Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2540.pdf: 2404853 bytes, checksum: 5e1d90d2a3d16f30a431e16e644da26d (MD5) Previous issue date: 2009-04-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / The sugarcane weevil, Sphenophorus levis, is an important pest in sugarcane culture in São Paulo state, Brazil. To complete its life cycle, S. levis may depends on microorganisms that inhabit its intestinal tract and play an important key in the insect physiology and nutrition. In this study we report the characterization of the intestinal microbiota from population of insect larvae from field and laboratory. Analysis of 16S rDNA sequences revealed a total of fourteen genera, one group from Candidatus category and two uncultivable groups represented by Alfa-Proteobacteria, Beta-Proteobacteria, Gamma-Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes phylum. Microorganisms isolated through culture-dependent methods were classified according morphological parameters and using 16S rDNA molecular marker. In addition to bacteria, four filamentous fungi were isolated. It was observed a slightly higher bacterial diversity in field than in laboratory according to Shannon index (Field H'= 3,36; Laboratory H'= 3,26). It is also our objective in this work to search for microorganisms capable to degrade cellulose, an important event in the insect attack. From the cultivable microorganisms, five genera of bacteria and two filamentous fungi presented cellulolytic activity. This is the first study about S. levis microbiota which may contribute to understand the interaction plant-pathogen and also be useful for future development of new strategies for control of S. levis in sugarcane cultivation. / A cana-de-açúcar é uma das mais importantes culturas no Brasil. No entanto, muitas pragas atacam esta cultura causando prejuízos econômicos. O gorgulho da cana-deaçúcar, Sphenophorus levis, é uma importante praga na cultura canavieira no Estado de São Paulo. Para completar o seu ciclo de vida, S. levis parece depender de microorganismos que habitam o seu trato intestinal e desempenham um importante função na fisiologia e nutrição do inseto. Neste estudo, nós realizamos a caracterização da microbiota intestinal de população de larvas de inseto campo e de laboratório. As análises das seqüências de 16S rDNA revelaram um total de catorze gêneros, um grupo da categoria Candidatus e dois grupos nãocultiváveis representados pelos filos Alfa-Proteobacteria, Beta-Proteobacteria, Gamma- Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes tanto em larvas do campo quanto nas do laboratório. Os microrganismos isolados através dos métodos dependentes de cultura foram agrupados de acordo com parâmetros morfológicos e através do marcador moléculas 16S rDNA. Além das bactérias também foram isolados quatro fungos filamentosos. Observou-se uma diversidade bacteriana levemente superior no campo do que no laboratório de acordo com o índice de Shannon (Campo H '= 3,36; Laboratório H' = 3,26). É também nosso objetivo neste trabalho encontrar microorganismos capazes de degradar celulose, um importante evento no ataque do inseto. Dos microorganismos cultiváveis, cinco gêneros de bactérias e dois fungos filamentosos apresentaram atividade celulolítica. Este é o primeiro estudo sobre a microbiota do S. levis que pode contribuir para a compreensão da interação planta-patógeno e também ser útil para o futuro desenvolvimento de novas estratégias de controle de S. levis no cultivo da cana-de-açúcar.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3875.pdf: 1789055 bytes, checksum: a2495b6571816afdda74f70d8d9b300d (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / B-glucosidase (BG) is an important enzyme for several biotechnological applications. This enzyme plays an important role in hydrolyses of lignocellulosic biomass in order to produce second generation ethanol (2G ethanol). The enzimatic hydrolysis of cellulose requires the sinergystic action of endoglucanases, exoglucanases and β-glucosidases. Endo e exoglucanases are strongly inhibited by cellobiose and its accumulation into reaction medium decreases the hydrolysis rate. The supplementation of the reaction medium with BG can reduce the inhibition effect, leading to higher conversions of cellulose to glucose. In this work, BG was immobilized on different solid supports in order to obtain an active and stable derivative to be used in hydrolyses of sugarcane bagasse. BG was immobilized on glyoxyl-agarose (GA) and polyacrylic matrix (MP) at 25oC and pH 9.0 and 4.8, respectively. To improve the immobilization yield on glyoxyl-agarose at pH 9.0, a chemical amination of the enzyme surface was required. However, BG was inactivated during the immobilization reaction due to alkaline conditions that are required to immobilize enzymes on glyoxylagarose support. Nevertheless, the presence of a competitive inhibitor (glucose) during immobilization of BG preserved about 70% of the initial activity. However, the reduction step with sodium borohydride (end point of the reaction) drastically reduced the derivative activity even in the presence of glucose. The BG immobilization in presence of competitive inhibitor allowed the preparation of a derivative approximately 4 times more active than one prepared in inhibitor absence. On the other hand, the best derivative was prepared adsorbing the enzyme on polyacrylic resin covered with carboxylic groups. After four hours of reaction, the immobilization yield and the recovered activity were ca. 71% and 97%, respectively. Pretreated sugarcane bagasse (10% w/v, dry basis) was hydrolyzed at 50oC, pH 4.8 (50 mM sodium citrate buffer), for 24 h, using soluble cellulase (Acellerase 1500) in the enzyme/substrate ratio of 20 FPU/gcellulose. Hydrolyses under same conditions were performed by supplementing the reaction medium with BG immobilized on glyoxyl-agarose (BG-GA) or BG immobilized on polyacrylic resin (GA-MP) in the enzyme/substrate ratio of 120 U/gcellulose. Five batches were performed under - xi - conditions described above by reusing the immobilized BG and non-converted cellulose after thoroughly washing with distilled water. The supplementation of the reaction medium with immobilized BG enhanced the cellulose conversions in all batches. This behavior is due to the fact that BG removes cellobiose from the reaction medium, avoiding its accumulation, which could inhibit the endoglucanases and exoglucanases. However, a decrease of the cellulose conversion after the second batch was observed (cellulose conversion decreased from ca. 50% to 15-25%). Anyway, this work shows that supplementation of the commercial enzymatic complexes with immobilized BG is advantagous. However, the stabilization of the immobilized BG is still required. / B-Glicosidase (BG) é uma enzima de grande importância em inúmeras aplicações biotecnológicas. Essa enzima desempenha um papel muito importante na hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica visando a produção de etanol de segunda geração (etanol 2G). A hidrólise enzimática da celulose requer a ação sinergística de endoglicanases, exoglicanases e β-glicosidases. Endo e exoglicanases são fortemente inibidas por celobiose e seu acúmulo no meio reacional reduz a taxa de hidrólise. A suplementação do meio reacional com BG pode reduzir o efeito inibitório, levando a conversões maiores de celulose a glicose. Neste trabalho BG foi imobilizada em diferentes suportes sólidos visando a obtenção de um derivado ativo e estável para uso em reações de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. BG foi imobilizada em glioxil-agarose (GA) e resina poliacrílica catiônica (MP) a 25ºC e pH 9,0 e 4,8, respectivamente. Para melhorar o rendimento de imobilização de BG em glioxilagarose a pH 9,0 foi necessária uma aminação química da superfície da enzima. Entretanto, BG era inativada durante a imobilização, devido às condições alcalinas requeridas para imobilização de enzimas em glioxilagarose. Contudo, a presença de um inibidor competitivo (glicose) durante a imobilização de BG preservou aproximadamente 70% da atividade inicial. Mesmo na presença de glicose, a etapa de redução com borohidreto de sódio (finalização da reação de imobilização) reduziu drasticamente a atividade da enzima imobilizada. A imobilização de BG na presença de inibidor competitivo permitiu a preparação de um derivado cerca de 4 vezes mais ativo que aquele preparado na ausência do inibidor. Por outro lado, o melhor derivado foi preparado adsorvendo BG em resina poliacrílica funcionalizada com grupos carboxílicos. Após quatro horas de reação, o rendimento de imobilização e a recuperação de atividade foram aproximadamente 71% e 97%, respectivamente. Bagaço de cana pré-tratado (10% m/v, base seca) foi hidrolisado a 50°C, pH 4,8 (tampão citrato de sódio 50 mM), por 24h, utilizando celulase solúvel (Acellerase 1500) na relação enzima/substrato de 20 FPU/gcelulose. Hidrólises nas mesmas condições foram realizadas - ix - suplementando o meio reacional com BG imobilizada em glioxil-agarose (BGGA) ou BG imobilizada em matriz poliacrílica (BG-MP) na relação enzima/substrato de 120 U/gcelulose. Cinco bateladas foram realizadas nas condições descritas acima, reutilizando a BG imobilizada e a celulose não convertida, após lavagem abundante com água destilada. A suplementação do meio reacional com BG imobilizada contribuiu para a obtenção de maiores conversões de celulose em todas as bateladas, devido ao fato da BG remover celobiose do meio reacional, evitando seu acúmulo, o qual poderia inibir a ação das endoglucanases e exoglucanases. Entretanto, observou-se uma redução da conversão de celulose após a segunda batelada (de 50% para 15-25%). De qualquer forma, esse trabalho mostra que a suplementação dos complexos enzimáticos comerciais com BG imobilizada é vantajosa, entretanto, a estabilidade da BG imobilizada ainda precisa ser melhorada.

Resumo: Dos 27 microrganismos recém isolados, A. fumigatus M.7.1 e Myceliophthora sp M.7.7 foram os melhores produtores de FPase (0,8 e 2,0 U/g de substrato) e xilanase (1040 e 1292 U/g de substrato), quando cultivados por fermentação em estado sólido (FES) em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). As produções máximas de xilanase (7237,9 U/g de substrato) e endoglucanase (46,2 U/g de substrato) por A. fumigatus M.7.1 foram observadas pelo cultivo do fungo em palha de milho e farelo de trigo (9:1 p/p) e bagaço de cana e farelo de trigo (9:1 p/p), respectivamente. Em relação ao isolado Myceliophthora sp M.7.7, os picos de produção de ambas as enzimas (xilanase: 1044,6 U/g de substrato; endoglucanase 53,7 U/g de substrato) foram obtidos quando este foi cultivado em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (9:1 p/p). A endoglucanase e xilanase produzida por A. fumigatus M.7.1 apresentaram atividade ótima em pH 4,5, a 70 e 60 ºC, respectivamente. Nos ensaios com a linhagem Myceliophthora sp M.7.7, ambas as enzimas apresentaram maior atividade em pH 5,0 a 65-70 ºC. Ambas as enzimas de Myceliophthora sp M.7.7 e a endoglucanase de A. fumigatus M.7.1 mantiveram aproximadamente 70-100% da atividade inicial na faixa de pH entre 3,5 a 9,0 e nas temperaturas de 35 a 65 ºC. A xilanase de A. fumigatus M.7.1 manteve-se estável em pH entre 5,5 e 10,5 e 40 e 50 ºC, respectivamente. Dos tratamentos ao qual o bagaço foi submetido, o que mostrou maior eficiência na liberação de açúcares redutores (0,09%) e compostos fenólicos (0,74%), foi a solução de glicerol em microondas por 5 min. O bagaço de cana pré tratado com glicerol foi incubado com o preparado enzimático de A. fumigatus M.7.1 a 55 ºC. Após 24 h de incubação, foram liberados 0,7 mg/mL de açúcar redutor. As mesmas condições foram utilizadas na sacarificação do bagaço utilizando o extrato enzimático... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The microorganisms A. fumigatus M.7.1 and Myceliophthora SP M.7.7 were the best producers of FPase (0,8 and 2,0 U/g of substrate) and xylanase (1040 and 1292 U/g of substrate) of the 27 isolated microorganisms, when cultivated by solid state fermentation (SSF) in a mixture of cane bagasse and wheat bran (1:1). The greatest production of xylanase (7237,9 U/g of substrate) and endoglucanase (46,2 U/g of substrate) by A. fumigatus M.7.1 were noted by the fungi cultivation in corn straw and wheat bran (9:1 p/p) and cane bagasse and wheat bran (9:1 p/p), respectively. In the isolated Myceliophthora sp M.7.7, the peak production of the both enzymes (xylanase: 1044,6 U/g of substrate; endoglucanase 53,7 U/g of substrate) were obtained when the microorganism were cultivated in a mixture of cane bagasse and wheat bran (9:1 p/p). The endoglucanase and the xylanase produced by A. fumigatus M.7.1 showed higher activity in pH 4,5, at 70 and 60 oC, respectively. In the essays with the Myceliophthora sp M.7.7 strains, the both enzymes showed higher activity in pH 5,0, at 65-70 oC. The both enzymes of Myceliophthora sp M.7.7 and the endoglucanase of A. fumigatus M.7.1 maintained approximately 70-100% of the initial activity between pH 3,5 and 9,0 and between 35 and 65 oC. The xylanase of A. fumigatus M.7.1 was stable between the pH 5,5 and 10,5 and the temperature 40 and 50 oC. About the treatments of the bagasse, the most efficient in the liberation of reducing sugars (0,09%) and phenolic compounds (0,74%) was the glycerol solution in microwave for 5 minutes. The cane bagasse pretreated with glycerol was incubated with the enzymatic solution of A. fumigatus M.7.1 at 55 oC. After 24 hours of incubation, 0,7mg/mL of reducing sugar was liberated. The same conditions were used in the saccharification of the bagasse using the enzymatic extract produced by Myceliophthora sp. M.7.7, with a reducing sugar... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Daniela A. Bocchini-Martins / Banca: Beatriz Vahan Kilikian / Banca: Mauricio Boscolo / Mestre

São objetivos deste trabalho: (1) avaliar a produção de celulases pelo fungo termofílico Myceliophthora sp. M77, isolado no âmbito do programa BIOTA-FAPESP, cultivando-o em meios compostos por bagaço de cana-de-açúcar (B) e farelo de trigo (T) ou farelo de soja (S), portanto, cultivos em estado sólido; (2) avaliar a eficácia das enzimas na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar e celulose cristalina. Nos cultivos em frascos Erlenmeyer, o maior valor de concentração de celulases foi obtido em meio SB (10:90) (porcentagem em massa) com 80% de umidade inicial, 10,3 FPU.gms-1 após cinco dias de cultivo, valor este 120% superior ao valor de 4,8 U.gms-1, que foi a maior concentração de celulases registrada no cultivo em meio TB (20:80) com 60% de umidade inicial. O uso de aeração forçada no cultivo de Myceliophthora sp. M77 em meio SB (10:90) com 80% de umidade inicial, em reator de leito fixo, resultou aumento de 30% na concentração de celulase e na máxima produtividade em relação aos cultivos em frasco Erlenmeyer. Ensaios de hidrólise nas temperaturas de 50°C, 60°C e 70°C foram realizados para determinação da melhor temperatura de ação das celulases produzidas pelo fungo Myceliophthora sp. M77. Utilizou-se extrato obtido a partir do cultivo de Myceliophthora sp. M77 em meio SB (10:90) com umidade inicial de 60% a 45°C por 3 dias. Após 48h de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, a conversão de celulose a glicose foi de 15% para T=50°C, 8% para T=60°C e 1,5% para T=70°C. Os resultados indicam que pode ocorrer desnaturação térmica a 60°C e 70°C para períodos superiores a 6 h e 2 h de hidrólise, respectivamente. Ensaios de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, a 50°C, com adição de 10 FPU.gms-1 de celulases produzidas por Myceliopthora sp. M77 em meio SB (10:90) resultaram conversão de celulose a glicose 50% maior do que para o ensaio de hidrólise nas mesmas condições com enzimas produzidas em meio TB (40:60), indicando que a composição dos extratos enzimáticos produzidos em meio TB e SB são diferentes. A concentração inicial de glicose de 1 g.L-1 no extrato produzido em meio TB pode ter inibido a ação da enzima b-glicosidade. Já os extratos produzidos em meio SB apresentaram concentrações de glicose inicial inferiores a 0,15 g.L-1. Ensaios de hidrólise com enzimas aderidas ao meio de cultura sólido foram realizados com a finalidade de avaliar essa metodologia em comparação à hidrólise usual com enzimas extraídas do meio. Após 48 h, as conversões de celulose a glicose das hidrólises de celulose cristalina ou bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão à vapor com enzimas aderidas ao meio de cultura foram ou superiores ou iguais àquelas obtidas nas hidrólises com enzimas extraídas do meio de cultura. Esse resultado mostra que existe a possibilidade de aplicação direta da enzima não extraída do meio de cultura sólido, com consequente redução do custo do processo de hidrólise do material celulósico para liberação de açúcares fermentescíveis. / The objectives of this study are: (1) to evaluate the production of cellulases by a thermophilic fungus, Myceliophthora sp. M77, isolated by the BIOTA-FAPESP program. The microorganism was cultivated in media composed by sugarcane bagasse (B) and wheat bran (T) or soybean meal (S), thus, solid state cultivation; (2) to evaluate the effectiveness of these enzymes in the hydrolysis of sugarcane bagasse and crystalline cellulose. The highest cellulases concentration in Erlenmeyer flasks cultures was achieved in medium SB (10:90) (w/w) with initial moisture of 80%, 10.3 FPU.gdm-1 after five days of cultivation, a value 120% higher than 4.8 U.gdm-1, which was the highest recorded cellulases concentration in culture using TB (20:80) with 60% of initial moisture. Applying forced aeration in the cultivation of Myceliophthora sp. M77 in medium SB (10:90) with 80% initial moisture, in fixed bed reactor, cellulases concentration and maximum productivity raised 30% relative to cultivation in Erlenmeyer flask. Hydrolysis assays at temperatures of 50°C, 60°C and 70°C were performed to evaluate the optimal temperature for application of cellulases produced by the fungus Myceliophthora sp. M77, since it is a thermophilic fungus. It was used the enzymatic extract produced from cultures in medium SB (10:90) with 60% initial moisture, at 50°C, for three days. After 48 h of hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion, the conversion of cellulose to glucose was 15% for T = 50 ° C, 8% for T = 60 ° C and 1.5% T = 70 ° C. These results indicated that thermal denaturation may occur in hydrolysis at 60°C and 70°C for periods longer of 6 h and 2 h, respectively. Hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion at 50°C with addition of 10 FPU.gdm-1 of cellulases produced by Myceliopthora sp. M77 in medium TB (40:60), resulted in conversion of cellulose to glucose 50% lower than hydrolysis with enzymes produced in medium SB (10:90), under the same conditions, indicating that the composition of enzyme extracts produced in TB and SB medium are different. The initial glucose concentration of 1 g.L-1 in the enzyme extract produced in TB medium can inhibit the action of the enzyme b-glucosidade. On the other hand, initial glucose concentration in the extract produced in medium SB was lower than 0.15 g.L-1. Hydrolysis using enzymes adhered to the solid culture medium were performed in order to compare this method to the usual hydrolysis with enzymes extracted from the medium. After 48 h, the cellulose conversion to glucose in the hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion or crystalline cellulose were either greater than or equal to those obtained by hydrolysis with enzymes extracted from the culture medium. This result shows that there is the possibility of direct application of the enzyme still adhered to the solid culture medium, with consequent reduction of the process cost of cellulosic materials hydrolysis to release fermentable sugars.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a produção de \'H IND.2\' a partir da degradação de papel sulfite com a utilização de consórcio microbiano obtido do fluido ruminal, na presença e ausência da celulase. Para obtenção de consórcio de bactérias essencialmente produtoras de \' H IND.2\', fluido de rúmen in natura, utilizado como inóculo, foi submetido a tratamento ácido (pH 3 por 24 h), e posteriormente enriquecido em meio de cultura Del Nery modificado em diluições seriais. Nos ensaios de produção de \'H IND.2\' foi utilizado 10% (v/v) desse inóculo em reatores com diferentes concentrações de papel e celulase, e em reatores controle, nos quais não houve adição de celulase. Reator anaeróbio em batelada, em triplicata, com papel sulfite e meio Del Nery modificado, foi mantido a 37 ºC, pH inicial 7,0, com headspace preenchido com \'N IND.2\' (100%) para os seguintes ensaios: (1) 0,5 g papel/L e 4 mL celulase/L; (2) 2,0 g papel/L e 15 mL celulase/ L; (3) 4,0 g papel/L e 30 mL celulase/L; (CT 1) 0,5 g papel/L; (CT 2) 2,0 g papel/L; (CT 3) 4,0 g papel/L. Os rendimentos de \'H IND.2\' foram 42, 26,6 e 24 mmol\' H IND.2\'/g papel para os ensaios 1, 2 e 3, respectivamente. Não houve produção de \'H IND.2\' nos reatores controle. O consumo de substrato, avaliado como glicose, foi de 56%, 56,6% e 65,4% para os ensaios 1, 2 e 3, respectivamente. Nos reatores controle não foi detectado consumo de papel. Em todos os reatores com celulase foi detectado principalmente ácido butírico, além de ácido acético e álcoois. Nos reatores controle foram detectados principalmente ácido acético e ácido iso-butírico. Para os ensaios 1, 2, 3, CT 1, CT 2 e CT 3, os valores de pH final foram 4,6; 3,7; 3,5; 6,8; 6,6 e 6,5, respectivamente. Bacilos Gram positivos e formadores de endósporos foram predominantes em todos os reatores. A partir da análise de PCR/DGGE foi possível observar alteração de 78% entre a comunidade original do fluido de rúmen e a comunidade microbiana presente ao final dos ensaios. Por meio da clonagem e sequenciamento do gene RNAr 16S, verificou-se similaridade de 95% a 99% com Clostridium no consórcio bacteriano do reator com papel e celulase. A produção biológica de \'H IND.2\' nos reatores com celulase foi provavelmente devido as bactérias que estiveram presentes nas condições estudadas, identificadas, principalmente, como Clostridium sp., reconhecidas como produtoras de \'H IND.2\', ácidos voláteis e álcoois. A adição de celulase foi essencial para a hidrólise do papel em carboidratos solúveis, permitindo a produção de H2 pelas bactérias presentes no consórcio microbiano. / The aim of this study was to evaluate the production of \'H IND.2\' from office paper degradation by using a microbial consortium obtained from rumen fluid, in the presence and absence of cellulase. In order to obtain a microbial consortium consisting mainly of hydrogen producing bacteria, rumen fluid, used as inoculum, was subjected to acid pretreatment (pH 3 for 24 h), and subsequently enriched in the modified Del Nery medium in serial dilutions. In hydrogen production assays there was used 10% (v/v) of the pretreated inoculum in reactors with different concentrations of paper and cellulase, and in control reactors, without cellulase. Anaerobic batch reactor (5 L), in triplicate, with office paper and modificated Del Nery medium, was kept in 37 ºC and initial pH 7,0, with headspace filled with \'N IND.2\' (100%), for the following assays: (1) 0,5 g paper/L e 4mL cellulase/L; (2) 2,0 g paper/L e 15 mL cellulase/ L; (3) 4,0 g paper/L e 30 mL cellulase/L; (CT 1) 0,5 g paper/L; (CT 2) 2,0 g paper/L; (CT 3 ) 4,0 g paper/L. Hydrogen yields were 42, 26,6 and 24 mmol \'H IND.2\'/g paper for the assays 1, 2 and 3, respectively. Hydrogen production was not detected in the control reactors. Substrate consumption percentage, measured as glucose, was 56%, 56,6% and 65,4%, respectively for the assays 1, 2 and 3. Paper consumption was not detected in the control reactors. Butyric acid, low concentration of acetic acid, and alcohols were detected in the reactors with cellulase. In the control reactor it was observed mainly acetic and iso-butyric acids. Final pH values were 4,6; 3,7; 3,5; 6,8; 6,6 and 6,5 for the assays 1, 2, 3, CT 1, CT 2 and CT 3, respectively. It was observed a predominance of Gram positive endospore-forming rods. From PCR/DGGE analysis it was possible to observe an alteration of 78% between the original microbial community of the ruminal fluid and the microbial community present at the end of the assays. From cloning and sequencing analysis of RNAr 16S gene, there was verified similarity of 95-99% with Clostridium in the microbial consortium. The biological hydrogen production in the assays with cellulase was probably due to bacteria present in the conditions studied, mainly identified as Clostridium sp., known as producers of hydrogen, organic acids and alcohols. The addition of cellulase was essential to promote paper breakdown into soluble carbohydrates, which allowed hydrogen production by bacteria present in the consortium.

O mundo se depara atualmente com a perspectiva de um significativo aumento na demanda por etanol combustível. O bagaço de cana está entre os maiores subprodutos agroindustriais no Brasil, sendo uma das alternativas na utilização para a produção do etanol de segunda geração. A degradação do bagaço de cana requer a ação de muitas enzimas diferentes que são reguladas transcripcionalmente. Considerando-se que o custo de celulases e hemicelulases contribuem substancialmente no preço do bioetanol, novos estudos visando o entendimento da eficiência e produtividade de celulases são de grande importância. Para entender como melhorar coquetéis de enzimas que podem hidrolizar o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, uitlizou-se um experimento de genômica para investigar-se quais genes e vias são transcripcionalmente moduladas durante o crescimento de A. niger em bagaço de cana-de-açúcar explodido. Neste trabalho foram identificados genes que codificam celulases e hemicelulases com aumento da expresão durante o crescimento em bagaço de cana-de-açúcar explodido. Foi também realizada a determinação do acúmulo de mRNA de diversos genes que codificam transportadores para verificar se estes eram induzidos por xilose e por depedência de glicose. Foram identificados 18 genes que corresponde a 58% de celulases preditas em A. niger e 21 genes que correponde a 58% de hemicelulases preditas em A. niger os quias foram altamente expressos durante o crescimento em bagaço de cana-de-açúcar explodido. Foi investigado também o papel central realizado pelas proteínas quinases e fosfatases não essenciais (NPKs e NPPs, respectivamente) quando em presença de celulose como fonte de carbono, no sensoriamento do estado energético e na subsequente via de sinalização no fungo filamentoso modelo Aspergillus nidulans. O estudo com A. nidulans identificou 11 quinases e 7 fosfatases não essências, NPKs e NPPs, respectivamente, envolvidas na produção de celulases e em alguns casos, na produção também de hemicelulases. O envolvimento destas NPKs identificadas na resposta induzida por avicel e na desrepressão foram acessados pela análise do transcriptoma da cepa selvagem e por microscopia de fluorescência através da cepa de fusão CreA::GFP expressa no selvagem e no background dos mutantes de NPKs. A ausência das quinases snfA e schA reduziu dramaticamente a resposta transcricional induzida por celulose incluindo a expressão de enzimas hidrolíticas e transportadores, enquanto que a ausência de snfA resultou em uma quase completa modulação gênica induzida por celulose. O mecanismo pelo qual essas duas quinases controlam a transcrição gênica foi identificado, onde os dois mutantes de quinases foram capazes de desbloquear o CreA mediante a repressão catabólica do carbono (CCR), sob condições de desrepressão, como em baixa presença de carbono ou crescimento em celulose. Desta forma, este trabalho abriu novas possibilidades para o entendimento da sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar por hidrolases de A. niger e para a construção de coquetéis de enzimas mais eficientes para a obtenção do etanol de segunda geração. Também possibilitou a identificação de muitas quinases e fosfatases envolvidas no sensoriamento do carbono e do estado energético, as quais demonstraram papéis sobrespostos e distintos de snfA e schA na regulação da desrepressão de CreA e na produção de enzimas hidrolíticas em A. nidulans. / The world today is faced with the prospect of a significant increase in demand for fuel ethanol. Sugarcane bagasse is among the largest agro-industrial by-products in Brazil, one of the alternatives in use for the production of second generation ethanol. Degradation of sugarcane bagasse requires the action of many different enzymes which are transcriptionally regulated. Considering that the costs of cellulases and hemicellulases contribute substantially to the price of bioethanol, new studies aimed at understanding and improving cellulase efficiency and productivity are of paramount importance. To understand how to improve enzymatic cocktails that can hydrolyze pretreated sugarcane bagasse, we used a genomics approach to investigate which genes and pathways are transcriptionally modulated during growth of A. niger on steam-exploded sugarcane bagasse. We also sought to determine whether the mRNA accumulation of several steam-exploded sugarcane bagasseinduced genes encoding putative transporters is induced by xylose and dependent on glucose. We identified 18 genes that corresponds to 58% of A. niger predicted cellulases and 21 genes that correspond to 58% of A. niger predicted hemicellulases, that were highly expressed during growth on sugarcane bagasse. The central role performed by nonessential protein kinases (NPK) and phosphatases (NPP) when grown on cellulose as a sole carbon source, in the sensing energetic status and the subsequent signalling pathways was assessed in the model filamentous fungus Aspergillus nidulans. This study identified multiple kinases and phosphatases (NPKs and NPPs, respectively) involved in the sensing of carbon or energetic status, while demonstrating the overlapping and distinct roles of snfA and schA in the regulation of CreA derepression and hydrolytic enzyme production in A.nidulans. The involvement of the identified NPKs in avicel-induced responses and CreA derepression was assessed by genome-wide transcriptomics and fluorescent microscopy of a CreA::GFP fusion proteinexpressed in the wild-type and NPK-deficient mutant backgrounds. The absence of either the schA or snfA kinase dramatically reduced cellulose-induced transcriptional responses including the expression of hydrolytic enzymes and transporters, while the absence snfA resulted in a near complete loss of wild-typecellulose-induced gene modulation. The mechanism by which these two NPKs controlled gene transcription was identified, as neither of NPK-deficient mutants were able to unlock CreA-mediated carbon catabolite repression, under derepressing conditions, such as carbon starvation or growth on cellulose. Our presently reported work opens new possibilities for understanding sugarcane biomass saccharification by A. niger hydrolases and for the construction of more efficient enzymatic cocktails for second-generation bioethanol. This work also enable the identification of multiple kinases and phosphatases involved in the sensing of carbon or energetic status, while demonstrating the overlapping and distinct roles of snfA and schA in the regulation of CreA derepression and hydrolytic enzyme production in A.nidulans.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4606.pdf: 10556895 bytes, checksum: debf5633a053f88ca7dd4618edef9175 (MD5) Previous issue date: 2012-07-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / The plant biomass is a large-scale available resource and one of its more important applications is the second-generation ethanol production. However, the enzyme cost is one of the biggest barriers for economically viable ethanol from biomass. Therefore, it is important to identify fungal strains that can produce high concentrations of plant biomass-degrading enzymes. The aim of this work was to clone, study the gene expression and characterize the plant biomass-degrading transcript set of the filamentous fungus Trichoderma harzianum IOC-3844. A total of 1,543 highquality reads from the Trichoderma harzianum IOC-3844 cellulose induced cDNA library were organized into 1,002 transcripts representing 167 contigs and 835 singlets. Of these 1,002 transcripts 646 had unknown functions and 356 showed associated functions. Among the transcripts with associated functions, we found 20 transcripts related to plant biomass deconstruction. The real time PCR analysis of Trichoderma harzianum IOC-3844 mycelia grown for 36 and 60 hours in cellulose, revealed that the levels of the following mRNAs were induced by at least 2,000-fold when compared to uninduced mycelia: cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 and swo1. In some cases, the values were higher than 100,000-fold. Among the transcripts analyzed by real time PCR, cbh1, cbh2 and egl7 exhibited the highest expression levels. The Trichoderma harzianum IOC-3844 exhibited a repertoire with high expression of plant biomassdegrading transcripts. The enzymes EGIII and Xyn2 were recombinantly expressed in Pichia pastoris, showing good quality purification and good enzymatic activity. The heterologous expression assays made possible future studies aiming at the industrial application of the enzymes. Therefore, this strain showed potencial to produce biomassdegrading enzymes for second-generation ethanol production and to be a source of enzymes for the paper industry / A biomassa vegetal é um recurso disponível em larga escala e uma das suas mais imporantes aplicações é a produção de etanol de segunda geração. No entanto, o custo das enzimas é um dos maiores entraves para a produção economicamente viável deste etanol. Neste contexto, é importante encontrar organismos produtores de grandes quantidades de enzimas que degradam a biomassa. Os objetivos deste estudo foram clonar, estudar a expressão gênica e caracterizar o conjunto de enzimas que degradam a biomassa vegetal, do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC-3844. Um total de 1.543 seqüências de boa qualidade, geradas a partir de uma biblioteca de cDNA do Trichoderma harzianum IOC-3844, induzido por celulose, foi organizado em 1.002 transcritos, sendo 167 representados por mais de uma seqüência e 835 representados por apenas uma seqüência. Destes transcritos, 356 tiveram função associada e 646 não tiveram. Com isso, entre os transcritos com função associada, foram listados 20 transcritos envolvidos com degradação de biomassa vegetal. Análises de PCR em tempo real do micélio de Trichoderma harzianum IOC-3844, crescido por 36 e 60 horas em celulose, mostraram níveis de mRNA mais de 2.000 vezes mais representados para os transcritos cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 e swo1, quando comparados com o micélio não induzido. Em alguns casos as maiores representatividades alcançaram valores superiores a 100.000 vezes. Entre os transcritos analisados o cbh1, o cbh2 e o egl7, mostraram os mais altos níveis de expressão. O Trichoderma harzianum IOC-3844 exibiu um repertório com alta expressão de transcritos envolvidas na degradação de biomassa vegetal. As enzimas EGIII e Xyn2 foram expressas em sistema recombinante com uso da levedura Pichia pastoris, apresentando facilidade de purificação e boa atividade enzimática. Os ensaios de expressão heteróloga viabilizaram estudos posteriores que visam a aplicação industrial das enzimas. Assim, esta cepa mostrou potencial para produzir enzimas que degradam a biomassa para a produção de etanol de segunda geração, e para ser fonte de enzimas para a indústria de papel.

O mundo se depara atualmente com a perspectiva de um significativo aumento na demanda por etanol combustível. O bagaço de cana está entre os maiores subprodutos agroindustriais no Brasil, sendo uma das alternativas na utilização para a produção do etanol de segunda geração. A degradação do bagaço de cana requer a ação de muitas enzimas diferentes que são reguladas transcripcionalmente. Considerando-se que o custo de celulases e hemicelulases contribuem substancialmente no preço do bioetanol, novos estudos visando o entendimento da eficiência e produtividade de celulases são de grande importância. Para entender como melhorar coquetéis de enzimas que podem hidrolizar o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, uitlizou-se um experimento de genômica para investigar-se quais genes e vias são transcripcionalmente moduladas durante o crescimento de A. niger em bagaço de cana-de-açúcar explodido. Neste trabalho foram identificados genes que codificam celulases e hemicelulases com aumento da expresão durante o crescimento em bagaço de cana-de-açúcar explodido. Foi também realizada a determinação do acúmulo de mRNA de diversos genes que codificam transportadores para verificar se estes eram induzidos por xilose e por depedência de glicose. Foram identificados 18 genes que corresponde a 58% de celulases preditas em A. niger e 21 genes que correponde a 58% de hemicelulases preditas em A. niger os quias foram altamente expressos durante o crescimento em bagaço de cana-de-açúcar explodido. Foi investigado também o papel central realizado pelas proteínas quinases e fosfatases não essenciais (NPKs e NPPs, respectivamente) quando em presença de celulose como fonte de carbono, no sensoriamento do estado energético e na subsequente via de sinalização no fungo filamentoso modelo Aspergillus nidulans. O estudo com A. nidulans identificou 11 quinases e 7 fosfatases não essências, NPKs e NPPs, respectivamente, envolvidas na produção de celulases e em alguns casos, na produção também de hemicelulases. O envolvimento destas NPKs identificadas na resposta induzida por avicel e na desrepressão foram acessados pela análise do transcriptoma da cepa selvagem e por microscopia de fluorescência através da cepa de fusão CreA::GFP expressa no selvagem e no background dos mutantes de NPKs. A ausência das quinases snfA e schA reduziu dramaticamente a resposta transcricional induzida por celulose incluindo a expressão de enzimas hidrolíticas e transportadores, enquanto que a ausência de snfA resultou em uma quase completa modulação gênica induzida por celulose. O mecanismo pelo qual essas duas quinases controlam a transcrição gênica foi identificado, onde os dois mutantes de quinases foram capazes de desbloquear o CreA mediante a repressão catabólica do carbono (CCR), sob condições de desrepressão, como em baixa presença de carbono ou crescimento em celulose. Desta forma, este trabalho abriu novas possibilidades para o entendimento da sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar por hidrolases de A. niger e para a construção de coquetéis de enzimas mais eficientes para a obtenção do etanol de segunda geração. Também possibilitou a identificação de muitas quinases e fosfatases envolvidas no sensoriamento do carbono e do estado energético, as quais demonstraram papéis sobrespostos e distintos de snfA e schA na regulação da desrepressão de CreA e na produção de enzimas hidrolíticas em A. nidulans. / The world today is faced with the prospect of a significant increase in demand for fuel ethanol. Sugarcane bagasse is among the largest agro-industrial by-products in Brazil, one of the alternatives in use for the production of second generation ethanol. Degradation of sugarcane bagasse requires the action of many different enzymes which are transcriptionally regulated. Considering that the costs of cellulases and hemicellulases contribute substantially to the price of bioethanol, new studies aimed at understanding and improving cellulase efficiency and productivity are of paramount importance. To understand how to improve enzymatic cocktails that can hydrolyze pretreated sugarcane bagasse, we used a genomics approach to investigate which genes and pathways are transcriptionally modulated during growth of A. niger on steam-exploded sugarcane bagasse. We also sought to determine whether the mRNA accumulation of several steam-exploded sugarcane bagasseinduced genes encoding putative transporters is induced by xylose and dependent on glucose. We identified 18 genes that corresponds to 58% of A. niger predicted cellulases and 21 genes that correspond to 58% of A. niger predicted hemicellulases, that were highly expressed during growth on sugarcane bagasse. The central role performed by nonessential protein kinases (NPK) and phosphatases (NPP) when grown on cellulose as a sole carbon source, in the sensing energetic status and the subsequent signalling pathways was assessed in the model filamentous fungus Aspergillus nidulans. This study identified multiple kinases and phosphatases (NPKs and NPPs, respectively) involved in the sensing of carbon or energetic status, while demonstrating the overlapping and distinct roles of snfA and schA in the regulation of CreA derepression and hydrolytic enzyme production in A.nidulans. The involvement of the identified NPKs in avicel-induced responses and CreA derepression was assessed by genome-wide transcriptomics and fluorescent microscopy of a CreA::GFP fusion proteinexpressed in the wild-type and NPK-deficient mutant backgrounds. The absence of either the schA or snfA kinase dramatically reduced cellulose-induced transcriptional responses including the expression of hydrolytic enzymes and transporters, while the absence snfA resulted in a near complete loss of wild-typecellulose-induced gene modulation. The mechanism by which these two NPKs controlled gene transcription was identified, as neither of NPK-deficient mutants were able to unlock CreA-mediated carbon catabolite repression, under derepressing conditions, such as carbon starvation or growth on cellulose. Our presently reported work opens new possibilities for understanding sugarcane biomass saccharification by A. niger hydrolases and for the construction of more efficient enzymatic cocktails for second-generation bioethanol. This work also enable the identification of multiple kinases and phosphatases involved in the sensing of carbon or energetic status, while demonstrating the overlapping and distinct roles of snfA and schA in the regulation of CreA derepression and hydrolytic enzyme production in A.nidulans.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5706.pdf: 7869131 bytes, checksum: 3a35e736b3418ca357ef4fc2e657c0af (MD5) Previous issue date: 2013-10-16 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymes are potent catalysts, but operationally fragile, expensive and soluble. Industrial applications of enzymes, often, are possible only using immobilized enzyme. Nowadays, various studies have been performed aiming to immobilize enzymes onto magnetic carriers, which allow the selective recovery of the derivative by applying an external magnetic field even in complex reaction media containing other suspended solids. There are many studies using magnetic carriers in enzymes immobilization procedures, however there are no commercially available enzymes immobilized onto magnetic materials. In these studies usually are used carriers with not ideal characteristics for applications in industrial processes. The present study aimed to develop new magnetic carriers and methods for immobilization of enzymes in these carriers, penicillin G acylase (PGA) and cellulases have been used as model enzymes. The thesis was divided into five parts, in the first part (Chapter 1) the state-of-art is presented. The second part (Chapter 2) describes the synthesis of magnetic carriers robust, cheap and with good characteristics for applications in bioprocesses. For this purpose were tested the synthesis of silica magnetic microparticles (SMMps) in water-in-oil micro-emulsion using sodium silicate as silica source and superparamagnetic iron oxide nanoparticles as magnetic core. Materials with good magnetic properties, high surface area and mesoporous structure were obtained. SMMps structure was characterized, it was possible to control the final structure of the material according to the synthesis conditions. In the third part of this study (Chapter 3) was evaluated a new concept in enzymes immobilization using magnetic materials. Magnetic tags were co-aggregated with PGA and cross-linked with glutaraldehyde, producing magnetic cross-linked enzymes aggregates (M-CLEAs). Several reaction conditions were tested producing M-CLEAs with different characteristics and strong response to external magnetic fields. Derivatives with good recovered activity and increased thermal and methanol 50% (v/v) stabilities were obtained. M-CLEAs presented superior performance, in comparison with the free enzyme, in penicillin G hydrolysis experiments, being reused for three reaction cycles without loss of activity. In the fourth part of this study (Chapter 4) the immobilization of the Trichoderma reesei cellulolytic complex onto 17 carriers using 60 different immobilization conditions was evaluated. Covalent methods to cellulases immobilization resulted in total loss of the enzymatic activity. The immobilization by adsorption allowed preserving a portion of the enzymatic activity, however, the enzyme was desorbed from the carrier with the increase in the ionic strength. The best results were achieved for adsorption in MANAE-agarose followed by cross-linking with glutaraldehyde. Hydrolysis experiments using insoluble substrates showed that it is possible to hydrolyze such substrates even using immobilized enzyme onto porous carriers. The derivative was reused for ten reaction cycles (hydrolysis of filter paper) saving more than 90% of its activity. Finally, in Chapter 5, the T. reesei cellulolytic complex was immobilized by adsorption onto SMMp activated with amino groups followed by glutaraldehyde cross-linking achieving good results in terms of recovered activity. / Enzimas são potentes catalisadores, porém frágeis operacionalmente, caras e solúveis. Aplicações industriais desses catalisadores, muitas vezes, são possíveis apenas com o uso de enzima imobilizada. Estudos indicam que o uso de suportes magnéticos para imobilizar enzimas pode permitir a recuperação seletiva do derivado através da aplicação de um campo magnético externo mesmo em meios complexos contendo outros sólidos em suspensão. Apesar de existirem muitos estudos empregando suportes magnéticos para imobilização de enzimas, não existem enzimas imobilizadas em materiais magnéticos disponíveis comercialmente. Nestes estudos geralmente são utilizados suportes magnéticos com características não ideais para aplicações em bioprocessos. O presente estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento de novos suportes magnéticos e métodos para imobilização de enzimas nestes suportes, a enzima penicilina G acilase (PGA) e celulases foram utilizadas como modelo. O estudo foi dividido em cinco partes, no Capítulo 1 é apresentada uma introdução indicando o estado da arte. O Capítulo 2 apresenta o preparo de novos suportes magnéticos robustos, baratos e com características ótimas para aplicações em bioprocessos. Nesta etapa foi testada a síntese de micro-partículas magnéticas de sílica (SMMps) em micro-emulsão água-em-óleo, empregando silicato de sódio como fonte de sílica e nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro como núcleo magnético. Os materiais obtidos apresentaram excelentes propriedades magnéticas, alta área de superfície e estrutura mesoporosa. A partir da caracterização físico-química e morfológica das SMMps foi possível controlar a estrutura final do material de acordo com as condições de síntese. No Capítulo 3 foi avaliado um novo conceito em imobilização de enzimas empregando materiais magnéticos. Neste estudo etiquetas magnéticas foram co-agregadas com PGA e entrecruzadas com glutaraldeído, gerando agregados enzimáticos entrecruzados com propriedades magnéticas (M-CLEAs). Várias condições reacionais foram testadas rendendo M-CLEAs com diferentes características e com resposta robusta a campos magnéticos externos. Derivados imobilizados com boa atividade recuperada e incremento na estabilidade térmica e frente a metanol 50% (v/v) foram obtidos. M-CLEAs apresentaram desempenho superior ao observado para a enzima livre em experimentos de hidrólise de penicilina G, sendo reutilizados por três ciclos reacionais sem perda de atividade. No Capítulo 4 foi avaliada a imobilização do complexo celulolítico de Trichoderma reesei em 17 suportes, empregando 60 diferentes condições de imobilização. Os experimentos de imobilização realizados empregando técnicas de imobilização por união covalente ocasionaram perda total de atividade enquanto métodos de imobilização por adsorção permitiram conservar boa atividade enzimática, porém a enzima dessorveu do suporte com o aumento na força iônica do meio. Os melhores resultados foram alcançados para adsorção em MANAE-agarose seguido de entrecruzamento com glutaraldeído. Experimentos de hidrólise de substratos insolúveis mostraram que é possível hidrolisar este tipo de substrato mesmo com enzima imobilizada em suportes porosos. O derivado foi reutilizado por dez ciclos (hidrólise de papel filtro) conservando mais de 90% de sua atividade. Por fim, no Capítulo 5, o complexo celulolítico de T. reesei foi imobilizado por adsorção em SMMp ativado com grupos amino seguido de entrecruzamento com glutaraldeído apresentando bons resultados em termos de atividade recuperada.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4514.pdf: 2385637 bytes, checksum: 89b533535415a993d655f83f1387c6f0 (MD5) Previous issue date: 2012-06-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / The selection of cellulase-producing fungi is one of the possible estrategies for obtaining necessary enzymes to hydrolyze the lignocellulosic material of plant biomass and thereby contribute to the viability of cellulosic ethanol production. The aim of this study was achive a screening of isolated fungi from the Amazon region to assess the production of enzymes related to plant biomass degradation, in order to select a line for production, purification and biochemical, kinetical and and structural biology characterizationof the ß-Galactosidase enzyme. Therefore, this work was undertaken in three stages, first of all it was performed a screening of 40 fungal strains isolated from the Amazon region through the cultivation in solid state fermentation (FES) at 35ºC for 240 hours, using as substrate wheat bran. It was evaluated the production of xylanase, endoglucanase, FPase, pectinase, ß-Glicosidase and total protein, and the fungi that stood out were: P6B2, the best producer of xylanase, P47C3 (Aspergillus niger), the best producer endoglucanase and ß-Glicosidase and P40B3, the best producer of FPase. These three fungi were selected for the second phase of this work for assessment in the production of xylanase, FPase, endoglucanase, ß-Glicosidase and total protein by submerged fermentation (FSm). The fermentation took place for 5 days at 30ºC and 200 rpm with a source of carbon: 1% of wheat bran washed and nutrient medium. The fungi P47C3, which was identified as Aspergillus niger, showed the best production of these enzymes, being selected for the third stage of this project. This last step involved the selection of an enzyme that has not been elucidated its structural biology. Given this fact, we carried out a study of selection of the medium, purification and biochemicalkinetical characterization of ß-Galactosidase. The Aspergillus niger (P47C3) was subjected to submerged for 5 days at 200 rpm at 30ºC. Purification occured in three steps using: ion exchange column SP-Sephadex C-50 and SP TSK-5PW column, and gelfiltration, with the resin Sephacryl S-200. The enzyme ß-Galactosidase showed a molecular weight of 125 kDa, being stable at pH 4,0, with anoptimum temperature of 55ºC. It was evaluated theKmap e Vmáxap of two substrates, PNPG and lactose, being: 2,204 mM-0,285 mM/min and 2,101 mM-0,75mM/min, respectively. The inhibition of hydrolasis of the substrate PNPG by ß-Galactosidase in the presence of galactose inhibitor product showed a Ki value of 5,01 mM. Finally, the ß-Galactosidase was subjected to crystallization conditions, the best conditions occurred in buffer 0,2M Tris- HCl, with the precipitation agent, 12% PEG 4000 at pH 8,6. Therefore, the unpublished protocol for purification of ß-Galactosidase was efficient and it is possible to crystallize this enzyme of isolated fungi from the Amazon region, which showed great potencial for the production of this enzyme and that the future can be used in industrial application and biotechnological innovations. / A seleção de fungos produtores de celulases é uma das possíveis estratégias para a obtenção das enzimas necessárias para hidrolisar o material lignocelulósico da biomassa vegetal e com isso contribuir para a viabilização da produção de etanol celulósico. O objetivo desse trabalho foi realizar um screening dos fungos isolados da região amazônica para a avaliação da produção de enzimas relacionadas à degradação da biomassa vegetal, a fim de selecionar uma linhagem para produção, purificação e caracterização bioquímica, cinética e biologia estrutural da enzima ß-Galactosidase. Dessa forma, esse trabalho foi realizado em três etapas, primeiramente foi realizado um screening de 40 linhagens fúngicas isoladas da região amazônica, através do cultivo em fermentação em estado sólido (FES), a 35°C, por 240 horas, utilizando como substrato o farelo de trigo. Avaliou-se a produção de xilanase, endoglucanase, FPase, pectinase, ßglicosidase e proteínas totais, sendo que os fungos que mais se destacaram foram o: P6B2, melhor produtor de xilanase, P47C3 (Aspergillus niger), melhor produtor de endoglucanase e ß-glicosidase e o P40B3, melhor produtor de FPase. Esses três fungos, foram selecionados para a segunda fase do trabalho para avaliação na produção de xilanase, FPase, endoglucanase, ß-glicosidase e proteínas Totais por fermentação submersa (FSm). A fermentação ocorreu por 5 dias, à 30ºC e 200 rpm tendo como fonte de carbono: 1% de farelo de trigo lavado e meio nutriente. O fungo P47C3, identificado como Aspergillus niger, apresentou melhor produção dessas enzimas, sendo selecionado para a terceira etapa desse projeto. Essa última etapa, envolveu a escolha de uma enzima que não estivesse sua biologia estrutural elucidada. Diante desse fato, realizou-se um estudo de seleção do meio de cultivo, purificação e caracterização bioquimico-cinética da ß-Galactosidase. O fungo Aspergillus niger (P47C3) foi submetido a fermentação submersa, durante 5 dias, à 200 rpm em 30ºC. A purificação ocorreu em três etapas utilizando: colunas de troca iônica SP - Sephadex C-50 e a coluna SP -TSK 5PW; e gel filtração, com a resina Sephacryl S-200. A enzima ß-Galactosidase apresentou uma massa molecular de 125 kDa, sendo estável em pH 4,0, e com temperatura ótima de 55ºC. Avaliou-se a Kmap e Vmáxap de dois substratos, o PNPG e a lactose, sendo: 2,204 mM - 0,285 mM/min e 2,101 mM 0,750 mM/min, respectivamente. A inibição da hidrólise do substrato PNPG pela ß-Galactosidase na presença do produto inibidor galactose apresentou um valor de Ki de 5,01 mM. Por fim, a ß-Galactosidase foi submetida a condições de cristalização, as melhores condições ocorreram em tampão 0,2M Tris-HCl, tendo como agente precipitante, PEG 4000 12% em pH 8,6. Portanto, o protocolo inédito de purificação da ß-Galactosidase foi eficiente, sendo possível cristalizar essa enzima do fungo isolado da região amazônica, o qual apresentou grande potencial para a produção dessa enzima e que futuramente possa ser utilizado em aplicações industriais e inovações biotecnológicas.