have since been obtained from various foetal, postnatal and adipose tissues and are the subject of an increasing number of clinical trials as a potential treatment for a wide range of degenerative diseases and autoimmune disorders. Indeed, MSC have proven to be a leading alternative for tissue repair and immune modulation. Intensive research has aimed to elucidate their characteristics and the mechanisms by which they induce therapeutic effects. More specifically, in the context of transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells (HSC) in pediatric patients with leukemia, MSC have been used to promote transplantation and/or to induce immunosuppression in graft-versus-host disease (GVH), a frequent and fatal complication of transplantation for which there is very little to offer to patients who are affected. The first therapeutic indication for a MSC-based product approved by Health Canada was indicated for the management of GVH in pediatric patients with a resistant to first-line treatments disease. Translating basic research into clinical applications requires a regular supply of viable MSC that have been previously assessed for their safety and functional properties. Cryopreservation of MSC is the key to meeting these requirements. Following the example of HSC, which were cryopreserved and successfully transplanted later, MSC were therefore stored and thawed as needed in phase III clinical studies for the treatment of GVH refractory to conventional treatments. These studies having obtained mixed results and contrasting with the results obtained from fresh cells in clinical studies of phases I and II, cryopreservation was quickly found guilty of their failure. A remarkable amount of researches and resources were then devoted to the optimization of protocols, the composition of freezing media, cooling devices and storage containers, as well as the development of good manufacturing practices in order to guarantee that MSC retain their therapeutic characteristics after cryopreservation and that they are safe for clinical use. The main objective of this thesis was to clarify the impact of cryopreservation on the immunosuppressive properties of MSC. While the studies published on the subject made, in a fairly balanced way, the state of a success or a failure in cryopreservation of MSC in connection with the conservation of their different functions in vitro and/or in vivo in animal models, results presented in this thesis have allowed us to revisit the impact of cryopreservation on MSC by demonstrating that episodes of cell warming occurring after their freezing, rather than cryopreservation itself, were responsible for their functional alterations. If precautions are not taken to prevent the samples from heating up during the liquid nitrogen storage process, they will undergo a significant temperature variation, surprisingly quickly and very damagingly. My work has shown that the inhibition of lymphocyte proliferation by MSC decreases drastically and in proportion to the warming experienced by MSC during storage of cellular products. Surprisingly, the viability of MSC was not significantly reduced by these temperature variations, whereas it has always been the main measure used to quantify post-thaw cell integrity. In a perspective of being able to predict v the presence of a functional impairment of MSC induced by cryopreservation, the rest of my work then made it possible to identify the adhesion capacity of MSC as being a marker quickly and easily assessable in the laboratory, but especially being significantly linked to the ability of MSC to inhibit a lymphocyte response, which is at the heart of GVH symptoms. Great rigor throughout the manufacturing and freezing process of MSC as well as the generation of reproducible and reliable data are essential to obtain scientific evidences of the efficacy and quality of this cell therapy with very high potential in the treatment of autoimmune diseases

Le développement embryonnaire est un processus complexe finement régulé spatio-temporellement par de nombreux acteurs, qu’ils soient ADN, ARN ou protéines. De récents résultats suggèrent un rôle clef dans le développement et les maladies pour une sous-catégorie des ARNs impliqués dans ces mécanismes, les longs ARNs non-codants (lncRNAs). Caractérisés par leur incapacité à produire des protéines, ils sont difficiles à étudier par leur manque de conservation en séquence et leur expression tissu-spécifique. Ici, nous étudions un lncRNA conservé, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), nécessaire au maintien de l’état pluripotent des cellules souches et essentiel à leur différenciation en neurones. Toutefois, les mécanismes dans lesquels cet ARN est impliqué restent inconnus. Pour y répondre, nous avons analysé des données de séquençage d’ARN de différenciation neuronale d’ESCs murines. Nous avons identifié deux nouvelles isoformes spécifiquement exprimées dans les ESCs, sht.Tuna et alt.Tuna. Cette dernière est le résultat de l’épissage alternatif de l’exon 1 de Tuna. Cet épissage alternatif est également observé chez l’humain, démontrant une conservation du traitement de l’ARN entre la souris et l’Homme. Ces deux isoformes sont plus courtes d’environ 1,5kb à l’extrémité 3’ que le transcrit prédit de Tuna (full.Tuna). En effet, l’isoforme full. Tuna n’a pas pu être détectée dans les ESCs, et la surexpression de sht.Tuna a permis d’améliorer la reprogrammation vers l’état pluripotent. Ceci suggère que le rôle de Tuna est mécanistiquement différent dans les ESCs et les neurones. D’autre part, Tuna présente une région hautement conservée (~200bp) contenant un potentiel cadre de lecture pour un peptide de 48 acides aminés, détectable par surexpression de constructions tagguées FLAG. La mutation du codon AUG de cette séquence codante a abrogé l’effet de l’ARN sur la reprogrammation. Ceci implique un rôle du peptide dans l’acquisition de la pluripotence. Par ailleurs, Tuna a été détecté dans les fractions poly-ribosomales et cytoplasmiques d’ARN, supportant son éventuel potentiel codant. Ensemble, ces résultats démontrent que l’épissage alternatif et le potentiel codant d’un locus propre à un lncRNA est complexe et que cet ARN pourrait avoir de multiples fonctions dépendantes de l’état cellulaire / Embryonic development is a complex process finely regulated in time and place by numerous actors such as DNA, RNA, and proteins. Emerging evidence suggests a key role in development and disease for a subcategory of RNAs implicated in those mechanisms, the long non-coding RNAs (lncRNAs). Characterized by their incapacity to produce proteins, they have proven to be challenging to study due to the lack of sequence conservation and their tissue-specific expression. Here, we focus on a conserved lncRNA, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), that is required for maintaining embryonic stem cells (ESCs) in an undifferentiated state but is also essential for their differentiation towards a neuronal cell fate. However, the mechanism behind this dual role remains largely unknown. To address this, we analyzed available RNA-seq data on mouse ESC differentiation towards neurons. We identified two novel isoforms specifically expressed in ESCs, sht.Tuna and alt.Tuna. The latter isoform was the result of alternative splicing of the exon 1 of Tuna. This alternative splicing was also observed in human ESCs demonstrating a conserved processing of the RNA between mouse and human cells. Both new isoforms were ~1.5kb shorter at the 3'-end than the predicted full transcript of Tuna (full.Tuna). In fact, we failed to detect the full.Tuna isoform in ESCs, and overexpression of sht.Tuna isoform enhanced reprogramming to a pluripotent stem cell state. This suggests that the role of Tuna is mechanistically different in ESCs than in neurons. Besides, Tuna also contains a highly conserved region (~200bp) harboring a predicted 48-amino-acids coding sequence that is detectable upon overexpression if FLAG-tagged. Mutating the start codon of this peptide's coding sequence abrogated the enhanced reprogramming effect. This infers a role for the peptide in the acquisition of a pluripotent state. Moreover, Tuna was detected in poly-ribosomal and cytoplasmic RNA fractions further supporting a peptide coding potential. Taken together, our results demonstrate that alternative splicing and coding potential of a particular lncRNA locus is complex and that a lncRNA may have multiple functionality depending on cell state.

Les cellules souches neurales (CSNs) persistent dans la zone sous ventriculaire dans le cerveau adulte. Elles transitent d’un état quiescent à un état prolifératif afin de produire de nouveaux neurones. Les mécanismes régulant cette transition restent cependant méconnus. Les CSNs adultes étant enrichies en gènes calciques, nous avons déterminé si la transition d’un état quiescent vers un état de prolifération était calcium-dépendant. Pour ce faire, nous avons utilisé des mini-endoscopes miniatures pour observer la division cellulaire et sa régulation par la signalisation calcique chez la souris en mouvement libre. Nos données révèlent différents dynamiques calciques et niveaux intracellulaires calciques lors de la division des CSNs. Les expériences pharmacologiques et la technique d’édition génomique CRISPR-Cas9 montrent que les réserves intracellulaires calciques IP3-dépendant et les régulateurs à la protéine G régulent la transition d’un état quiescent vers l’état prolifératif. Nous avons aussi utilisé une approche optogénétique in vivo afin de mimer la dynamique calcique des CSNsquies centes pour maintenir les CSNs dans un état de quiescence et bloquer son activation vers un stade prolifératif. Nos résultats démontrent que les dynamiques calciques et le niveau intracellulaire calcique jouent un rôle important dans l’activation des CSNs. Ensuite, nous avons investigué le microenvironnement des CSNs notamment les vaisseaux sanguins et leur rôle dans la physiologie des CSNs. Les CSNs étendent un long prolongement basal et contactent les vaisseaux sanguins. Le contact direct et la libération de facteurs par les cellules endothéliales influencent le comportement des CSNs. Ici, nous avons utilisé des souris transgéniques pour altérer la communication entre les vaisseaux sanguins et les CSNs. Comme la signalisation Notch joue un rôle clé dans la signalisation des vaisseaux sanguins, nous avons inhibé in vivo la signalisation Notch spécifiquement dans les cellules endothéliales. Nous avons trouvé que l’inhibition de la signalisation Notch dans les cellules endothéliales à des stades précoces (P0) ou à des stades tardifs (P30) augmentait le nombre de CSNs. L’analyse morphologique des vaisseaux sanguins révèle aucune altération quand Notch est inhibé à des stades tardifs (P30). Ces résultats montrent que l’inhibition de la signalisation Notch maintient lesCSNs dans un état de quiescence. / Neural stem cells (NSCs) persist in the subventricular zone of adult brain and transit from the quiescent to the proliferative states to produce new neurons. The mechanisms regulating the transition froma quiescent to a proliferative state remain unclear. Since adult NSCs are enriched in genes associated with Ca2+ signalling pathways, we aimed to determine whether the transition from quiescence to aproliferative state is Ca2+ dependent. Here, we used miniature endoscopes (mini-endoscopes) to monitor NSC division and their regulation by Ca2+ signalling in freely behaving mice. Our data revealeddifferent Ca2+ dynamics and steady-state Ca2+ intracellular levels during NSC division. Pharmacological and in vivo CRISPR-Cas9 gene editing showed that IP3-sensitive intracellular stores and G-proteins regulators regulate the transition from quiescence to proliferation. We further used in vivo optogenetics to mimic Ca2+ dynamics of quiescence state to maintain NSCs in this state and prevent NSCsto transit into proliferative state. Our results demonstrate that Ca2+ dynamics and Ca2+ intracellularlevels play an important role in NSC activation. Next, we investigated NSCs microenvironmentmainly blood vessel and their role in their physiology. The NSCs contact the blood vessels by extending their basal processes. Direct cell-cell contact and the release of factors such as VEGF (vascularendothelial growth factor) by endothelial cells (EC) influence the NSC behaviour. As Notch pathwayis a key player in vasculature signalling, we inhibit in vivo the Notch signalling specifically in EC.We found that inhibition of Notch signalling in EC at early stage (P0) or later stage (P30) increasesNSC number. Morphological analysis of blood vessel reveals no alteration when Notch signalling isinhibited at later stages (P30). These finding showed that inhibition of Notch signalling in EC maintains NSC in quiescence state.

Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans les phénomènes de résistance aux traitements et de récidives dans les cancers du sein. Les neurotrophines comprennent le NGF et le BDNF, synthétisés sous forme de pro-neurotrophines. Elles se lient au récepteur commun p75NTR et à TrkA ou TrkB, fixant préférentiellement une (pro)neurotrophine. Récemment, le laboratoire Inserm U908 a démontré que le NGF/proNGF sont capables d’enrichir plusieurs lignées épithéliales cancéreuses de sein en CSC. L’objectif de ma thèse était de comprendre le rôle des neurotrophines dans la régulation des CSC de sein chez l’homme et dans le modèle canin. Nous avons montré que le BDNF/proBDNF peuvent également enrichir des lignées cancéreuses de sein en CSC in vitro. De plus, l’enrichissement en CSC induit par le NGF implique p75NTR et TrkA tandis que les effets du proNGF impliquent également EphA2.Sur 96 tumeurs mammaires canines issues de la biobanque d’OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), nous avons montré par immunohistochimie que le phénotype CD44+/CD24- seul n’est pas adapté pour détecter les CSC. CD24 est associé à des paramètres clinicopathologiques défavorables. Le proNGF, TrkA, et le BDNF sont exprimés dans une majorité des tumeurs, mais ne sont pas associés avec des paramètres clinicopathologiques. P75NTR et TrkB sont associés à des paramètres clinicopathologiques favorables et à une meilleure survie globale. De plus, p75NTR semble être un marqueur de cellules myoépithéliales. Ces résultats sont en accord avec les données obtenues dans le cancer du sein, soulignant la pertinence du modèle canin dans le développement de nouvelles thérapies ciblées. / Cancer stem cells (CSC) are implied in resistance to treatment and recurrences in breast cancer. Neurotrophins include NGF and BDNF, synthetized as proneurotrophins. They bind to common receptor p75NTR and to TrkA or TrkB, which bind specifically one (pro)neurotrophin. Recently, INSERM U908 demonstrated that NGF/proNGF are able to enrich several breast cancer cell lines in CSC. The objective of my PhD was to better understand the role of neurotrophins in the regulation of breast cancer stem cells both in human breast cancer and in the canine model.We showed that BDNF/proBDNF could also enrich the pool of CSC in several breast cancer cell lines in vitro. Furthermore, the action of NGF on the enrichment of CSC pool is mediated by p75NTR and TrkA, while the effects of proNGF also depend on EphA2. On 96 paraffin-embedded canine mammary tumors samples coming from the biobank of OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), we showed by immunohistochemistry that the phenotype CD44+/CD24- alone is not suitable to detect CSC. CD24 is associated with poor clinicopathological parameters. ProNGF, TrkA and BDNF are expressed in a majority of tumors, but are not associated with clinicopathological parameters. Positive correlation between P75NTR and TrkB expression and favorable clinicopathological parameters as well as better overall survival has been observed. Moreover, p75NTR seems to be a marker of myoepithelial cells. These results are consistent with the results obtained in human breast cancer, which underlines the relevance of the canine model in the development of new targeted therapies.

Sur le plan neuropathologique, les glioblastomes sont des lésions complexes, composées de cellules tumorales pléomorphes et migrantes, de vaisseaux anormaux en prolifération, de macrophages associés aux tumeurs et de plages de nécrose. Plus récemment, la démonstration de lexistence de cellules de glioblastome présentant des propriétés de cellules souches permit de relier ces éléments ensemble en suggérant pour la première fois une vision globale de la tumeur et de son interaction parfois fine avec son microenvironnement (Singh et al., 2004), puisque ces cellules sont même capables dadopter un destin endothélial et vasculaire (Bautch, 2010). Lexistence de ces cellules-initiatrices de gliome suggèrent en effet une hiérarchie cellulaire générant une organisation complexe et adaptative de la tumeur. Les mécanismes moléculaires à la base de lapparition, de la croissance et de la résistance thérapeutique de ces cancers ne sont cependant pas encore clairs et la compréhension de leur biologie reste donc une priorité. Dans ce travail, nous sommes partis de lhypothèse originale que les CIGs pourraient avoir des relations privilégiées avec les zones neurogéniques dans un cerveau adulte. Cest la raison pour laquelle nous avons réalisé une injection striatale droite de 50.000 cellules de glioblastome humain dans le cerveau de souris immunodéficientes adultes. Une fraction limitée des cellules injectées envahit spécifiquement les ZSVs de lhôte. Nous navons par contre jamais observé une migration vers le GD, lautre région neurogénique du cerveau adulte. Tout comme les progéniteurs neuronaux de la ZSV migrent le long du RMS vers le BO, ces cellules tumorales peuvent gagner le BO via la même route. De plus, ces cellules localisées dans la ZSV répondent aux principaux critères didentification dune CIG. Il semble donc y avoir une attirance particulière de la ZSV vis-à-vis de CIGs localisées à distance. Etant donné cette activité migratoire spécifique, nous avons tenté de caractériser le rôle éventuel de lOPN dans des cellules souches de gliome. Dans les cellules cancéreuses en général, lOPN est impliquée dans lactivité migratoire, lenvahissement tissulaire et la propagation des métastases. En collaboration avec le laboratoire de Vincent Castronovo, nous avons pu montrer que linhibition de lexpression de lOPN dans des cellules U87MG en culture maintenait lexpression des ARNm codant pour Sox2, Oct3/4 et Nanog à leur niveau de base et empêchait la formation de sphères en présence dun milieu de culture constitué de DMEM F12/B27 suppléé de EGF et bFGF. Ces premiers résultats obtenus in vitro suggérant un rôle de lOPN dans l'acquisition dun phénotype «souche» ont été confirmés par une étude in vivo, puisque la xénogreffe de cellules U87MG déficientes pour lOPN conduit à la perte de leur capacité à initier une tumeur. Enfin, toujours dans ce contexte de répartition de rôles pour différentes cellules au sein de la tumeur (hiérarchie), nous avons également étudié certains aspects des rapports existant entre les cellules tumorales. En collaboration avec le laboratoire de Pierre Robe, nous avons ainsi pu suggérer un rôle de «suppresseur de tumeur» pour une protéine impliquée dans le couplage cellulaire, en loccurrence la Cx30. En plus de la diminution de la prolifération tumorale dans des modèles expérimentaux in vitro et in vivo induite par une expression forcée de la Cx30, nous avons observé que le nombre de copie du gène codant pour la Cx30, soit GJB6 sur le chromosome 13q12, était fréquemment diminué dans les glioblastomes. De même, lexpression du transcrit de la Cx30 est plus faible dans les glioblastomes que dans les gliomes de bas grade ou encore chez les patients sains et son absence est corrélée à une altération des voies PI3K/Akt et ERK-MAPK.

Rapport de recherche bibliographique Diplôme d'études supérieures spécialisées : Ingénierie documentaire : Villeurbanne, ENSSIB : 2003. Rapport de recherche bibliographique Diplôme d'études supérieures spécialisées : Ingénierie documentaire : Lyon 1 : 2003.

Thèse doctorat : Médecine. Biologie cellulaire : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. 138-175 f. [350 réf.].

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé. Neurosciences : Paris 12 : 2004. / Thèse électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 80-93.

Thèse doctorat : Neurosciences : Paris 12 : 2003. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 349 réf.