Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3272.pdf: 1459537 bytes, checksum: 78eeb30fb7d9022c1a6c97b55c565d47 (MD5) Previous issue date: 2010-08-02 / Financiadora de Estudos e Projetos / The genus Anastrepha is the largest in the family Tephritidae (Trypetinae, Toxotrypanini). The construction of cDNA libraries is important for identifying new genes and establishing genetic markers on non-models organisms such as the genus Anastrepha. Among the proteins involved in reproduction, we can cite those belonging cascade sexual and those responsible for forming the eggshell. The purpose of this study was to build a cDNA library from a pool of female reproductive tissues Anastrepha obliqua to breed ESTs, to search for genes with a high evolutionary rate, focusing on chorionic and vitelline proteins. We were sequenced 2304 clones obtained from the reproductive tissues of female flies Anastrepha obliqua. In total, 310 contigs and 506 singlets were generated wich were classified into different proteins classes. The chorionic proteins and Sxl revealed to be under selection positive as well as the vitelline Vm 26Aa ', which was possibly generated by a gene duplication of Vm 26aa, while Tra2 seems under purifying selection. The inference of the secondary structure of proteins studied revealed that the sites under positive selection were present on outside membrane. The population analysis of genes chorionic, vitelline, Sxl and Tra2 revealed no separation between the 3 species, although in some situations have occurred separation between some of the haplotypes for a single specie. With these results, it was possible to identify new genes, make the full sequencing for some vitelline and chorionic genes on pools of other species of Anastrepha, and we also identified that some of these genes are under positive selection pressure. / O gênero Anastrepha é o maior dentro da família Tephritidae (Trypetinae, Toxotrypanini). A construção de bibliotecas de cDNA é importante para a identificação de novos genes e no estabelecimento de marcadores genéticos em organismos não-modelos como do gênero Anastrepha. Dentre as proteínas envolvidas na reprodução podemos citar as pertencentes da cascata sexual e as que são responsáveis por formar a parede do ovo. Assim, este trabalho teve como objetivo construir uma biblioteca de cDNA a partir de um pool de tecidos reprodutivos femininos de Anastrepha obliqua para gerar ESTs, afim de buscar genes com alta taxa evolutiva, focando em proteínas coriônicas e vitelínicas. No Total foram seqüenciados 2304 clones obtidos a partir dos órgãos reprodutivos de fêmeas de moscas de Anastrepha obliqua. Ao todo foram gerados 310 contigs e 506 singlets que foram classificados em diferentes classes de proteínas. As proteínas coriônicas e o Sxl revelaram estar sob seleção positiva, assim como a vitelínica Vm 26Aa´ que possivelmente foi gerada por uma duplicação gênica do Vm 26Aa, enquanto que o Tra2 parece estar sob seleção purificadora. A inferência da estrutura secundária das proteínas estudadas revelou que os sítios sob seleção positiva estavam presentes do lado externo da membrana. As análises populacionais dos genes coriônicos, vitelínicos, Sxl e Tra2 não revelaram uma separação entre as 3 espécies, apesar de em algumas situações ter ocorrido uma separação entre alguns dos haplótipos para uma determinada espécie. Com resultados obtidos, foi possível identificar novos genes, fazer o seqüenciamento completo para alguns genes coriônicos e vitelínicos em pools de outras espécies de Anastrepha, e também foi possível identificar que alguns destes genes estão sob pressão de seleção positiva.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2739.pdf: 371228 bytes, checksum: c62273cf2751279fd8df20ebbb145ad4 (MD5) Previous issue date: 2009-07-23 / Universidade Federal de Minas Gerais / Two genetic linkage maps were constructed referent to two full-sib families (G1 and G2) of the marine shrimp species Litopenaeus vannamei, and the integration of these maps was accomplished. The mapping was based on polymorphic markers derived from nine AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) primers. A total of 103 and 59 segregating polymorphic markers were used in the construction of the maps for families G1 and G2, respectively. The G1 family map consisted of 14 linkage groups, with estimated genome coverage of approximately 350 cM. The G2 map presented 4 linkage groups, with genome coverage of around 300 cM. The integration of the maps evidenced eight AFLP anchor markers in a same linkage group (LG1) in both families, to which 66 markers were allocated, leading to a well saturated linkage group, with estimated genome coverage of 874.16 cM. / Dois mapas genéticos de ligação foram construídos referentes a duas famílias de irmãos completos (G1 e G2) da espécie de camarão marinho Litopenaeus vannamei e foi realizada a integração desses mapas. O mapeamento foi baseado em marcadores polimórficos derivados de nove primers AFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos Amplificados). Um total de 103 e 59 marcadores polimórficos segregantes foram utilizados respectivamente para a construção dos mapas das famílias G1 e G2. O mapa da família G1 consistiu de 14 grupos de ligação, com cobertura estimada do genoma de aproximadamente 350 cM. O mapa da G2 apresentou 4 grupos de ligação, com cobertura do genoma de aproximadamente 300 cM. A integração dos mapas evidenciou 8 marcadores âncoras AFLP em um mesmo grupo de ligação (GL1) em ambas as famílias, no qual foram alocados 66 marcadores, o que conduz um grupo de ligação bem saturado, com estimativa de cobertura do genoma de 874,16 cM.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4628.pdf: 2499573 bytes, checksum: 2c2be6a33c549cfb6b269f6f1846c2b7 (MD5) Previous issue date: 2009-07-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / Species of the Anastrepha fraterculus group are one of the most important agricultural pest from South America and form a group of closely related species whose identification is very difficult. It is problematic to establish reciprocal monophyly of species from this group, because of the great variability and superimposition of morphological traits used in their identification. Many evidences suggest that sex-related genes would be good candidates to discriminate species with low divergence, because they could be involved in the speciation of such species and show high level of differentiation rate. Most of such studies are on genes related to male-female interaction, however few are focused on sex-differentiation genes. We originally aimed to study the role of two sex-determination genes, doublesex (dsx) and fruitless (fru), in the differentiation of the species of Anastrepha fraterculus complex. We also studied the molecular evolutionary pattern of these genes, from high divergence interspecific to low divergence intraspecific data. In the process we assessed the hability of different methodologies in detecting signals of particular selective patterns in the studied regions, and tested a new approach to investigate patterns of positive selection using population data. In this new approach we combined in the same analysis synonymous and nonsynonymous mutations frequencies, their position in the haplotype network, and nonsynonymous mutations capacity to change amino acid physicochemical properties. Differently of what was proposed in previous works, both dsx and fru showed distinct signal of positive selection promoting their differentiation. Furthermore, we detected a selective sweep in the fru connecting region of A. obliqua, possibly involved in the split of haplotype network in two groups, with A. obliqua isolated from the other two species. Although both genes are involved in the sex-differentiation cascade, fru established in clearer way the separation, although not yet completely, of A. obliqua from the other two species here studied. / As espécies que formam grupo Anastrepha fraterculus estão entre as principais pragas agrícolas da América do Sul e compõem um grupo de espécies intimamente relacionadas de difícil identificação. Devido à grande variabilidade e sobreposição encontrada nos marcadores utilizados em sua identificação, ainda é difícil o estabelecimento da monofilia recíproca das espécies deste grupo. Muitas evidências sugerem que genes relacionados às características sexuais seriam bons candidatos para discriminar espécies com baixa divergência, graças à possibilidade de estarem envolvidos no próprio processo de separação das mesmas e apresentarem uma elevada taxa de diferenciação. A maior parte destes estudos têm se concentrado em genes relacionados à interação entre machos e fêmeas, porém poucos em genes da diferenciação sexual. Dessa forma, estudamos neste trabalho dois genes, doublesex (dsx) e fruitless (fru), envolvidos com a determinação sexual com o intuito inicial de avaliar seu possível papel na diferenciação do complexo de espécies Anastrepha fraterculus. Analisamos também os padrões de evolução molecular destes genes, examinando desde dados interespecíficos de alta divergência e dados intraespecíficos de baixa divergência. Neste processo avaliamos a capacidade de diferentes metodologias em detectar sinais de padrões seletivos específicos nas regiões estudadas, bem como testamos uma nova abordagem para estudo de evolução molecular em dados populacionais. Nesta nova abordagem conciliamos em uma mesma análise dados de frequência de mutações sinônimas e nãosinônimas, da sua posição na rede haplotípica, bem como da capacidade das mutações nãosinônimas em mudar as propriedades físico-químicas de aminoácidos. Diferentemente do encontrado em estudos anteriores, tanto dsx quanto fru mostraram sinais inequívocos de seleção positiva atuando em sua diferenciação, embora revelando processos diferentes. Além disso, detectamos um evento de selective sweep na região conectora de fru em A. obliqua, possivelmente envolvido na separação da rede haplotípica em dois grupos, com A. obliqua isolada das outras duas espécies. Apesar dos dois genes participarem da mesma cascata de diferenciação sexual, fru estabeleceu de forma mais clara a separação, porém ainda não completa, de A. obliqua das outras espécies aqui estudadas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4383.pdf: 5759644 bytes, checksum: 0a6a6bb722062f7934be619267686311 (MD5) Previous issue date: 2012-04-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / Selenium (Se) is an essential element found in selenoproteins as the 21st amino acid (Selenocysteine Sec).For the Sec incorporation and the related biosynthetic pathaway, several elements are required: tRNASec, a UGA codon and a Sec insertion sequence (SECIS), a conserved motif downstream of the selenoprotein encoding gene. Selenoproteins generally participate in the cellular redox balance, playing an important role on cell growth and proliferation. These proteins, as well as the the Sec synthesis pathway, are present in members of the Bacteria, Archaea and Eukarya domains, being identified in several protozoa, including the kinetoplastids. Auranofin, a gold-contaning antirheumatic drug, is a known selenoproteins inhibitorand Trypanosoma brucei and Leishmania majorcells are sensitive to this compound, with a LD50 in nanomolar range. This indicates a possible dependence of these parasites on selenoproteins. Theselenophosphate synthetase (SELD/SPS2) is responsible for the formation of monoselenophosphate from selenide and ATP, being essencial for selenoprotein biosynthesis. SPS2 knockdown led to apoptosis under sub-optimal growth conditions. The selenoproteome of these flagellated protozoa consists of distant homologs of the mammalian SelK and SelT, and a novel selenoprotein designated SelTryp, a kinetoplastidspecific protein. The functions of any of these selenoproteins are not known.We have investigated the effect of their downregulation in T. brucei to interpret their possible physiological role. The TbSelK depletion shows no effect on growth under optimal conditions, but the cells became more sensitive to endoplasmic reticulum stress agents and oxidative stress, suggesting that SelK is an ER stress-regulated protein and plays an important role in protecting T. brucei cells from ER stress agent. The TbSelT gene silence by RNA interference hampers the parasite survival, but the sensitivity to the agents tested was not asevident as it was forTbSelK, suggesting a role for TbSelT in protection against stress, but not specifically ER stress. Our results show the importance of selenocysteine and selenoproteins to parasite survival. / Selênio (Se) é um elemento essencial encontrado em selenoproteínas na forma do 21º aminoácido selenocisteína (Sec U). A incorporação co-traducional de Sec depende de uma complexa via de síntese, de um códon de terminação UGA em fase de leitura e uma estrutura terciária do RNA mensageiro conhecida como elemento SECIS. A maioria das selenoproteínas conhecidas participa de processos de manutenção do estado redox das células, tendo um importante papel no crescimento e proliferação celular. Essas proteínas, bem como os componentes da via de síntese de Sec, estão presentes em membros dos domínios de Bactérias, Arquéais e Eucaria, tendo sido identificada em diversos protozoários, incluindo os kinetoplastidas. Auranofin, um composto de ouro usado como agente antireumático, tem sido descrito como um inibidor de selenoproteínas através de sua ligação com o aminoácido selenocisteína e células de Trypanosoma brucei e Leishmania major são altamente sensíveis a este composto, apresentando um LD50 na faixa de nanomolar. Esta evidência indica uma possível dependência destes parasitas por selenoproteínas e consequentemente pela sua via de síntese. A selenofosfato sinetase (SELD/SPS2) é a enzima responsável pela síntese de monoselenofosfato a partir de seleneto e ATP, sendo, portanto uma proteína fundamental na síntese de selenocisteína. Sua depleção levou a apoptose celular quando mantidas em condições de estresse. Esse efeito pode ser causado pela consequente falta das selenoproteínas ou pelo acúmulo de espécies tóxicas de selênio, como o seleneto. Os protozoários apresentam número reduzido de selenoproteínas e kinetoplastidas apresentam 3, duas homólogas distantes de mamíferos, SelK e SelT, e uma nova proteína exclusiva denominada SelTryp, que não apresentam homologia com nenhuma outra proteína descrita. O papel dessas proteínas não é conhecido, e nós investigamos suas possíveis funções através da inibição de sua expressão. A depleção de TbSelK não mostrou efeito sob condições normais, mas tornou as células mais sensíveis a agentes indutores de estresse de retículo endoplasmático, o que nos permite inferir uma função de manutenção da homeostase dessa organela. A depleção de TbSelT causou uma diminuição no crescimento celular, mas o aumento da sensibilidade aos agentes indutores de estresse não foi tão pronunciada como em TbSelK. Nossos resultados revelam a importância de selenocisteína para parasitas, uma vez que esses organismos enfrentam diversos tipos de estresses para manter a viabilidade e a progressão da doença nos diferentes hábitats encontrados ao longo do seu ciclo de vida.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3224.pdf: 2177320 bytes, checksum: 89cae5d787c7083f95c6ec6ff9f87e2a (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / The genus Anastrepha which is endemic to the Neotropical region has big economic importance to cause great losses in fruit production. We studied three species of the cryptic group fraterculus: Anastrepha fraterculus, A. obliqua and A. sororcula. Although no single marker is able to distinguish these species, some morphological and behavioral markers are able to distinguish them. There is evidence that these markers do not match the patterns of genetic variation and divergence of these flies. We investigated the role of genes related or not to reproduction in the speciation of these flies. We used a cDNA library of the reproductive tissues of females of A. fraterculus, to isolate expressed genes from those tissues. From a framework of divergence population genetics, we estimated relevant demographic parameters that reported the genetic architecture of speciation in this group. To study the separation of these species, we used gene trees as a framework to be compared and to infer eventual species trees. We amplified 12 genes isolated from the cDNA library. The analysis of population divergence and levels of polymorphism were made in DNAsp and showed high levels of polymorphism for the vast majority of loci. Neutrality tests reveal that only Fs Fu was significantly negative for the combination of species here considered. These results indicate a possible evidence of population expansion on this group of species. These data were corroborated by the values of ancestral and current theta estimated from the analysis undertaken on the software IMa2 program. These analysis also showed relevant levels of migration in some contrasts, but particularly among species which are more distant in the tree from the other two. However, the same analyses performed amongst species pairs fail to reveal high levels of migration rate among species, though t e theta values were close to those estimated in the analysis with all three species together. We also tested for the presence of selection at different loci, using the program PAML and obtained evidence of positive selection for three genes CG7203, CG8064 and MLC, whereas the gene CG7009 showed evolution by a mild purifying selection. The haplotype networks showed the grouping of haplotypes of the species for five of the 12 genes CG7009, CG8064, Elp, TCTP and Cyclophylin. CG7009 revealed possible species specific markers for A. sororcula. We carried out the deep coalescence analysis in the program MESQUITE, comparing gene trees simulated with real trees for each gene locus, placing the species as an outgroup for each tree model and obtained significant results, which would be compatible to simulated scenarios only for the genes V Cyclophylin and TCTP. The tree obtained by minimizing the deep coalescence estimated showed that A. sororcula is farther from the other two species of the genus Anastrepha. It is necessary, however, a larger investigation of different genes, particularly genes with higher evolutionary rates and an expansion of the samples of these species to consider geographical distribution and assist in studies of speciation of this group. / O gênero Anastrepha, endêmico da região Neotropical, tem grande importância econômica por causar grandes prejuízos na produção de frutos. Neste trabalho, estudamos três espécies do grupo críptico fraterculus: Anastrepha fraterculus, A. obliqua e A. sororcula. Apesar de não haver um único marcador capaz de diferenciar essas espécies, alguns marcadores morfológicos e comportamentais, são capazes de distinguí-las. Há evidências de que esses marcadores não correspondam aos padrões de variação e divergência genética dessas moscas. Investigamos o papel de diversos genes nucleares na especiação dessas moscas. Usamos uma biblioteca de cDNAs do aparelho reprodutivo de fêmeas de A. fraterculus, para a amplificação de genes expressos desse tecido. A partir de um quadro de divergência genética populacional, estimamos parâmetros demográficos relevantes que informaram a arquitetura genética da especiação neste grupo. Para estudar a separação dessas espécies, utilizamos árvores de genes como base e as comparamos com árvores de espécies. Foram amplificados 12 genes expressos na biblioteca de cDNAs. As análises de divergência populacional e nível de polimorfismo foram feitas no DNAsp e mostraram valores bem altos do nível de polimorfismo para a grande maioria dos loci e os testes de neutralidade foram significativos apenas para Fs de Fu. Esses resultados indicam uma possível expansão populacional das espécies estudadas. Estes dados foram corroborados pelos valores de q das análises realizadas pelo programa IMa2, que também mostrou uma taxa de migração alta entre a espécie mais distante na árvore para uma das outras duas. No entanto, as mesmas análises feitas com as espécies par a par não revelaram uma taxa de migração significativa entre as espécies, os valores de t e theta foram próximos dos obtidos para as análises com as espécies juntas. Fizemos também testes para detectar a presença de seleção nos diferentes loci, usando o programa PAML e obtivemos indício de seleção positiva para três genes CG7203, MLC e CG8064; o gene CG7009, no entanto, mostrou evoluir por uma seleção purificadora branda, pois não rejeitamos somente o primeiro dos dois testes. As redes haplotípicas, feitas no TCS, mostraram o agrupamento dos haplótipos das espécies para cinco dos 12 genes CG7009, CG8064, Elp, TCTP e Cyclophylin. Para o CG7009 notamos possíveis marcadores específicos para A. sororcula. Realizamos, pelo programa MESQUITE, análises de coalescência profunda comparando árvores de genes simuladas com árvores de genes reais para cada locus, colocando uma das espécies como grupo externo em cada modelo de árvore e III obtivemos resultados significativos apenas para os genes Cyclophylin e TCTP. A árvore obtida pela minimização das coalescências profundas mostrou que A. sororcula se encontra mais distante das outras duas espécies do gênero Anastrepha. Faz-se necessária, no entanto, uma investigação maior de diferentes genes, particularmente genes com taxas evolutivas mais altas e uma expansão das amostras destas espécies para considerar sua distribuição geográfica e auxiliar nos estudos da especiação deste grupo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4084.pdf: 6015722 bytes, checksum: 35112ba46f0915602cf01b2a6f292699 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / Universidade Federal de Minas Gerais / The Tephritidae includes approximately 4500 species described to date and many of these species make up the main genera of economic importance: Anastrepha, Bactrocera and Ceratitis. The genus Anastrepha is among the Tephritidae with greatest diversity in the Americas including 230 described species, among which some species with great economic importance because they represent important fruit pests. There is evidence that species in the fraterculus group have diverged recently, even having some cryptic species. Because of this, species in the fraterculus group are a great system for evolutionary studies. For evolutionary studies, it is necessary to evaluate the rates of molecular evolution and their role in identifying rates of gene flow and population differentiation, the construction of tree species and a possible separation for the species. Seeking a better understanding of the fraterculus group, we chose three species of this group, Anastrepha obliqua, A. fraterculus and A. sororcula as models for this study and five genes isolated from a cDNA library of reproductive tissues of Anastrepha. Several genes that are expressed in reproductive tissues have a higher divergence rate THAN those expressed in non-reproductive tissues, may thus give evidence of reproductive isolation. In this work, we found evidence of positive diversifying and positive selection for a couple of genes (CG11912 and CG10031), and high levels of polymorphism, although they failed to meet statistical significance for positive selection, in other genes here studied, such as ,Lcp65Ac and CG16712, whereas Df31 was more conserved. An analysis of molecular variance found that levels of genetic polymorphism are best explained by differences between species THAN between geographic regions. Haplotype networks for each gene failed to differentiate the species here studied and showed high levels of shared polymorphism among the species, with some rare exceptions. On the other hand, a joint analysis of these data to try to infer a species tree indicate a strong cohesion for populations of A. obliqua from the Brazilian Northeast and Southeast while for A. fraterculus and A. sororcula we observed a substructure that separated Southeeast populations of A. sororcula, which was well defined, from Northeast populations, which may be hybridizing with populations of A. fraterculus from the Northeast, due to great number of shared polymorphisms. Other THAN populations in the Brazilian northeast, A. fraterculus also forms a separate, though short, lineage. Considering these findings, a broader sampling is needed, especially in areas not yet collected particularly in the Northeast, seeking to untangle the phylogenetic relationships not only among these species, but also other species of the fraterculus group. / Os Tephritidae incluem aproximadamente 4500 espécies já descritas e muitas destas espécies compõem os principais gêneros de importância econômica: Anastrepha, Bactrocera e Ceratitis. O gênero Anastrepha é, entre Tephritidae, o que possui maior diversidade nas Américas incluindo 230 espécies descritas, dentre as quais algumas espécies apresentam grande importância econômica por representarem importantes pestes da fruticultura. Há evidências de espécies que constituem o grupo fraterculus terem divergido há pouco tempo apresentando ainda algumas espécies crípticas. Devido a esta característica em particular, espécies do grupo fraterculus apresentam uma grande vantagem para estudos evolutivos. Para realizar estudos evolutivos torna-se necessário avaliar as taxas de evolução molecular bem como seu papel na identificação de taxas de fluxo gênico e diferenciação populacional, a construção de árvores de espécie e uma possível separação das espécies. Buscando um melhor entendimento do grupo fraterculus, escolhemos três espécies constituintes desse grupo, Anastrepha obliqua, Anastrepha. fraterculus e Anastrepha. sororcula, como modelos para este estudo e cinco genes isolados de biblioteca de cDNA de tecidos reprodutivos de espécies de Anastrepha. Diversos genes que são expressos em tecidos reprodutivos apresentam uma taxa de divergência maior do que os expressos em tecidos não reprodutivos, podendo assim dar indícios de isolamento reprodutivo. Neste trabalho encontramos essas características em genes que indicam seleção positiva (CG11912 e CG10031), e os demais genes que embora não tenham apresentado significância estatística para serem considerados possuidores de seleção positiva, no entanto apresentam terem regiões potencialmente sob seleção positiva direcional para Df31 e Lcp65Ac e seleção positiva diversificadora para os genes Df31 e CG16712. Na análise de variância molecular encontramos que a diferenciação espacial é mais bem explicada pelas diferenças entre as espécies do que entre regiões geográficas. As redes haplotípicas e árvores de espécies indicam uma forte coesão entre as populações de A. obliqua do Nordeste e Sudeste indicando ausência de estruturação genética para esta espécie enquanto para A. fraterculus e A. sororcula foi encontrado uma sub estruturação que separa A. sororcula do Nordeste e A. sororcula do Sudeste, sendo que A. sororcula do nordeste pode estar hibridizando com A. fraterculus do Nordeste. As análises de migração encontraram migrações diferenciais para estas espécies, colocando A. obliqua mais isolada das demais e uma relação mais próxima entre A. fraterculus e A. sororcula. De frente aos resultados encontrados neste trabalho fica claro a necessidade de uma maior amostragem, principalmente em áreas ainda não coletadas entre as regiões amostradas na tentativa de buscar entender não apenas quais são as possíveis relações entre A. fraterculus e A. sororcula mas também entre outras espécies do grupo fraterculus.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4282.pdf: 3615075 bytes, checksum: 6892b5fe2df64eef0eef789c1ee1a527 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / The Africanization process of Apis mellifera has raised several questions about the genetic makeup of resulting populations. This study aimed to identify the number, frequency and distribution of different mitochondrial haplotypes, as well as their origin in Africanized colonies sampled in different regions of the country. In this sense, 1626 colonies, 1048 from Brazil and the remaining from 12 other countries. Including samples from scutellata, iberiensis, and ligustica subspecies, Africanized and non-Africanized honeybees from South America and Central America were analyzed. Identification of patterns was done by PCR-RFLP of COI region with endonucleases BclI and TaqI, followed by sequencing of representative samples of these patterns. These results are then related to the patterns already described for COI-COII region of the same samples by Collet et al. (2206). Geographic association between observed electrophoretic patterns and the relationships among haplotypes allowed us to make certain inferences regarding geographical origin of these patterns. BclI generated three restriction patterns, designated 1, 2 and 3, while TaqI generated four restriction patterns, A, B, C and D. These patterns resulted in seven composite patterns formed by the association of patterns produced by the two nucleases in samples from Brazil. When previous data on the DraI restriction patterns of the intergenic region COI-COII were considered, 17 composite haplotypes were observed in those samples. Samples from Brazil, South Africa, Kenya, Portugal, Spain, Italy and Chile (n = 90) were submitted to sequencing reaction, generating 35 haplotypes and 13 different aminoacid sequences. Our data demonstrated that simple association of restriction patterns was not adequate to infer geographic origin of mitochondrial lineages in Africanized populations, a task which requires knowledge of their corresponding nucleotide sequences. It was possible to infer the origin of 11 of the 17 composite COI and COI-COII haplotypes found in samples from Brazil. COI patterns did not show a clinal distribution like the one observed with COI-COII patterns. Our data clearly indicates nucleotide and amino acid substitutions privative to European and African / Africanized samples, a matter that deserves subsequent research. / O processo de africanização de Apis mellifera fez surgir diversas questões acerca da constituição genética da população resultante. Esse trabalho teve por objetivo identificar o número, a freqüência e a distribuição dos diferentes haplótipos mitocondriais, bem como sua possível origem nas colônias africanizadas amostradas em diferentes regiões do país. Neste sentido, foram analisadas amostras de 1.626 colônias, sendo 1048 do Brasil e as demais de outros 12 países, incluindo amostras de A. m. scutellata, A. m. iberiensis, A. m. ligustica, africanizadas e não-africanizadas da América do Sul e Central. A identificação desses padrões foi feita por PCR-RFLP da região COI com as endonucleases BclI e TaqI, seguida pelo sequenciamento de amostras representativas desses padrões. Esses resultados foram, então, associados aos padrões já descritos para a região COI-COII das mesmas amostras por Collet et al. (2006). A associação geográfica entre os padrões eletroforéticos observados e as relações entre os haplótipos sequenciados estabelecidas em rede de haplótipos permitiram efetuar certas inferências quanto à origem geográfica destes padrões. Foram identificados três padrões BclI, denominados 1, 2 e 3 e quatro padrões TaqI, denominados A, B, C e D. Sete padrões compósitos, formados pela associação dos padrões das duas nucleases,foram identificados em amostras do Brasil. Quando dados anteriores de padrões de digestão da região intergênica COI-COII com a endonuclease DraI são considerados, 17 padrões foram verificados nestas amostras. Dentre as 90 amostras sequenciadas do Brasil, África do Sul, Quênia, Portugal, Espanha, Itália e Chile foram observados 35 haplótipos distintos que respondem por 13 diferentes sequências de aminoácidos. Nossos dados demonstraram que a simples associação entre padrões de restrição não se constituiu em meio seguro para se inferir a origem das linhagens mitocondriais em populações africanizadas, sendo mais indicado realizar subsequentemente o sequenciamento dos fragmentos que geraram estes padrões. Foi possível inferir a origem de 11 de 17 padrões associados COI-COII e COI encontrados no Brasil. Não foi observada distribuição clinal entre os padrões COI como o verificado em COI-COII. Os dados apontam claramente para substituições nucleotídicas e de aminoácidos exclusivas em amostras de origem européia e africanas/africanizadas, uma questão que merece uma pesquisa subsequente.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4443.pdf: 2299347 bytes, checksum: c1bbf7b5ca822d7515252d8efba8e8d3 (MD5) Previous issue date: 2012-05-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Pilosocereus machrisii is a columnar cacti with natural fragmented distribution; restrict to campos rupestres vegetation patches or rocky outcrops on the Cerrado domain; in Central and eastern Brazil. These features makes P. machrisii an appropriate biological model for population genetic studies aiming to gather information on population structure; since small and isolated populations are often vulnerable to genetic drift and high levels of inbreeding. Genetic diversity and population structure were assessed for ten microsatellite loci in 12 P. machrisii populations; covering the majority of the species distribution. Genetic diversity levels were relatively similar on sampled populations; except for Brotas-SP samples; that showed lower levels than those observed for other locations. Significant Hardy Weinberg Equilibrium departures were detected in eight different populations; for one or two loci. High levels of genetic differentiation and private alleles with elevated frequencies were detected; with total FST value of 0.357. The genetic structure of P. machrisii was analyzed with STRUCTURE and SAMOVA softwares; and populations were grouped in four main clusters; with secondary structure on two of these clusters. Significative levels of correlation between genetic and geographic distances were observed for the whole dataset; however; when the genetic groups were analyzed separately; no correlation was verified. Furthermore; the genetic relationship between the populations was observed with a principal coordinate analysis (PCA) and an UPGMA dendrogram. The genetic structure observed in P. machrisii suggests that historical factors caused populations fragmentation; with subsequent geographic isolation and high genetic differentiation between them. / Pilosocereus machrisii é um cacto colunar com distribuição naturalmente fragmentada no centro e leste do Brasil; restrito aos enclaves de vegetação de campos rupestres ou de afloramentos rochosos no domínio Cerrado. Essas características tornam a espécie um modelo biológico apropriado para a realização de estudos de estrutura populacional; uma vez que suas populações pequenas e isoladas podem estar altamente vulneráveis a efeitos de deriva genética e endogamia. Foram estimados os níveis de diversidade genética e estruturação populacional a partir de dez locos marcadores microssatélite em doze populações de ocorrência natural de P. machrisii; cobrindo a maior parte de sua distribuição. Os níveis de diversidade genética dentro das populações apresentaram resultados relativamente similares nas localidades amostradas; exceto pelas amostras do município de Brotas-SP; com índices menores que os observados em outras populações. Desvios significativos em relação às proporções do Equilíbrio de Hardy-Weinberg foram detectados para um ou dois locos em oito populações diferentes. Alelos privados em alta frequência foram detectados; assim como altos níveis de diferenciação genética; com um valor de FST total de 0;357. A estrutura genética das populações; verificada a partir da análise com os programas STRUCTURE e SAMOVA apresentou uma estruturação mais provável em quatro grupos principais e níveis secundários de estruturação dentro desses grupos. Níveis significativos de correlação entre as distâncias genéticas e geográficas entre pares de populações foram detectados para o conjunto total de dados; no entanto não houve correlação quando os agrupamentos genéticos foram analisados separadamente. Além disso; foi possível verificar as relações genéticas entre as diferentes populações a partir de uma análise de coordenadas principais (PCA) e de um dendrograma construído a partir do método UPGMA. A estrutura genética observada em P. machrisii aponta para um importante efeito de eventos históricos que causaram a fragmentação das populações; com posterior isolamento geográfico e aquisição de elevada diferenciação genética.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6279.pdf: 1318446 bytes, checksum: 3ea93c315d61578a7b50605db41ae915 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Among the sheep parasites, Haemonchus contortus is the most prevalent and pathogenic nematode in tropical areas, causing huge economic losses. Alterations in the gene encoding the membrane P-glycoprotein (PgP) have been associated with multidrug resistance. The goal of this study was to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) on the PgP gene in H. contortus by comparing two isolates with different status of anthelmintic resistance. For this purpose, two ewes were experimentally infected, one with a susceptible H. contortus isolate (McMaster, Australia) and the other with a multidrug-resistant isolate (Embrapa2010, Brazil). Feces from infected animals were submitted to coproculture in order to obtain larvae and, after the slaughter of the ewes, adults H. contortus were collected from abomasum and individually submitted to DNA extraction. For the evaluation of potential molecular markers of geographic isolation, larvae originating from coprocultures of two other Brazilian isolates (Bahia and Pernambuco), with no determined resistance status, were also submitted to DNA extraction. After PCR amplification of DNA extracted from adults H. contortus, a fragment of the PgP gene was sequenced and six SNPs (position described in relation to the sequence of contig 004690 from the Wellcome Trust Sanger Institute) were identified : 508 (A> G in exon), 580 (G> A), 601 (G> C), 800 (G> A), 845 (G> T), and 878 (G> T), the last five in introns. The Fisher's exact test, applying the Bonferroni correction, revealed a significant association (P<0.01) between 508, 580, 601, 845 and 878 SNPs and the state of resistance to anthelmintics. Among these SNPs, 601 and 878 are in linkage disequilibrium and form the CC haplotype associated (P < 0.05) to resistance and the GG haplotype associated to susceptibility. Considering that there is considerable genetic differentiation between different continental areas in H. contortus, the frequencies of the SNPs were compared between the Brazilian isolates and the susceptible Australian one. It was found that the SNPs 580 and 845 may be associated with geographic isolation. We conclude that the 508, 601 and 878 SNPs in the P-glycoprotein gene can be molecular markers for multiple resistance to anthelmintics, and that the 580 and 845 SNPs can be candidate markers of geographical isolation in H. contortus. We developed software for Risk Analysis Development of Parasitic Resistance to Anthelmintics in Sheep (SARA) which will provide information that may guide the rational use of anthelmintics. / Among the sheep parasites, Haemonchus contortus is the most prevalent and pathogenic nematode in tropical areas, causing huge economic losses. Alterations in the gene encoding the membrane P-glycoprotein (PgP) have been associated with multidrug resistance. The goal of this study was to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) on the PgP gene in H. contortus by comparing two isolates with different status of anthelmintic resistance. For this purpose, two ewes were experimentally infected, one with a susceptible H. contortus isolate (McMaster, Australia) and the other with a multidrug-resistant isolate (Embrapa2010, Brazil). Feces from infected animals were submitted to coproculture in order to obtain larvae and, after the slaughter of the ewes, adults H. contortus were collected from abomasum and individually submitted to DNA extraction. For the evaluation of potential molecular markers of geographic isolation, larvae originating from coprocultures of two other Brazilian isolates (Bahia and Pernambuco), with no determined resistance status, were also submitted to DNA extraction. After PCR amplification of DNA extracted from adults H. contortus, a fragment of the PgP gene was sequenced and six SNPs (position described in relation to the sequence of contig 004690 from the Wellcome Trust Sanger Institute) were identified : 508 (A> G in exon), 580 (G> A), 601 (G> C), 800 (G> A), 845 (G> T), and 878 (G> T), the last five in introns. The Fisher's exact test, applying the Bonferroni correction, revealed a significant association (P<0.01) between 508, 580, 601, 845 and 878 SNPs and the state of resistance to anthelmintics. Among these SNPs, 601 and 878 are in linkage disequilibrium and form the CC haplotype associated (P < 0.05) to resistance and the GG haplotype associated to susceptibility. Considering that there is considerable genetic differentiation between different continental areas in H. contortus, the frequencies of the SNPs were compared between the Brazilian isolates and the susceptible Australian one. It was found that the SNPs 580 and 845 may be associated with geographic isolation. We conclude that the 508, 601 and 878 SNPs in the P-glycoprotein gene can be molecular markers for multiple resistance to anthelmintics, and that the 580 and 845 SNPs can be candidate markers of geographical isolation in H. contortus. We developed software for Risk Analysis Development of Parasitic Resistance to Anthelmintics in Sheep (SARA) which will provide information that may guide the rational use of anthelmintics. / Entre os parasitas de ovinos, Haemonchus contortus é o nematoide mais prevalente e patogênico em áreas tropicais, causando grandes perdas econômicas. As alterações no gene que codifica a glicoproteína-P de membrana (PgP) foram associadas com a resistência a múltiplas drogas. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no gene PgP em H. contortus por comparação de dois isolados com diferentes status de resistência a anti-helmínticos. Para esse fim, uma ovelha foi infectada experimentalmente com o isolado suscetível (McMaster, Austrália) e outra ovelha com o isolado multirresistente (Embrapa2010, Brasil) de H. contortus. Fezes dos animais infectados foram submetidas à coprocultura para a obtenção de larvas e, após o abate das ovelhas, H. contortus adultos foram colhidos do abomaso e individualmente submetidos à extração de DNA. Para a avaliação de possíveis marcadores moleculares de isolamento geográfico, larvas oriundas de coprocultura de dois outros isolados brasileiros (Bahia e Pernambuco), com status de resistência não determinado, também foram submetidas à extração de DNA. Após amplificação por PCR do DNA extraído de H. contortus adultos, um fragmento do gene PgP foi sequenciado e foram identificados seis SNPs (posição descrita em relação à sequência do contig 004690 do Wellcome Trust Sanger Institute): 508 (A>G, em éxon), 580 (G>A), 601 (G>C), 800 (G>A), 845 (G>T) e 878 (G>T), os cinco últimos em íntrons. O teste exato de Fisher, por meio da correção de Bonferroni, revelou associação significativa (P<0,01) entre os SNPs 508, 580, 601, 845 e 878 e o estado de resistência a anti-helmínticos. Desses SNPs, o 601 e o 878 estão em desequilíbrio de ligação e formam os haplótipos CC, que está associado (P<0,05) à resistência, e GG, à suscetibilidade. Levando em consideração que em H. contortus há considerável diferenciação genética entre áreas continentais distintas, as frequências dos SNPs foram comparadas entre os isolados brasileiros e o isolado suscetível australiano e foi verificado que os SNPs 580 e 845 podem estar associados ao isolamento geográfico. Conclui-se que os SNPs 508, 601 e 878 no gene de glicoproteína-P podem ser marcadores moleculares para a resistência múltipla a anti-helmínticos, e os SNPs 580 e 845 candidatos a marcadores de isolamento geográfico em H. contortus. Nós desenvolvemos um software para Análise de Risco de Desenvolvimento de Resistência Parasitária a Anti- Helmínticos em Ovinos (SARA) que fornecerá informações que poderão orientar a utilização racional de anti-helmínticos. / Entre os parasitas de ovinos, Haemonchus contortus é o nematoide mais prevalente e patogênico em áreas tropicais, causando grandes perdas econômicas. As alterações no gene que codifica a glicoproteína-P de membrana (PgP) foram associadas com a resistência a múltiplas drogas. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no gene PgP em H. contortus por comparação de dois isolados com diferentes status de resistência a anti-helmínticos. Para esse fim, uma ovelha foi infectada experimentalmente com o isolado suscetível (McMaster, Austrália) e outra ovelha com o isolado multirresistente (Embrapa2010, Brasil) de H. contortus. Fezes dos animais infectados foram submetidas à coprocultura para a obtenção de larvas e, após o abate das ovelhas, H. contortus adultos foram colhidos do abomaso e individualmente submetidos à extração de DNA. Para a avaliação de possíveis marcadores moleculares de isolamento geográfico, larvas oriundas de coprocultura de dois outros isolados brasileiros (Bahia e Pernambuco), com status de resistência não determinado, também foram submetidas à extração de DNA. Após amplificação por PCR do DNA extraído de H. contortus adultos, um fragmento do gene PgP foi sequenciado e foram identificados seis SNPs (posição descrita em relação à sequência do contig 004690 do Wellcome Trust Sanger Institute): 508 (A>G, em éxon), 580 (G>A), 601 (G>C), 800 (G>A), 845 (G>T) e 878 (G>T), os cinco últimos em íntrons. O teste exato de Fisher, por meio da correção de Bonferroni, revelou associação significativa (P<0,01) entre os SNPs 508, 580, 601, 845 e 878 e o estado de resistência a anti-helmínticos. Desses SNPs, o 601 e o 878 estão em desequilíbrio de ligação e formam os haplótipos CC, que está associado (P<0,05) à resistência, e GG, à suscetibilidade. Levando em consideração que em H. contortus há considerável diferenciação genética entre áreas continentais distintas, as frequências dos SNPs foram comparadas entre os isolados brasileiros e o isolado suscetível australiano e foi verificado que os SNPs 580 e 845 podem estar associados ao isolamento geográfico. Conclui-se que os SNPs 508, 601 e 878 no gene de glicoproteína-P podem ser marcadores moleculares para a resistência múltipla a anti-helmínticos, e os SNPs 580 e 845 candidatos a marcadores de isolamento geográfico em H. contortus. Nós desenvolvemos um software para Análise de Risco de Desenvolvimento de Resistência Parasitária a Anti- Helmínticos em Ovinos (SARA) que fornecerá informações que poderão orientar a utilização racional de anti-helmínticos.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2016-10-04T12:02:05Z No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-04T17:30:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-04T17:30:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T17:47:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / We studied patterns of gene expression in two closely related species of fruit flies of the genus Anastrepha (Diptera: Tephritidea), A. fraterculus and A. obliqua, with the goal of finding candidate genes related to the recent differentiation process between these species. In order to do this, we used the Next-generation sequencing (NGS) with RNA-Seq methodology in head tissues of the two species of flies at different stages of the reproductive life for both sexes. After processing and removal of low quality reads we retained over 140 million paired-end reads. These sequences were assembled into individual transcriptomes for each species and a pooled transcriptome, with 154,787 contigs, representing both species. Based on the results of the assemblies, annotation and mapping we prepared two separate manuscripts, one describing the libraries for each species and a combined analysis and a second that investigate the contigs involved with species differences and their patterns of expression. These data reveal 1991 genes with differential expression in at least one comparison among different reproductive stages. It is noteworthy that we observed twice as many genes with differential expression when contrasting males than with females. Several of these genes were associated to odour, such as Odorant Binding proteins and visgum, suggesting that behavioral changes in food sources, mating choice, or breeding and oviposition sites might be involved with species differences.We also identified two large sets of genes that are differentially expressed between the species, one being underexpressed in A. obliqua and overexpressed in A. fraterculus and the other that had a reverse pattern. We used a differentiation index of SNPs per contig () and pairwise tests of positive selection between the sequences, and analysis of the substitution amino acid type caused by SNPs to identify 7 genes there are candidates to be related to the speciation process between A. fraterculus and A. obliqua. / Investigamos os padrões de expressão gênica em tecidos cefálicos de duas espécies de moscas-das- frutas do gênero Anastrepha (Diptera: Tephritidea), A. fraterculus e A. obliqua, proximamente relacionadas, identificando SNPs com alto grau de diferenciação entre as espécies e realizando análises evolutivas com o objetivo de encontrar genes candidatos relacionados ao recente processo de separação dessas espécies. Para isso, utilizamos as novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (NGS) com a metodologia de RNA-Seq em tecidos cefálicos das duas espécies de moscas em diferentes fases da vida reprodutiva dos dois sexos. Após processamento e retirada das sequências com baixa qualidade utilizamos mais de 140 milhões de sequências paired-end para montarmos um transcriptoma conjunto das espécies, com mais de 154 mil contigs, e outros dois separados por espécie. Estes resultados estão apresentados em dois manuscritos distintos, um primeiro que descreve as bibliotecas produzidas para as diferentes espécies e um segundo que investiga padrões de expressão e genes envolvidos na diferenciação das espécies. Estes dados revelaram 1991 genes com expressão diferencial em pelo menos uma comparação de fase de vida reprodutiva entre as espécies, sendo que encontramos duas vezes mais genes com diferença na expressão entre as espécies em machos do que em fêmeas. Diversos destes genes foram associados a genes relacionados ao olfato, como a família gênica das Obps (odorant-binding protein) e o gene visgun, o que pode indicar uma mudança comportamental na preferência por alimento, parceiros ou sítios para cópula e oviposição. Encontramos também dois conjuntos de genes que são diferencialmente expressos entre as espécies, sendo um conjunto super-expresso em A. obliqua e sub-expresso em A. fraterculus e outro conjunto com um padrão revertido. Análises de padrão de seleção nestes genes sugerem sete que apresentam indícios de seleção positiva e ao menos um SNP com altos índices de diferenciação entre as espécies.