Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1875.pdf: 2067578 bytes, checksum: 8ff948a97c937ef826fb4b4274b1c998 (MD5) Previous issue date: 2008-04-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work, several strategies were tested to improve the covalent multipoint attachment of chymotrypsin, carboxypeptidase A and cellulase on chitosan. Hybrid gels with different internal structures were obtained using sodium alginate, gelatin or κ-carrageenan and by changing the polymer concentration, 2.5-5.0% (m/v) and the activating reactant, glutaraldehyde, glycidol or epichlorohydrin. The addition of microorganisms to the hybrid polymer followed by cellular lysis, the increase of immobilization reaction time and the effect of the reduction of the final derivative with sodium borohydride were also tested. The influence of these variables on immobilization yields, recovered activities, and stabilization factors at 55°C and 65°C, were assessed. Chymotrypsin derivatives half-lives increased from 34 min at 55°C (for pure chitosan 2.5% activated with glutaraldehyde at pH 7.0, 4°C) to 468 min at 65°C (for chitosan 2.5%-carrageenan 2.5%, with the addition of 5% of S.cerevisiae, activation with epichlorohydrin, immobilization for 72 h at pH 10.05, room temperature and reduction of the final derivative). This best derivative was 9900-fold more stable than the soluble enzyme. A maximum load of 40 mg chymotrypsin.g.gel-1 was reached. The number of aldehyde and oxirane groups generated in the support, and of lysine residues of the enzyme involved in the multipoint attachment, as well SEM images of the gel structures, explain the obtained results. Carboxypeptidase A derivatives was analyzed. The results showed that immobilization via epichlorohydrin presented 40% (8.8) more stable derivatives than glutaraldehyde ones (5.3). However, derivative prepared with epoxides groups presented 100% of immobilization yield with 57% of recovered activity being 20-fold more stable than free enzyme after 48h of immobilization process. Derivatives activated by glutaraldehyde, epichlorohydrin and with epoxides presented diffusion limitations with Deff of 5.41.10-12, 5.59.10-12 m2.s-1 and 5.10.10-12 m2.s-1, respectively. To cellulase, assays of immobilization and saccharification of sugarcane bagasse cane were tested. The derivative used in a sequence of three distinct batches, was prepared with chitosan-alginate activated with glutaraldehyde/glycidol being 20-fold more stable than free enzyme. The best enzyme derivative was about 38 fold more stable activated via glycidol. The performance of the system of saccharification was excellent, indicating that enzyme immobilization may be a good alternative to reduce costs of ethanol production from lignocellulosic materials. / Neste trabalho de tese, várias estratégias foram analisadas com objetivo de melhorar e promover uma imobilização covalente multipontual de quimotripsina, carboxipeptidase A e celulase em quitosana. Géis híbridos com diferentes estruturas internas foram obtidos usando alginato de sódio, gelatina e κ-carragenana, bem como, variando a concentração de polímeros, 2,5-5,0% (m/v) e os agentes de ativação (glutaraldeído, glicidol e epicloridrina). A adição de células aos híbridos, seguido de lise celular, o aumento no tempo de imobilização e o efeito da redução no derivado final por borohidreto de sódio foram investigados. Foram averiguadas a influência destas variáveis nos rendimentos de imobilização, atividades recuperadas e estabilização a 55ºC e 65ºC. Derivados de quimotripsina tiveram um incremento de estabilidade de 34 min a 55ºC (para quitosana pura 2,5% ativada com glutaraldeído a pH 7,0 e a 4ºC) para 468 min a 65ºC (para quitosana 2,5%-carragenana 2,5% com adição de 5% de S.cerevisiae e ativado com epicloridrina com tempo de imobilização de 72h a pH 10,05 a 25ºC e reduzido). Este melhor derivado foi 9900 vezes mais estável que a enzima livre. A máxima capacidade de imobilização foi de 40 mg de quimotripsina g.gel-1. O número de grupos aldeídos e oxiranos gerados no suporte e a quantidade de lisina envolvidas na imobilização multipontual, bem como as imagens do MEV das estruturas dos suportes explicam os resultados obtidos. Derivados de carboxipeptidase A quando ativado com glutaraldeído mostrou uma melhor estabilização de 5,3 vezes, já para o ativado com epicloridrina foi de 8,8 vezes. Entretanto, o derivado preparado com grupos oxiranos apresentou 100% de rendimento de imobilização com recuperação de atividade de 57% e foi 20 vezes mais estável que a enzima livre a 55ºC com tempo de imobilização de 48h e bloqueio de grupos epóxidos com glicina. Os derivados ativados com glutaraldeído, epicloridrina e epoxilado apresentaram sérias limitações difusionais na hidrólise de hipuril-Lfenilalanina com Deff de 5,41.10-12 , 5,59.10-12 m2.s-1 e 5,10.10-12 m2.s-1, respectivamente. Ensaios de imobilização da celulase e sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar foram realizados concomitantemente. O derivado utilizado em uma seqüência de três bateladas foi obtido com quitosana-alginato ativado com glutaraldeído/glicidol sendo este derivado 20 vezes mais estável que a enzima livre. Entretanto o melhor derivado obtido nos ensaios de imobilização foi com ativação de glicidol com uma estabilidade de aproximadamente 38 vezes seguido da imobilização por encapsulação seguido de reticulação com glutaraldeído com um fator de estabilidade de aproximadamente 33 vezes em relação à livre. O desempenho do sistema de sacarificação foi muito bom, indicando a reusabilidade da celulase imobilizada é uma boa alternativa para reduzir custos na produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos.

A linhagem S1M29 de Penicillium echinulatum é um fungo filamentoso cujo sistema celulolítico tem potencial para aplicação em processos de degradação de materiais lignocelulósicos visando a obtenção de produtos com interesse biotecnológico, como o etanol de segunda geração. A abundância de biomassas lignocelulósicas associada à busca por alternativas aos combustíveis fósseis faz aumentar o interesse em estudos que envolvam a elucidação dos mecanismos de secreção de enzimas lignocelulolíticas. Neste estudo, o P. echinulatum S1M29 foi crescido em condições de indução para a produção de endoglicanases, celobiohidrolases, β-glicosidases, xilanases e swoleninas. Foram avaliados os perfis enzimáticos em géis de poliacrilamida e o padrão de expressão gênica para estas proteínas. Observou-se que a produção enzimática foi favorecida pela presença de celulose Celufloc E® e bagaço de cana-de-açúcar (BCA) no meio de cultivo em comparação à glicose, sendo que o uso de resíduo de biomassa proporcionou a obtenção dos melhores rendimentos. Resultado semelhante foi atingido na análise dos perfis de secreção enzimática em gel de poliacrilamida, sugerindo ainda, a presença de uma endoglicanase constitutiva de aproximadamente 80 kDa. O estudo de qRT-PCR revelou a presença de quatro genes para endoglicanases com padrão de expressão distintos, destacando-se um acúmulo de transcritos 9779,19 vezes superior à amostra calibradora do gene egl1 em 24 h de cultivo no meio formulado com celulose Celufloc E®. Este mesmo gene gerou 1257,58 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora em meio suplementado com BCA. Na avaliação da expressão relativa do gene para celobiohidrolase obteve-se expressão superior no meio formulado com BCA em 48 h em relação ao meio com celulose Celufloc E® em 24 h, correspondendo, respectivamente, a 6464,49 e 3093,26 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora. O gene para β-glicosidase expressou-se em meio formulado com BCA no início do cultivo, embora a atividade desta enzima tenha ocorrido ao final do cultivo. A expressão de xilanases foi mais significativa com o uso de celulose Celufloc E® no meio de cultivo. Já o gene para swolenina apresenta um perfil de expressão com valores semelhantes em comparação ao uso de celulose Celufloc E® e BCA no meio de cultivo, apesar da presença de BCA ter proporcionado uma expressão mais tardia. Para todos os genes avaliados foram verificados valores muito reduzidos de expressão quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono para o P. echinulatum. Observou-se ainda uma expressão coordenada de genes codificadores de endoglicanases, celobiohidrolase, β-glicosidase e swolenina. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-01-27T12:06:29Z No. of bitstreams: 1 Tese Denise Zampieri.pdf: 4586084 bytes, checksum: be5eb9fbb555f957a4e737205334ac6d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-27T12:06:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Denise Zampieri.pdf: 4586084 bytes, checksum: be5eb9fbb555f957a4e737205334ac6d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. / The strain S1M29 of Penicillium echinulatum is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential for application in the degradation process of lignocellulosic materials to obtain products of biotechnological interest, such as second-generation ethanol. The availability of lignocellulosic biomass associated with the search for alternatives to fossil fuels increases the interest in studies that involve understanding the secretion mechanisms of lignocellulolytic enzymes. In this study, P. echinulatum S1M29 was grown under inducing conditions for the production of endoglucanases, cellobiohydrolases, β-glucosidases, xylanases and swollenins. The enzyme secretion profiles were evaluated in polyacrylamide gels and the pattern of gene expression for these proteins was also assessed. It was observed that enzyme production was enhanced in the presence of cellulose Celufloc E® and sugar cane bagasse (SCB) in the culture medium compared to glucose, with the use of biomass residue providing the best yields. A similar result was obtained analyzing enzyme secretion profiles in polyacrylamide gels, suggesting the presence of constitutive endoglucanases of approximately 80 kDa. Studies with qRT-PCR revealed the presence of four genes encoding endoglucanases with distinct expression patterns, standing out an accumulation of transcripts from egl1 gene 9779.19 times higher than the calibrator sample in 24 h of growth in medium formulated with cellulose Celufloc E®. The same gene generated 1257.58 more accumulated transcripts than the reference sample in medium supplemented with SCB. Evaluation of gene expression for cellobiohydrolase yielded higher expression levels in the medium formulated with SCB in 48 h, in comparison to the medium containing cellulose Celufloc E® in 24 h, corresponding, respectively, to 6464.49 and 3093.26 more accumulated transcripts than the reference sample. The β-glucosidase gene was expressed in medium formulated with SCB at the beginning of growth, as opposed to that seen for activity of this enzyme, which occurred at the end of cultivation. The xylanase expression was more significant with the use of cellulose Celufloc E® in the culture medium. On the other hand, the gene for swollenin presents an expression profile with similar values compared to using cellulose Celufloc E® and SCB in the culture medium, although the presence of SCB has provided a later expression. Very low values of gene expression have been found for all genes evaluated when glucose was used as carbon source for P. echinulatum. A coordinated expression of endoglucanases, cellobiohydrolase, β-glucosidase and swollenin was was also verified.

Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-07-14T14:43:43Z No. of bitstreams: 1 Tese Laisa dos Reis.pdf: 202579 bytes, checksum: 65cd12057624b5708899c86c663d936c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-14T14:43:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Laisa dos Reis.pdf: 202579 bytes, checksum: 65cd12057624b5708899c86c663d936c (MD5) Previous issue date: 2017-07-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul, FAPERGS.

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Haroldo Alves Pereira Junior / Resumo: Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na mineralização da matéria orgânica, liberação de carbono e nutrientes na forma de serem assimilados. Devido a esses importantes fatores é que cada vez mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose através da quebra da ligação ~,1-4. A partir disso foi realizada uma busca de gene r~lacionado com a hidrolise da celulose em biblioteca metagenômica de DNA extraído de solo de arboreto de eucalipto. Foram realizado testes bioquímicos e moleculares, partindo de um par de oligonucleotídeo iniciadores degenerado que foi construído para identificar gene da glucanase que está ligado na hidrolise da celulose. Com o teste bioquímico foi possível selecionar clones que estão relacionados com hidrolise da celulose, a confirmação dos clones positivos foi feita através de reações de PCR. Após a escolha do clone foi feita uma sub-biblioteca, os clones da sub-biblioteca foram sequenciados e através do sequenciamento foi possível encontrar gene relacionado à hidrólise da celulose. / Abstract: The microorganisms show a abundant genetic diversity and perform unique and crucial ecosystems maintence, one of this function is the produce of extracellular enzymes that mineralize organic matte and release carbon and nutrients in forms that can be assimilated. Due this important factors its increasing the search of enzymes who can be use on the manufacturing with better utilization and low cust. The cellulase belongs to this class of enzymes and its formed by a complex multienzimatic who its able to hydrolisar a cellulose trough the broke of the linked (3- 1-4. The cellulose, o homopolissacarideo wich we see in big amount on the biosphere. So, was made a screening to genes related with cellulase in metagenômic library of aboreto of eucalyptus cloning larg fragmenets in vector cosmídeo, with size who was between 30 and 45kb. There was made tests biochemists and molecular starting of a couple degenerate primes wich vvas made to identify the gene of glucanase that its connected in hydrolise da cellulose.With this tests we could detect the dones related with hydrolose of cellulose. / Mestre

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Ivanise Guilherme Branco / Resumo: Atualmente, as celulases são enzimas bastante estudadas para a hidrólise de resíduos ligno-celulósicos para obtenção de açúcares fermentescíveis utilizáveis em diferentes processos biotecnológicos. Um destes resíduos é o bagaço de cana proveniente da indústria sucroalcooleira, que pode ser uma alternativa para produção de bioetanol, desde que haja tecnologia eficaz e econômica para a conversão em açúcar (glicose ou xilose). O objetivo deste trabalho foi encontrar fungos celulolíticos produtores de enzimas que sejam eficientes nos processos de degradação da biomassa lignocelulósica. No presente trabalho foram selecionados 12 fungos celulolíticos previamente isolados pelo Laboratório de Biotecnologia Industrial (UENSP - Assis). Estes fungos foram cultivados em bagaço de cana-de-açúcar como substrato e para seus extratos foram testados suas atividades para celulases (FPase) e endoglucanase (CMCase) e comparados com o T.reesei CCT 2768. Os fungos mais eficientes foram às linhagens: M51, FS09, MG10A e FS11A. Destes, se destacaram respectivamente para atividade FPase e CMCase, os fungos FS09 com 0,054 FPU/mL ou 1,79 FPU/g de substrato e 0,874 U/mL ou 29,1 U/g de substrato; seguido pela M51 com 0,049 FPU/mL ou 1,62 FPU/g de substrato e 1,094 U/mL ou 36,46 U/g de substrato, valores vezes superior em relação ao fungo T. reesei CCT 2768, espécie considerada uma dos principais microrganismos de referência em estudos para a produção de celulases. A imobilização da celulase comercial em microesferas de alginato e de hidrogéis (alginato/quitosana) mostraram resultados promissores para os protocolos com adição da enzima durante o processo de formação dos derivados, tanto os peletes como os biofilmes, sendo os melhores derivados, o pelete B e o biofilme E'. Com estes protocolos de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays the cellulases are widely studied for the hydrolysis of ligno-cellulosic residues to obtain fermentable and economic sugars for several biotechnological applications. Cane bagasse is the most important residue from sugar factory, which could be an alternative of substrate to produce bioethanol or other biotechnological production, but it depending on the economical technology for the conversion in simple sugar (glucose or xylose). In the present study was selected 12 cellulolytic fungi, previous isolated by the Laboratory of Industrial Biotechnology (UNESP - Assis). These fungi were cultivated in cane bagasse as substrate and their extracts was tested as FPU and Endoglucanase (CMCase) activity and compared with T. reesei CCT 2768. The most efficient fungi were the not yet identified strains: M51, FS09, MG10A e FS11A. Respectively for FPase and CMCase activity, the strain FS09 shows 0.054 FPU/mL or 1.79 FPU/g of substrate, and 0.874 U/ml or 29.1 U/g of substrate, followed by M51 with 0.049 FPU/mL or 1.62 FPU/g of substrate, and 1.094 U/mL or 36.46 U/g of substrate. These results were higher than T. reesei CCT 2768, considered as a important microorganism for the studies of the production of cellulose. Immobilization of commercial cellulase in microspheres of alginate and hydrogels (alginate/chitosan) was procedure and it showed promising results for the protocols of the enzyme with added during the formation of derivatives (immobilized enzymes). The best immobilization of cellulase was obtained with the pellets and biofilms produced by the protocols B and E', respectively. These protocols were responsible for the increase in cellulolytic activity of 56% (protocol B) and 44% (protocol E') when compared with the enzyme used in the immobilization process due to the 13 and 28 recycles of the enzyme. It is hoped that... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fábio Márcio Squina / Banca: Roberto da Silva / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Leandro Cristante de Oliveira / Banca: André Ricardo de Lima Damásio / Resumo: A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-β-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades β-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por β-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de β-glucanos... / Abstract: The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-β-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has β-glucanase and xiloglucanase activities, preferring β-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of β-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material / Doutor

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Patrícia Peres Polizelli / Banca: . Vanildo Luiz Del Bianchi / Resumo: As celulases podem ser utilizadas na bioconversão da fração de celulose de resíduos agro-industriais em açúcares fermentáveis, visando a obtenção de combustíveis renováveis e produtos químicos. As β-glicosidases são cruciais para a total sacarificação da celulose, mas na maioria dos casos elas são fortemente inibidas pelo seu produto, a glicose. Portanto, o conhecimento das cinéticas de hidrólise e as respostas dessa enzima frente a diferentes substratos e produtos pode definir a eficiência de hidrólise e do processo biotecnológico no qual poderia ser incorporada. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a β -glicosidase de 50 kDa (BG50) produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 cultivado em estado sólido, em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). O zimograma do extrato bruto evidenciou duas isoformas, de aproximadamente 200 e 50 kDa, as quais foram separadas por cromatografia de filtração em gel. A caracterização da BG50 mostrou atividade ótima a 60 ˚C e pH 5,0 quando usado o 4-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo (pNPG), enquanto com celobiose o valor da temperatura e pH ótimo foram de 50 ˚C e pH 4,5, respectivamente. Testes realizados com adição de íons e reagentes mostraram diferenças nos efeitos sobre a atividade da enzima dependendo do substrato, principalmente com a adição de Ditiotreitol (DTT) utilizando celobiose, e inibição completa com Cu2+ e Fe3+ para pNPG e celobiose. Além disso, a enzima não mostrou efeito inibitório quando testada na presença de nove compostos fenólicos, uma característica significativa. Os estudos cinéticos revelaram um perfil de inibição competitiva pela glicose quando utilizado pNPG com valor de KI=1,5 mM e um Km significativamente menor (0,52 mM) pelo pNPG do que pela celobiose (Km=8,50 mM). Os parâmetros termodinâmicos mostraram que a BG50 é bastante... / Abstract: Cellulases can be used in bioconversion of cellulose from agro-industrial waste into fermentable sugars in order to obtain renewable fuels and chemicals. The β-glucosidases are crucial to the overall saccharification of cellulose, but in most cases, they are strongly inhibited by its product, glucose. Therefore, knowledge of the hydrolysis kinetics of the enzyme and its responses against different substrates and products can set the hydrolysis efficiency and possible incorporation in biotechnological process. This study aimed to characterize the 50 kDa β-glucosidase (BG50) produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 grown in solid state, in a mixture of sugarcane bagasse and wheat bran (1:1). The zymogram of the crude extract showed two isoforms of 200 and 50 kDa, which were separated by gel filtration chromatography. The characterization of BG50 showed optimal activity at 60 °C and pH 5.0 when used pNPG, whereas using cellobiose the values of the optimal temperature and pH were 50 °C and pH 4.5, respectively. Tests with addition of reactants and ions showed differences in the effects on enzyme activity depending on the substrate, especially with the addition of dithiothreitol (DTT) utilizing cellobiose, and complete inhibition with Cu2+ and Fe3+ for 4-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose. Furthermore, the enzyme showed no inhibitory effect when tested in the presence of nine phenolic compounds, a remarkable characteristic. Kinetic studies showed a profile of competitive inhibition by glucose when using pNPG with Ki = 1.5 mM and Km significantly lower (0.52 mM) with pNPG than using cellobiose (Km = 8.50 mM). The thermodynamic parameters show that BG50 is quite stable, highlighting its half life of 855.6 minutes at 60 ° C, but above this temperature easily denatured. The results emphasize the importance of investigating ... / Mestre

Orientador: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli / Resumo: Indústrias e governos buscam pela obtenção de biocombustível celulósico, entretanto a desconstrução do arranjo lignocelulósico para obtenção de açúcares livres de forma eficiente e economicamente viável ainda é um grande desafio. Avanços conquistados através da metagenômica ressaltam sua aplicação como alternativa para compreender e desvendar o grande potencial metabólico presente nos ambientes a fim de superar tais desafios. Contudo, ainda são poucos os trabalhos voltados à cana-de-açúcar. O solo trata-se da maior fonte microbiana de todo o planeta, sendo essa biodiversidade ainda desconhecida, esta comunidade microbiana fornece um ponto de partida para a exploração de novas enzimas responsáveis para a degradação de biomassa vegetal. Este trabalho buscou acessar o panorama do perfil taxonômico e funcional do metagenoma da comunidade microbiana presente em solo sob cultivo de cana-de-açúcar contendo palhada sobre o mesmo, possuindo como foco enzimas envolvidas na hidrólise de materiais lignocelulóscicos. Os dados encontrados demonstraram uma variedade de famílias enzimáticas envolvidas na degradação do complexo lignocelulósico. Verificou-se a presença de 27 famílias de Glycoside Hydrolases (GH), 21 famílias de Carbohydrate-Binding Module (CBM), 11 famílias de Carbohydrate Esterases (CE) e 4 famílias de Auxiliary Activities (AA). Os filos mais abundantes neste ambiente foram Proteobacteria e Actinobacteria, possuindo o último reconhecida importância industrial dadas suas enzim... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Industries and governments seek for obtaining cellulosic biofuel, but the deconstruction of lignocellulosic arrangement to obtain free sugars efficiently and economically viable is still a big challenge. Advances made by metagenomics emphasize their application as an alternative to understand and unravel the great metabolic potential present in the environment in order to overcome such challenges. However, there are few studies related to sugarcane. The soil is the largest source of microbial whole planet, and its biodiversity still unknown, this microbial community provides a starting point for the exploration of new enzymes responsible for the degradation of plant biomass. This study aimed to access the overview of taxonomic and functional profile of the metagenome of soil under sugarcane cultivation containing straw on it, having focused on enzymes involved in the hydrolysis of lignocellulosic materials. The soil metagenome under sugarcane cultivation showed a variety of enzyme families involved in the degradation of the lignocellulosic complex. The presence of 27 Glycoside Hydrolases (GH) families, 21 Carbohydrate-Binding Module (CBM) families, 11 Carbohydrate Esterases (CE) families and 4 Auxiliary Activities (AA) families has been verified. Proteobacteria and Actinobacteria were the abundest phyla in this environment, which the last has recognized industrial importance given their enzymes with resistence to changes in pH and temperature. Such microbial community showed ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas. / The increase in global energy demand, shrinkage perspective of energy resources and global concern about environmental issues, aroused interest in finding alternative sources of energy. Lignocellulosic biomass is plentiful and inexpensive, and has the potential to complement the large-scale production of fuel. The degradation of molecules that constitute the cell wall to fermentable sugars and then to ethanol, occurs via the enzymatic hydrolysis of biomass. However, the use of enzymes for this purpose is in exploratory stage and represents a bottleneck in the implementation of 2G ethanol technologies in industrial scale, supporting studies about biochemically most active, stable and economically viable cellulases. This work aimed the characterization of endoglucanase I from fungus Trichoderma harzianum and for that, was performed expression and biochemical and biophysical assays of the catalytic domain (ThCel7B-CCD) and full protein (ThCel7B-full). The enzyme exhibited a acidophilic profile, with optimal activity at pH 3.0 at 55°C. The protein was also able to hydrolyze a variety of substrates, with higher hydrolytic activity in β-glucano (75 U mg-1). Analyzing the thermal stability as pH 5, residual activity remained intact for over 2 months. Another important feature was the high degree of synergy between ThCel7B and ThCel7A (DS 3). Electron microscopy analysis of oat samples subjected to hydrolysis with ThCel7B show the substrate degradation effects in relation to the control samples. All these results, as well as important for understanding the molecular mechanism of ThCel7B and other endoglucanases of GH7 family, also disclose an enzyme of biotechnological interest because the acid behavior and thermal stability are promises of industrial applications under extremely acidic conditions.