Submitted by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-06T11:29:59Z No. of bitstreams: 2 ariadne_marques.pdf: 1829125 bytes, checksum: 01fca719846b682abc79cca9f78f836a (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-06T11:30:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 ariadne_marques.pdf: 1829125 bytes, checksum: 01fca719846b682abc79cca9f78f836a (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-06T11:31:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 ariadne_marques.pdf: 1829125 bytes, checksum: 01fca719846b682abc79cca9f78f836a (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-06T11:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ariadne_marques.pdf: 1829125 bytes, checksum: 01fca719846b682abc79cca9f78f836a (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / O Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted ? um fitopat?geno vascular de ampla distribui??o geogr?fica e gama de hospedeiros. A murcha de Ceratocystis em Eucalyptus ? considerada de dif?cil controle devido ao seu car?ter sist?mico e a variabilidade gen?tica dos isolados. O plantio de material resistente ? a principal forma de controle desta doen?a. No entanto, a obten??o de material gen?tico resistente pode demandar longos per?odos em um programa de melhoramento. A identifica??o de gen?tipos resistentes dentre os clones utilizados comercialmente pode ajudar a abreviar o tempo necess?rio ao melhoramento. Assim, objetivou-se avaliar a resist?ncia de clones de eucalipto ? murcha de Ceratocystis, analisar as respostas ecofisiol?gicas desses clones sob infec??o e fornecer suporte ao processo de melhoramento gen?tico para tal caracter?stica. Foram avaliados 27 clones de resist?ncia desconhecida e 2 clones caracterizados como resistente e suscet?vel ? murcha de Ceratocystis, todos inoculados artificialmente com isolados de C. fimbriata. Os 27 clones apresentaram, aos 50 dias ap?s inocula??o, varia??o quanto ? resist?ncia ? doen?a. Os dois clones de resist?ncia conhecida tiveram crescimento, ?ndice de clorofila e efici?ncia qu?ntica do fotossistema II (Fv/Fm) avaliados em quatro diferentes tempos. As vari?veis analisadas apresentaram potencial para uso na avalia??o da resist?ncia/suscetibilidade de gen?tipos de Eucalyptus spp. ? murcha de Ceratocystis. O clone resistente (R) e o suscet?vel (S) foram utilizados para a constru??o de uma biblioteca subtrativa supressiva. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2013. / ABSTRACT The Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted is a vascular phytopathogen of wide geographic distribution and host range. Ceratocystis wilt in Eucalyptus is considered difficult to control due to its systemic character and the genetic variability of the isolated. Planting resistant material is the main way to control this disease. However, the acquisition of genetic material resistant may require long periods in a breeding program. The identification of resistant genotypes among clones used commercially can help shorten the time needed to improve. The aim was to evaluate the resistance of eucalyptus clones to Ceratocystis wilt, analyze the ecophysiological responses of these clones under infection and provide support to the process of breeding for this trait. We evaluated 27 clones of unknown resistance and 2 clones characterized as resistant and susceptible to Ceratocystis wilt, all artificially inoculated with isolates of C. fimbriata. The 27 clones showed, 50 days after inoculation, variation in disease resistance. The two clones of known resistance grew, chlorophyll content and quantum efficiency of photosystem II (Fv / Fm) evaluated at four different times. The variables analyzed showed potential for use in the evaluation of the resistance/susceptibility of genotypes of Eucalyptus spp. to Ceratocystis wilt. The clone resistant (R) and susceptible (S) were used for the construction of a suppressive subtractive library.

Submitted by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-07T10:54:29Z No. of bitstreams: 2 marcele_santos_ferreira.pdf: 1547534 bytes, checksum: a0861513c3025ada252d9e4fa8f0c494 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-07T10:55:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) marcele_santos_ferreira.pdf: 1547534 bytes, checksum: a0861513c3025ada252d9e4fa8f0c494 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-07T10:55:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 marcele_santos_ferreira.pdf: 1547534 bytes, checksum: a0861513c3025ada252d9e4fa8f0c494 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-07T10:55:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 marcele_santos_ferreira.pdf: 1547534 bytes, checksum: a0861513c3025ada252d9e4fa8f0c494 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-07T10:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcele_santos_ferreira.pdf: 1547534 bytes, checksum: a0861513c3025ada252d9e4fa8f0c494 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do estado de Minas Gerais (FAPEMIG) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / O g?nero Eucalyptus engloba centenas de esp?cies conhecidas e de elevado interesse comercial. Este g?nero florestal ? altamente respons?vel pelo abastecimento da cadeia produtiva da madeira no Brasil. Diversos aspectos podem afetar negativamente a produtividade dos plantios, como, por exemplo, a ocorr?ncia de pragas e doen?as. O percevejo bronzeado Carpintero e Dellap?, 2006 (Hemiptera: Thaumastocoridae) ? uma praga ex?tica, nova no Brasil. Uma estrat?gia para diminuir os efeitos negativos dos insetos-praga ? selecionar materiais gen?ticos resistentes. O isolamento e a identifica??o de genes envolvidos no processo de resist?ncia podem ser usados na obten??o de indiv?duos com caracter?sticas desej?veis. O presente trabalho teve por objetivos a avalia??o de materiais gen?ticos de Eucalyptus spp. quanto ? inj?ria ocasionada pelo percevejo bronzeado e a constru??o, a partir de materiais contrastantes, de bibliotecas subtrativas de cDNA. A escolha dos gen?tipos baseou-se em metodologias distintas, conduzidas em laborat?rio, sala climatizada e em casa de vegeta??o. Foram estudados 27 clones h?bridos. Os gen?tipos C03 e C17 foram escolhidos e, juntamente com mudas de E. camaldulensis, submetidos ao ataque de T. peregrinus. A partir das amostras de RNA mensageiro foi poss?vel construir duas bibliotecas subtrativas: uma com genes diferencialmente expressos entre o clone C03 e o E. camaldulensis e outra a partir do clone C17 e o E. camaldulensis. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2013. / ABSTRACT The genus Eucalyptus encompasses hundreds of known species with high commercial interest. This forest genus is largely responsible for the supply of the wood production chain in Brazil. Several aspects can negatively affect the plantation productivity, for example the occurrence of pests and diseases. The bronze bug Carpintero e Dellap?, 2006 (Hemiptera:Thaumastocoridae) is a new exotic pest in Brazil. A strategy to reduce the negative effects of the insect pests is to select genetic material with resistance. The isolation and identification of resistance genes can be used in order to obtain individuals with desirable characteristics. The present study aimed to evaluate genetic materials of Eucalyptus spp. under the attack of Thaumastocoris peregrinus and make cDNA libraries from contrasting materials. The choice of genotypes relied on different methodologies conducted in laboratory, climate-controlled room and greenhouse. There were studied 27 hybrid clones. The genotypes C03 and C17, were selected along with E. camaldulensis seedlings and subjected to the attack of T. peregrinus. Two genomic subtractive libraries were made from the total RNA samples, one containing the differentially expressed genes between C03 and E. camaldulensis, and another from C17 and E. camaldulensis.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3272.pdf: 1459537 bytes, checksum: 78eeb30fb7d9022c1a6c97b55c565d47 (MD5) Previous issue date: 2010-08-02 / Financiadora de Estudos e Projetos / The genus Anastrepha is the largest in the family Tephritidae (Trypetinae, Toxotrypanini). The construction of cDNA libraries is important for identifying new genes and establishing genetic markers on non-models organisms such as the genus Anastrepha. Among the proteins involved in reproduction, we can cite those belonging cascade sexual and those responsible for forming the eggshell. The purpose of this study was to build a cDNA library from a pool of female reproductive tissues Anastrepha obliqua to breed ESTs, to search for genes with a high evolutionary rate, focusing on chorionic and vitelline proteins. We were sequenced 2304 clones obtained from the reproductive tissues of female flies Anastrepha obliqua. In total, 310 contigs and 506 singlets were generated wich were classified into different proteins classes. The chorionic proteins and Sxl revealed to be under selection positive as well as the vitelline Vm 26Aa ', which was possibly generated by a gene duplication of Vm 26aa, while Tra2 seems under purifying selection. The inference of the secondary structure of proteins studied revealed that the sites under positive selection were present on outside membrane. The population analysis of genes chorionic, vitelline, Sxl and Tra2 revealed no separation between the 3 species, although in some situations have occurred separation between some of the haplotypes for a single specie. With these results, it was possible to identify new genes, make the full sequencing for some vitelline and chorionic genes on pools of other species of Anastrepha, and we also identified that some of these genes are under positive selection pressure. / O gênero Anastrepha é o maior dentro da família Tephritidae (Trypetinae, Toxotrypanini). A construção de bibliotecas de cDNA é importante para a identificação de novos genes e no estabelecimento de marcadores genéticos em organismos não-modelos como do gênero Anastrepha. Dentre as proteínas envolvidas na reprodução podemos citar as pertencentes da cascata sexual e as que são responsáveis por formar a parede do ovo. Assim, este trabalho teve como objetivo construir uma biblioteca de cDNA a partir de um pool de tecidos reprodutivos femininos de Anastrepha obliqua para gerar ESTs, afim de buscar genes com alta taxa evolutiva, focando em proteínas coriônicas e vitelínicas. No Total foram seqüenciados 2304 clones obtidos a partir dos órgãos reprodutivos de fêmeas de moscas de Anastrepha obliqua. Ao todo foram gerados 310 contigs e 506 singlets que foram classificados em diferentes classes de proteínas. As proteínas coriônicas e o Sxl revelaram estar sob seleção positiva, assim como a vitelínica Vm 26Aa´ que possivelmente foi gerada por uma duplicação gênica do Vm 26Aa, enquanto que o Tra2 parece estar sob seleção purificadora. A inferência da estrutura secundária das proteínas estudadas revelou que os sítios sob seleção positiva estavam presentes do lado externo da membrana. As análises populacionais dos genes coriônicos, vitelínicos, Sxl e Tra2 não revelaram uma separação entre as 3 espécies, apesar de em algumas situações ter ocorrido uma separação entre alguns dos haplótipos para uma determinada espécie. Com resultados obtidos, foi possível identificar novos genes, fazer o seqüenciamento completo para alguns genes coriônicos e vitelínicos em pools de outras espécies de Anastrepha, e também foi possível identificar que alguns destes genes estão sob pressão de seleção positiva.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3461.pdf: 3248917 bytes, checksum: b02925f28a9fc50ea71c3af6beebca5c (MD5) Previous issue date: 2011-03-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / The desintegrinas are cys-rich polypeptides without enzymatic activity, some found in snake venoms with an adhesive motif to integrin, unleashing distinct responses. Several research groups have been studying snake venom disintegrins with focus in pharmacological applications in tumor progression and proliferation, angiogenesis, blood clotting, and osteoporosis. This work shows the results of the construction of cDNA library of Rhinocerophis alternatus venom gland, cloning and expression of ALT-C, a disintegrina-like protein, in bacterial system. The library was comprised of 812 sequences that were classified into: (i) coding for hypothetical protein or mismatched in databases (unknown) corresponding to 20.94%; (ii) transcripts for cellular process 17.86%; and (iii) transcripts coding for toxic protein with 61.21%. Among toxic proteins the SVMPs were the most abundant transcripts 58.59%. Other toxic transcripts were C-type lectins (15.56%), bradykinin potentiating peptides (11.8%), serineproteases (5.18%), cys-rich secretory proteins (2.28%), vascular endothelial growth factors (2.28%), L-amino acid oxidases (1.86%) and phospholipases A2 (1.45%). The percentages correspond to this snake venom effects, low enzymatic activity and hemorrhagic and clotting activity as main action, derived from the SVMPs, C-type lectin and serineproteases. One of the SVMPs contigs were chosen based on the similarity with ALT-C, the defined sequence was called ALT-Ch (ALT-C homologue) since there has 4 conservative substitutions compared to the previously determined sequence. The ALT-C-h sequence was used in PCR to inclusion the restriction site for BamHI and EcoRI, cloned in pGEX4T-1 and transformed into E. coli AD494 (DE3) for expression. The cell culture was grown until the log fase and induced with IPTG for 3 hours, the expressed protein's identity was confirmed by Western Blotting using Polyclonal antibody Anti-ALT-C. The construction of the R. alternatus venom gland cDNA library provides a source of interesting active biomolecules, such as desintegrinas, to pharmacological applications in pathologies involving integrins like angiogenesis, tumor progression and metastasis. / As desintegrinas são polipeptídeos sem atividade enzimática, ricos em cisteína, geralmente encontrados no veneno de serpentes, possuidoras de um motivo adesivo reconhecedor de integrinas antagonizando ou agonizando a atividade das mesmas. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando desintegrinas de venenos de serpentes com o foco em aplicação farmacológica nos processos de progressão e proliferação tumoral, angiogênese, coagulação sanguínea, e osteoporose. Este trabalho apresenta os resultados da construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de Rinocerophis alternatus e a clonagem e expressão da ALT-C, uma tipo desintegrina, em sistema bacteriano. A biblioteca foi composta por 812 sequências que foram classificadas em: (i) codificantes para proteínas hipotéticas ou sem equivalência nos bancos de dados (unknown) correspondendo a 20,94%; (ii) transcritos para produtos celulares 17,86%; e (iii) transcritos codificantes para proteínas tóxicas 61,21%. Dentre as proteínas tóxicas as SVMPs foram os transcritos mais abundantes com 58,59% dos compostos tóxicos do tecido. Os demais transcritos tóxicos encontrados foram as lectinas do tipo-C (15,56%), peptídeos potenciadores de bradicinina (11,8%), serinoproteases (5,18%), proteínas secretórias ricas em cisteína (2,28%), fatores de crescimento endotelial vascular (2,28%), L-aminoácido oxidases (1,86%) e fosfolipases A2 (1,45%). As percentagens encontradas correspondem aos efeitos do veneno dessa serpente, que possui baixa atividade enzimática e predominate ação hemorrágica e de alteração na coagulação sanguínea derivada da ação das SVMPs, lectinas do tipo-C e serinoproteases. Um dos contigs para SVMPs foi eleito pela similaridade com a ALT-C. A sequência determinada por esse contig foi denominada ALT-C-h (homóloga da ALT-C) por apresentar 4 substituições conservativas da sequência determinada anteriormente. A sequência foi utilizada em PCR para inclusão de sítio de restrição para BamHI e EcoRI, clonado em pGEX4T-1 e transformados em E. coli AD494(DE3) para ensaios de expressão. O cultivo foi crescido até a fase log e a indução expressão realizada com IPTG por 3 horas, a identidade da proteína expressa foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo policlonal anti-ALT-C. A construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de R. alternatus fornece uma fonte de estudo interessante de biomoléculas ativas nos venenos como, por exemplo, as desintegrinas visando aplicações farmacológicas para patologias envolvendo integrinas como angiogênese, progressão e metástase tumoral.

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3224.pdf: 2177320 bytes, checksum: 89cae5d787c7083f95c6ec6ff9f87e2a (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / The genus Anastrepha which is endemic to the Neotropical region has big economic importance to cause great losses in fruit production. We studied three species of the cryptic group fraterculus: Anastrepha fraterculus, A. obliqua and A. sororcula. Although no single marker is able to distinguish these species, some morphological and behavioral markers are able to distinguish them. There is evidence that these markers do not match the patterns of genetic variation and divergence of these flies. We investigated the role of genes related or not to reproduction in the speciation of these flies. We used a cDNA library of the reproductive tissues of females of A. fraterculus, to isolate expressed genes from those tissues. From a framework of divergence population genetics, we estimated relevant demographic parameters that reported the genetic architecture of speciation in this group. To study the separation of these species, we used gene trees as a framework to be compared and to infer eventual species trees. We amplified 12 genes isolated from the cDNA library. The analysis of population divergence and levels of polymorphism were made in DNAsp and showed high levels of polymorphism for the vast majority of loci. Neutrality tests reveal that only Fs Fu was significantly negative for the combination of species here considered. These results indicate a possible evidence of population expansion on this group of species. These data were corroborated by the values of ancestral and current theta estimated from the analysis undertaken on the software IMa2 program. These analysis also showed relevant levels of migration in some contrasts, but particularly among species which are more distant in the tree from the other two. However, the same analyses performed amongst species pairs fail to reveal high levels of migration rate among species, though t e theta values were close to those estimated in the analysis with all three species together. We also tested for the presence of selection at different loci, using the program PAML and obtained evidence of positive selection for three genes CG7203, CG8064 and MLC, whereas the gene CG7009 showed evolution by a mild purifying selection. The haplotype networks showed the grouping of haplotypes of the species for five of the 12 genes CG7009, CG8064, Elp, TCTP and Cyclophylin. CG7009 revealed possible species specific markers for A. sororcula. We carried out the deep coalescence analysis in the program MESQUITE, comparing gene trees simulated with real trees for each gene locus, placing the species as an outgroup for each tree model and obtained significant results, which would be compatible to simulated scenarios only for the genes V Cyclophylin and TCTP. The tree obtained by minimizing the deep coalescence estimated showed that A. sororcula is farther from the other two species of the genus Anastrepha. It is necessary, however, a larger investigation of different genes, particularly genes with higher evolutionary rates and an expansion of the samples of these species to consider geographical distribution and assist in studies of speciation of this group. / O gênero Anastrepha, endêmico da região Neotropical, tem grande importância econômica por causar grandes prejuízos na produção de frutos. Neste trabalho, estudamos três espécies do grupo críptico fraterculus: Anastrepha fraterculus, A. obliqua e A. sororcula. Apesar de não haver um único marcador capaz de diferenciar essas espécies, alguns marcadores morfológicos e comportamentais, são capazes de distinguí-las. Há evidências de que esses marcadores não correspondam aos padrões de variação e divergência genética dessas moscas. Investigamos o papel de diversos genes nucleares na especiação dessas moscas. Usamos uma biblioteca de cDNAs do aparelho reprodutivo de fêmeas de A. fraterculus, para a amplificação de genes expressos desse tecido. A partir de um quadro de divergência genética populacional, estimamos parâmetros demográficos relevantes que informaram a arquitetura genética da especiação neste grupo. Para estudar a separação dessas espécies, utilizamos árvores de genes como base e as comparamos com árvores de espécies. Foram amplificados 12 genes expressos na biblioteca de cDNAs. As análises de divergência populacional e nível de polimorfismo foram feitas no DNAsp e mostraram valores bem altos do nível de polimorfismo para a grande maioria dos loci e os testes de neutralidade foram significativos apenas para Fs de Fu. Esses resultados indicam uma possível expansão populacional das espécies estudadas. Estes dados foram corroborados pelos valores de q das análises realizadas pelo programa IMa2, que também mostrou uma taxa de migração alta entre a espécie mais distante na árvore para uma das outras duas. No entanto, as mesmas análises feitas com as espécies par a par não revelaram uma taxa de migração significativa entre as espécies, os valores de t e theta foram próximos dos obtidos para as análises com as espécies juntas. Fizemos também testes para detectar a presença de seleção nos diferentes loci, usando o programa PAML e obtivemos indício de seleção positiva para três genes CG7203, MLC e CG8064; o gene CG7009, no entanto, mostrou evoluir por uma seleção purificadora branda, pois não rejeitamos somente o primeiro dos dois testes. As redes haplotípicas, feitas no TCS, mostraram o agrupamento dos haplótipos das espécies para cinco dos 12 genes CG7009, CG8064, Elp, TCTP e Cyclophylin. Para o CG7009 notamos possíveis marcadores específicos para A. sororcula. Realizamos, pelo programa MESQUITE, análises de coalescência profunda comparando árvores de genes simuladas com árvores de genes reais para cada locus, colocando uma das espécies como grupo externo em cada modelo de árvore e III obtivemos resultados significativos apenas para os genes Cyclophylin e TCTP. A árvore obtida pela minimização das coalescências profundas mostrou que A. sororcula se encontra mais distante das outras duas espécies do gênero Anastrepha. Faz-se necessária, no entanto, uma investigação maior de diferentes genes, particularmente genes com taxas evolutivas mais altas e uma expansão das amostras destas espécies para considerar sua distribuição geográfica e auxiliar nos estudos da especiação deste grupo.

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T18:41:10Z : No. of bitstreams: 1 rodovalho_cm_dr_rcla.pdf: 1352309 bytes, checksum: b91a746d690f5903c39601146a591fab (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Formigas cortadeiras do gênero Atta, popularmente conhecidas como saúvas, são as mais derivadas dentro da tribo Attini. Apresentam grande importância ecológica, porém, pelo hábito de cortarem folhas para manutenção do fungo simbionte e pelo enorme tamanho das colônias, causam muitos prejuízos às lavouras, pastagens e plantações, sendo consideradas pragas agrícolas. Atta laevigata Smith, 1858 apresenta vasta distribuição pelo Brasil e é responsável pela herbivoria de inúmeras plantas dicotiledôneas, gramíneas e espécies nativas de diferentes biomas. O presente trabalho teve como objetivos a caracterização parcial do transcriptoma e do genoma mitocondrial de A. laevigata. Foram caracterizadas 2006 sequências únicas do transcriptoma, a partir de uma biblioteca de cDNA preparada com indivíduos inteiros da formiga. Entre essas sequências, 16 provavelmente representam genes com grande número de transcritos. Esses 16 genes estão relacionados a três funções celulares: (i) conservação de energia através de reações redox na mitocôndria; (ii) estrutural, pelo citoesqueleto e músculos; (iii) regulação da expressão gênica e metabolismo. Considerando o estilo de vida e processos biológicos chaves para essas formigas, 146 sequências foram identificadas com base na sua utilização para o controle de cortadeiras pragas. A partir de dados da biblioteca de cDNA e procedimentos envolvendo primer walking, o genoma mitocondrial de A. laevigata foi parcialmente caracterizado, apresentandose com 17920 pb, maior, portanto, do que outros já descritos em Hymenoptera, mesmo considerando-se a impossibilidade de determinação da sequência de uma pequena porção do mtDNA, envolvendo a região controle, uma parte do 12S e os tRNAs S1, V e M. Como já descrito para outros mitogenomas, o de A. laevigata apresentou alto conteúdo AT, os mesmos 13 genes codificadores... / Leafcutter ants from Atta genus, popularly known as “saúvas”, are the most derived of the tribe Attini. They have major ecological importance, but, because of their habit of cutting leaves for the maintenance of the symbiotic fungus and the huge colony size, they impose severe economic damages to plantations, pastures, and agriculture, being considered as agriculture pests. Atta laevigata shows wide distribution in Brazil and it is responsible for the herbivory of many dicots, grass, and native species from different biomes. The present work aimed to characterize the transcriptome and the mitochondrial genome of A. laevigata. 2,006 unique sequences of the transcriptome were characterized from a cDNA library constructed with whole individuals. Among those sequences, 16 are likely from genes with high number of transcripts. Those 16 genes are related with three cellular functions: (i) energy conservation through redox reactions in mitochondria; (ii) cytoskeleton and muscle structuring; (iii) regulation of gene expression and metabolism. Based on lifestyle and key biological processes of these ants, 146 sequences were identified with potential use for controlling pest leafcutters. Using data from cDNA library and primer walking proceedings, the mitochondrial genome of A. laevigata was partially characterized with 17,920 bp, being larger than the others already described for Hymenoptera. A small part of the mtDNA was not sequenced, including the control region, a portion of 12S and tRNAs S1, V, and M. As described before for other mitogenomes, A. laevigata mtDNA displayed high AT contain, the same 13 proteincoding genes and the two ribosomal subunits with length and location according to the hypothetic ancestral mitogenome. Rearrangements were found for the tRNAs, but the most remarkable difference were the high number and longer length of intergenic regions presented in the mtDNA... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4606.pdf: 10556895 bytes, checksum: debf5633a053f88ca7dd4618edef9175 (MD5) Previous issue date: 2012-07-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / The plant biomass is a large-scale available resource and one of its more important applications is the second-generation ethanol production. However, the enzyme cost is one of the biggest barriers for economically viable ethanol from biomass. Therefore, it is important to identify fungal strains that can produce high concentrations of plant biomass-degrading enzymes. The aim of this work was to clone, study the gene expression and characterize the plant biomass-degrading transcript set of the filamentous fungus Trichoderma harzianum IOC-3844. A total of 1,543 highquality reads from the Trichoderma harzianum IOC-3844 cellulose induced cDNA library were organized into 1,002 transcripts representing 167 contigs and 835 singlets. Of these 1,002 transcripts 646 had unknown functions and 356 showed associated functions. Among the transcripts with associated functions, we found 20 transcripts related to plant biomass deconstruction. The real time PCR analysis of Trichoderma harzianum IOC-3844 mycelia grown for 36 and 60 hours in cellulose, revealed that the levels of the following mRNAs were induced by at least 2,000-fold when compared to uninduced mycelia: cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 and swo1. In some cases, the values were higher than 100,000-fold. Among the transcripts analyzed by real time PCR, cbh1, cbh2 and egl7 exhibited the highest expression levels. The Trichoderma harzianum IOC-3844 exhibited a repertoire with high expression of plant biomassdegrading transcripts. The enzymes EGIII and Xyn2 were recombinantly expressed in Pichia pastoris, showing good quality purification and good enzymatic activity. The heterologous expression assays made possible future studies aiming at the industrial application of the enzymes. Therefore, this strain showed potencial to produce biomassdegrading enzymes for second-generation ethanol production and to be a source of enzymes for the paper industry / A biomassa vegetal é um recurso disponível em larga escala e uma das suas mais imporantes aplicações é a produção de etanol de segunda geração. No entanto, o custo das enzimas é um dos maiores entraves para a produção economicamente viável deste etanol. Neste contexto, é importante encontrar organismos produtores de grandes quantidades de enzimas que degradam a biomassa. Os objetivos deste estudo foram clonar, estudar a expressão gênica e caracterizar o conjunto de enzimas que degradam a biomassa vegetal, do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC-3844. Um total de 1.543 seqüências de boa qualidade, geradas a partir de uma biblioteca de cDNA do Trichoderma harzianum IOC-3844, induzido por celulose, foi organizado em 1.002 transcritos, sendo 167 representados por mais de uma seqüência e 835 representados por apenas uma seqüência. Destes transcritos, 356 tiveram função associada e 646 não tiveram. Com isso, entre os transcritos com função associada, foram listados 20 transcritos envolvidos com degradação de biomassa vegetal. Análises de PCR em tempo real do micélio de Trichoderma harzianum IOC-3844, crescido por 36 e 60 horas em celulose, mostraram níveis de mRNA mais de 2.000 vezes mais representados para os transcritos cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 e swo1, quando comparados com o micélio não induzido. Em alguns casos as maiores representatividades alcançaram valores superiores a 100.000 vezes. Entre os transcritos analisados o cbh1, o cbh2 e o egl7, mostraram os mais altos níveis de expressão. O Trichoderma harzianum IOC-3844 exibiu um repertório com alta expressão de transcritos envolvidas na degradação de biomassa vegetal. As enzimas EGIII e Xyn2 foram expressas em sistema recombinante com uso da levedura Pichia pastoris, apresentando facilidade de purificação e boa atividade enzimática. Os ensaios de expressão heteróloga viabilizaram estudos posteriores que visam a aplicação industrial das enzimas. Assim, esta cepa mostrou potencial para produzir enzimas que degradam a biomassa para a produção de etanol de segunda geração, e para ser fonte de enzimas para a indústria de papel.