A epilepsia, doença descrita pela primeira vez em 2000 a.C., tem a crise convulsiva ou epiléptica como fenômeno paroxístico, e a International League Against Epilepsy define a crise epiléptica como \"manifestação excessiva e/ou hipersincrônica, normalmente autolimitada, da atividade dos neurônios no cérebro\". Há 40 anos surgiram os medicamentos antiepilépticos, mas a resistência múltipla a fármacos antiepilépticos (FAEs) é um problema significante que afeta pelo menos 30% dos pacientes portadores dessa doença devastadora. O mecanismo exato da fármaco-resistência desenvolvida em pacientes epilépticos ainda é desconhecido, porém uma possível causa seria a inadequada acumulação intraparenquimal do fármaco antiepiléptico relacionada a expressão aumentada da glicoproteína-P (PgP). Neste contexto, nosso objetivo foi investigar a correlação da expressão da PgP, codificada pelo gene ABCB1, no córtex temporal de 12 pacientes fármaco-resistentes frente aos FAEs fenobarbital, carbamazepina, fenitoína e lamotrigina; comparamos também a expressão da PgP nesse mesmo grupo de pacientes, selecionados no Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) frente a um grupo controle composto por indivíduos não epilépticos que evoluíram para óbito examinados no Serviço de Verificação de Óbito do interior (SVOi). Utilizamos a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para determinar as concentrações dos FAEs no plasma e no cérebro, sendo que a metodologia utilizada no tecido cerebral foi desenvolvida e validada especialmente para esse fim. Essas concentrações foram então determinadas e a razão entre as duas medidas foi comparada com a expressão de PgP no tecido cerebral. Analisando os resultados concluímos que não há correlação linear entre a razão dos fármacos estudados e a expressão de PgP no córtex temporal de pacientes com epilepsia refratária. / Epilepsy, desease described for the first time in 2000 B.C., presents the convulsion or epileptic seizure as its paroxysmal event, and the International League Against Epilepsy defines the epileptic seizure as \"excessive and/or hypersynchronous manifestation, usually self-limiting, from brain neurons activity\". Forty years ago the antiepileptic drugs (AEDs) emerged, but multiple resistance to AEDs is a significant problem which affects at least 30% of epileptic patients. The mechanism underlaying pharmacoresistance is still unknown, but a possible cause is the inadequate accumulation of AEDs in the brain tissue related to P-glycoprotein over expression. In this context, our aim was to investigate the correlation between PgP expression, codified by ABCB1 gene, in temporal cortex of 12 pharmacoresistant patients towards AEDs phenobarbital, carbamazepine, phenytoin and lamotrigine; we also compared PgP expression between the same group of patients, selected inside Epilepsy Surgery Center (CIREP), and a control group composed by non-epileptic deceased individuals examined at the Death Verification Service from our Medicine School (SVOi). We used High Performance Liquid Chromatography to determine AEDs concentrations in plasma and brain, and the methodology applied to brain quantification was specially developed for this purpose. These two concentrations were then determined and the ratio between them was compared with PgP expression in brain tissue. Analyzing the results we concluded that there is no linear correlation between the ratio of the AEDs studied and PgP expression in temporal cortex of patients with pharmacoresistant epilepsy.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_campos_ioc_dout_2014.pdf: 1838588 bytes, checksum: ec217383fd2574c1a377fc8a97dc5507 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os tratamentos disponíveis para a doença de Chagas e as leishmanioses não são eficientes e apresentam alta toxicidade. Diversos estudos mostram que há possibilidade de indução de resistência de Trypanosoma cruzi ao Benznidazol (BZ) o que pode interferir na eficácia do tratamento. O mesmo tem sido relatado com relação aos fármacos utilizados para o tratamento das leishmanioses, embora não exista um mecanismo de ação definido para a resistência a drogas nestes protozoários. Neste trabalho foram focalizados dois potenciais mecanismos: 1) atividade da glicoproteína-P (Pgp), uma proteína de membrana que atua como uma bomba de efluxo dependente de energia e associada ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR); 2) a enzima nitrorredutase presente em T. cruzi (TcNTR), reponsável pela redução de nitroderivados, como BZ, para obter o efeito tripanocida. Na busca de novos compostos seletivos contra T. cruzi e Leishmania amazonensis, nosso grupo vem estudando derivados da classe das tiossemicarbazonas. Em estudos prévios foi observado que o derivado 4-N-(2-metoxi-estiril)-tiossemicarbazona (2-MEOTIO) foi o composto mais efetivo sobre diferentes formas de T. cruzi, enquanto 4-N-(4\2019-hidroxi-3\2019-metoxi-estiril)-tiossemicarbazona (3-MEOTIO) se mostrou o mais eficiente contra L. amazonensis O mecanismo de resistência a estes compostos foi avaliado, e nossos resultados mostram a participação da Pgp na resistência a 2-MEOTIO e BZ em T. cruzi, e a 3-MEOTIO em L. amazonensis. Ainda, em T. cruzi a participação da Pgp parece estar associada não somente à membrana plasmática, como também à mitocôndria. Em T. cruzi, a perda da função do gene da TcNTR está relacionada à resistência ao BZ, no entanto, foi possível demonstrar que outros mecanismos de resistência estão atuando em conjunto nestes parasitos, e ainda, que os mecanismos são diferentes entre clones isolados de uma mesma população (B15). Também descrevemos nesta tese, a validação in vitro da expressão da luciferase em diferentes cepas de T. cruzi transfectadas com o gene red-shifted-luciferase, a serem utilizadas em futuros ensaios de imagem por bioluminescência in vivo. Os mecanismos de resistência a drogas em T. cruzi e L. amazonensis apresentados neste trabalho podem contribuir para a identificação de novos alvos nestes tripanosomatídeos, objetivando o desenho racional de novas drogas para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses / The available drugs for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis are not efficient and cause toxic side effects. Several studies show the possibil ity of drug resistance induction to Benznidazol (BZ) in T rypanosoma cruzi, which may interfere with the treatment efficacy . The same has been observed regarding compounds used to treat leishmaniasis, although more studies on drug resistance mechanism are n eed ed . In the present study we focused on two potential drug resistance mechanisms: 1) P - glycoprotein (Pgp) activity, a membrane protein which acts as an efflux pump energy - dependent and is associated with the multidrug resistance fenotype (MDR); 2) the en zyme nitroreductase (TcNTR) found in T. cruzi, which is responsible for the reduction of nitroheterocyclic derivatives, such as Bz and Nifurtimox, generating metabolites with trypanocidal activity . In the search for new selective drugs for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis, our group has been studying compounds from the class of the thiosemicarbazone s . Previous studies showed that the 4 - N - (2 - methoxy - styryl) - thiosemicarbazone (2 - MEOTIO) was the most efficient compound on different forms of T. cruzi, whereas 4 - N - (4’ - hidroxy - 3’ - methoxy styryl) - thiosemicarbazone ( 3 - MEOTIO ) was the most active on Leishmania amazonensis . Here we evaluated the drug resistance mechanism to both thiosemicarbazone derivatives, as well as, to BZ which was used as r eference drug for T. cruzi . Our results show the participation of P gp in the resistance to both 2 - MEOTIO and BZ in T. cruzi, as well as in the resistance in L. amazonensis to the compound 3 - MEOTIO . Interestingly, in T. cruzi the participation of Pg p is related to its localization not only in the plasma membrane but also in the mithocondri on . In addition, in T. cruzi , the loss of the TcNTR gene function is involved in BZ - resistance , however i t was also shown that other mechanisms of drug resistan ce a re also involved and that that these mechanisms may be different even among clones obtained from a single population (B15). We also described here the in vitro validation of the expression of luciferase in different T. cruzi strains transfectaded with the red - shifted - luciferase gene , which wil l be further used in bioluminescence imaging assays in vivo . The drug resistance mechanisms in T. cruzi and L. amazonensis shown here may be useful in the identification of parasite targets, aiming the rational design of new drugs to treat for Chagas disease and leishmaniasis

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ivan_junior_ipec_dout_2013.pdf: 1028310 bytes, checksum: dff45af1d04ca95b16081c45df029842 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O regime de tratamento com múltiplas drogas é correspondente a uma interação de drogas que pode causar efeitos adversos e falha no tratamento. Essa interação pode gerar modificações funcionais dos transportadores de membrana e por consequência a biodisponibilidade das drogas durante o tratamento. Dentre os transportadores de drogas transmembranares está a glicoproteína-P (P-gp), uma proteína de 170KD, produto do gene MDR1, caracterizada como uma \201CATP Binding cassete\201D (ABC). Seu papel está muito bem definido nas células neoplásicas multirresistentes a drogas, assim como sua relação com as drogas para o tratamento da infecção pelo HIV. Entretanto, pouco tem sido estudado sobre esta bomba de efluxo na tuberculose multirresistente (TBMR). Neste estudo analisamos por citometria de fluxo sua expressão e atividade de efluxo nos monócitos, principal célula relacionada com a tuberculose e também em linfócitos e granulócitos do sangue periférico por meio da citometria de fluxo. A taxa de efluxo foi medida através do uso da Rodamina 123 (Rho123) e a expressão da P-gp através do anticorpo monoclonal anti-CD243 (clone UIC2). A utilização direta do sangue total para a determinação da atividade de efluxo por citometria de fluxo caracterizou a implantação de uma nova ferramenta de análise para a pesquisa A análise contemplou 52% do total de pacientes em tratamento de TBMR no ambulatório do Laboratório de Pesquisa em Micobacterioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Para as análises foram levadas em consideração a idade, cor da pele, o tempo de tratamento e a quantidade de drogas administradas. O estudo revelou que há correlação entre a expressão da P-gp nos monócitos e a idade dos pacientes (P<0,01). Diferenças entre pacientes brancos e não brancos também foram observadas. Em linfócitos a expressão de P-gp quando aumentada foi diretamente proporcional à atividade de efluxo observada nos monócitos (P< 0,05). Além disso, pacientes submetidos ao tratamento para TBMR por até seis meses apresentaram uma maior expressão de P-gp e, linfócitos quando comparados àqueles que receberam o tratamento por mais de seis meses (P<0,01) / When two or more drugs are administrated, such interactions can cause additive, synergistic or antagonistic effects. The drug transporters may undergo treatments effects and therefore change the dr ugs bioavailability during the treatment and can cause treatment failure. Among the know n drug transporters there is transmembrane P - glycoprotein (P - gp). It is a 170 KDa transmem brane protein w h ich is a product of multidrug resistance MDR1 gene. This protein is a well - characterized ABC transporter ( ATP Binding Cassette ) and is responsible for efflux of the chemotherapeutic agents from resistant cancer cells. There are few studies about this protein in multidrug - resistant tuberculosis (MDR - TB) . In this study, P - gp expression and activity were detect by flow cytometry in monocytes, the main cell related with the M.tuberculosis infection , as well as in lymphocytes and granulocytes from whole peripheral blood . P - gp mediated efflux was determined indirectly by measuring the retention of a fluorescent P - gp substrate, rhodamine 123 ( Rho123) . P - gp expression was assessed using anti - P - gp monoclonal antibody UIC2 (CD243 ). The efflux activ ity with whole blood using flow cytometry technique as a new tool to pharmacogenetic research was developed in this study. We analyzed 52 % of outpatient in MDR - TB treatment from Laboratory Research Mycobacteriosis Institute Evandro Chagas Clinical Researc h (IPEC). We considered variables as age, race, treatment time, amount of drug administered at the time of blood collection and their correlation with P - gp expression and activity. The result revealed a correlation between the P - gp expression in monocytes and ag e ( P < 0 .01). In addition, difference between white and nonwhite patients was observed . Lymphocyte P - gp expression was statistically significant greater in patients w ith increased monocytes efflux activity evidenced by P - gp inhibition with CSA ( P < 0 .0 5 ). P atients undergoing MDR - TB treatment for six months had a higher P - gp expression in lymphocytes compared to those who received the treatment for more than six months ( P < 0 .01).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-21Bitstream added on 2014-06-13T18:51:20Z : No. of bitstreams: 1 calado_amc_me_jabo.pdf: 1098325 bytes, checksum: e69e94e5c8654a5cdbae32a66649fbe3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença sistêmica e imunomediada. É provocada pelo protozoário da espécie Leishmania (L.) chagasi, que é transmitido ao homem e aos animais através da picada do vetor infectado, o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. Até o momento não há tratamento que leve a cura parasitológica dos cães e o arsenal de fármacos leishmanicidas é limitado. A resistência aos medicamentos constitui um impedimento importante para o controle de enfermidades e a manifestação de resistência a vários medicamentos é conhecida como MDR (“multidrug resistance”). Um desses mecanismos de resistência a múltiplas drogas é o aumento da expressão da glicoproteína-P (gp-P), um sistema de efluxo de xenobióticos codificadas pelo gene MDR1. Na presente pesquisa, buscou-se avaliar a possibilidade do fenômeno de resistência a múltiplas drogas em cães naturalmente parasitados por Leishmania (L.) chagasi . Foram objetivos do estudo avaliar a expressão da glicoproteína-P (gp-P) e da proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) por meio da imuno-histoquímica, em amostras fígado, adrenais, rins, baço e pele de cães portadores da LV. Os resultados mostraram que o fígado, rins e adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais gp-P do que a pele e o baço; também que as adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele e o baço e que este ultimo expressa significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele. Quando se comparou os dois anticorpos verificou-se que o fígado, rins e adrenais expressam porcentagens semelhantes de células imunomarcadas e que o MRP é significativamente (p<0,01) mais reativo na pele que a gp-P. Esses resultados poderiam justificar a redução da carga parasitária na pele que se acompanha durante o tratamento. Todavia, a não obtenção da cura parasitológica poderia ser devido a alta expressão... / Canine visceral leishmaniasis (LVC) is a systemic immunomediated disease. It is caused by the protozoary from the Leishmania (L.) chagasi species, wich is transmitted to man and animals through the infected vector bite, the phlebotomine sand fly Lutzomyia longipalpis. Until present, there is no treatment leading to a parasitologic cure for dogs and the leishmanicide medicine arsenal is limited. Drug resistance is one of the important impediments for infirmity control and the resistance manifestation to multiple drugs is known as MDR. One of those multiple drugs resistance mechanisms is the increase of the glycoprotein-P (gp-P) expression, a xenobiotic efflux system encoded by the MDR1 gene. At the present research, it aimed to evaluate the possibility of resistance phenomenon the multiple drugs in dogs naturally parasited by Leishmania (L.) chagasi. The objectives of this study was to evaluate glycoprotein-P (gp-P) and multiple drugs resistance protein (MRP) immunohistochemical expressions in LVC infected dogs’ liver, adrenals, kidneys, spleen and skin samples. Results showed that liver, kidneys and adrenals express significantly (p<0,001) more gp-P than skin and spleen; also, adrenals express significantly (p<0,001) more MRP than skin and spleen and that spleen express significantly (p<0,001) more MRP than skin. When the two antibodies were compared, it was verified that liver, kidneys and adrenals express similar percentages of immunomarked cells and that MRP is significantly more reactive in skin than gp-P. These results could justify the parasitary load reduction in skin during treatment. Nevertheless, the lack of parasitologic cure could be due to the high pg-P and MRP1 expressions in liver, adrenals and kidneys, which could increase the pharmac efflux at these organs

A epilepsia, doença descrita pela primeira vez em 2000 a.C., tem a crise convulsiva ou epiléptica como fenômeno paroxístico, e a International League Against Epilepsy define a crise epiléptica como \"manifestação excessiva e/ou hipersincrônica, normalmente autolimitada, da atividade dos neurônios no cérebro\". Há 40 anos surgiram os medicamentos antiepilépticos, mas a resistência múltipla a fármacos antiepilépticos (FAEs) é um problema significante que afeta pelo menos 30% dos pacientes portadores dessa doença devastadora. O mecanismo exato da fármaco-resistência desenvolvida em pacientes epilépticos ainda é desconhecido, porém uma possível causa seria a inadequada acumulação intraparenquimal do fármaco antiepiléptico relacionada a expressão aumentada da glicoproteína-P (PgP). Neste contexto, nosso objetivo foi investigar a correlação da expressão da PgP, codificada pelo gene ABCB1, no córtex temporal de 12 pacientes fármaco-resistentes frente aos FAEs fenobarbital, carbamazepina, fenitoína e lamotrigina; comparamos também a expressão da PgP nesse mesmo grupo de pacientes, selecionados no Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) frente a um grupo controle composto por indivíduos não epilépticos que evoluíram para óbito examinados no Serviço de Verificação de Óbito do interior (SVOi). Utilizamos a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para determinar as concentrações dos FAEs no plasma e no cérebro, sendo que a metodologia utilizada no tecido cerebral foi desenvolvida e validada especialmente para esse fim. Essas concentrações foram então determinadas e a razão entre as duas medidas foi comparada com a expressão de PgP no tecido cerebral. Analisando os resultados concluímos que não há correlação linear entre a razão dos fármacos estudados e a expressão de PgP no córtex temporal de pacientes com epilepsia refratária. / Epilepsy, desease described for the first time in 2000 B.C., presents the convulsion or epileptic seizure as its paroxysmal event, and the International League Against Epilepsy defines the epileptic seizure as \"excessive and/or hypersynchronous manifestation, usually self-limiting, from brain neurons activity\". Forty years ago the antiepileptic drugs (AEDs) emerged, but multiple resistance to AEDs is a significant problem which affects at least 30% of epileptic patients. The mechanism underlaying pharmacoresistance is still unknown, but a possible cause is the inadequate accumulation of AEDs in the brain tissue related to P-glycoprotein over expression. In this context, our aim was to investigate the correlation between PgP expression, codified by ABCB1 gene, in temporal cortex of 12 pharmacoresistant patients towards AEDs phenobarbital, carbamazepine, phenytoin and lamotrigine; we also compared PgP expression between the same group of patients, selected inside Epilepsy Surgery Center (CIREP), and a control group composed by non-epileptic deceased individuals examined at the Death Verification Service from our Medicine School (SVOi). We used High Performance Liquid Chromatography to determine AEDs concentrations in plasma and brain, and the methodology applied to brain quantification was specially developed for this purpose. These two concentrations were then determined and the ratio between them was compared with PgP expression in brain tissue. Analyzing the results we concluded that there is no linear correlation between the ratio of the AEDs studied and PgP expression in temporal cortex of patients with pharmacoresistant epilepsy.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8642_1.pdf: 943630 bytes, checksum: 0ef6a23c109d1b1904490d5d9a625d24 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alterações na atividade da glicoproteína-P (gp-P) resultantes da exposição individual à radiação ionizante podem ser cruciais para a eficácia de tratamentos que empregam radioterapia antes da quimioterapia. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para avaliar o efeito da radiação ionizante na atividade da gp-P. Amostras de sangue periférico de cinco indivíduos sadios foram irradiadas in vitro, separadamente, a partir de uma fonte de cobalto-60, de sorte a receber doses de 0,5 e 2,0 Gy, sendo mantida uma amostra não-irradiada como controle. A atividade da gp-P foi analisada nos linfócitos T CD4 e CD8 através do ensaio de efluxo da rodamina 123 utilizando citometria de fluxo (total 60 leituras), com resultados em porcentagem e índice médio de fluorescência. A comparação da atividade média da gp-P entre os grupos de amostras controle e irradiadas indicou não haver influência da irradiação na atividade da gp-P nos linfócitos T. Entretanto, numa avaliação indivíduo por indivíduo, observou-se mudanças na funcionalidade da gp-P em amostras irradiadas, para alguns casos e doses absorvidas. A análise simultânea dos parâmetros de porcentagem e índice médio de fluorescência mostrou-se fundamental na intercomparação das amostras irradiadas e controle de cada doador. Como base nos resultados obtidos, o protocolo proposto foi considerado adequado para análise da atividade da gp-P após estresse radioativo, configurando-se num importante fator prognóstico à adequação de tratamento pacienteespecífico, em particular para indivíduos suspeitos de apresentarem resistência radioinduzida a múltiplas drogas

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Para fármacos administrados por via oral, o controle da extensão e da velocidade de absorção depende basicamente de duas importantes etapas: solubilidade do fármaco nos líquidos fisiológicos e sua permeabilidade através das membranas biológicas. Assim, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) foi proposto como uma ferramenta para o desenvolvimento de novos fármacos, de novas formulações e para auxiliar nos processos de bioisenção. No entanto, outro fator relacionado à biodisponibilidade e que deve ser considerado nos estudos biofarmacêuticos é o metabolismo. Desta forma, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica de Distribuição de Fármacos (SCBDF) foi proposto com a finalidade de classificar os fármacos de acordo com suas características de solubilidade e de metabolismo de modo que seja possível avaliar e predizer o comportamento do fármaco in vivo. O metabolismo tem sido amplamente investigado, sobretudo as enzimas do citocromo P450, as quais estão presentes também nos enterócitos. Além disso, o SCBDF oferece um suporte quanto à avaliação dos mecanismos de permeabilidade envolvidos nos processos de absorção, interações fármaco-fármaco e interações fármaco-alimento. Assim, o presente trabalho teve como objetivo elucidar os mecanismos envolvidos na permeabilidade de fármacos antirretrovirais por meio dos modelos ex vivo (câmaras de difusão vertical tipo Franz) e in vitro (PAMPA, MDCK-MDR1 e microssomas) considerando os aspectos relacionados ao metabolismo intestinal e ao efluxo destes fármacos. Dada a importância da utilização de fármacos antirretrovirais na terapia medicamentosa contra a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e que estes medicamentos são normalmente administrados cronicamente, a compreensão dos mecanismos envolvidos na permeabilidade é de suma importância, uma vez que estes não estão totalmente esclarecidos e poucas informações são encontradas na literatura. Além disso, a biodisponibilidade de fármacos como estavudina, lamivudina e zidovudina indica variação na permeabilidade, necessitando de uma investigação científica mais aprofundada dos processos absortivos. Assim, segmentos de jejuno provenientes de ratos machos Wistar foram utilizados para a avaliação da permeabilidade intestinal dos referidos antirretrovirais considerando a avaliação de efluxo pela glicoproteína-P e o metabolismo intestinal pela CYP3A. De maneira complementar, estudos in vitro com o emprego de membranas artificiais paralelas (PAMPA) e culturas celulares de MDCK-MDR1 foram realizados com a finalidade de auxiliar na elucidação dos mecanismos de permeabilidade dos fármacos antirretrovirais. Além disso, a avaliação do metabolismo dos referidos fármacos foi realizada com o emprego de microssomas a fim de verificar se tais substâncias são substratos de enzimas da família CYP3A e, assim, verificar o impacto do metabolismo intestinal na absorção. Os resultados de permeabilidade obtidos em PAMPA foram: 0,74±0,11 x 10-6 cm/s para a estavudina, 0,25±0,12 x 10-6 cm/s para a lamivudina e 1,14±0,25 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Já no modelo ex vivo com o emprego de câmaras de difusão vertical tipo Franz, os resultados foram: 1,56±0,32 x 10-5 cm/s para a estavudina, 1,26±0,27 x 10-5 cm/s para a lamivudina e 2,54±0,49 x 10-5 cm/s para a zidovudina. Portanto, com base nos resultados obtidos a partir dos dois métodos empregados, sugere-se que 30 outro mecanismo de transporte que não envolva a permeabilidade por difusão transcelular passiva possa estar relacionado à permeabilidade dos fármacos antirretrovirais. Com relação aos estudos de efluxo, os resultados obtidos a partir dos experimentos realizados em câmaras de difusão vertical tipo Franz demonstraram o aumento significativo da permeabilidade dos três antirretrovirais quando o inibidor de P-gp foi empregado, sendo: de 15,6 x 10-6 para 42,5 x 10-6 cm/s para a estavudina, de 12,6 x 10-6 para 37,5 x 10-6 cm/s para a lamivudina e de 25,4 x 10-6 para 56,6 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Em culturas celulares MDCK-MDR1, os resultados de permeabilidade foram utilizados para a obtenção das razões entre as direções B&#8594;A e A&#8594;B. Os valores de Papp na condição inibida para os fármacos estudados apresentaram razão menor do que 1. Já a razão B&#8594;A/A&#8594;B para cada fármaco nos ensaios sem inibidor apresentou-se igual ou maior que 2, evidenciando a interação fármaco-transportador. Com base nisso, o modelo ex vivo com o emprego de segmentos intestinais em câmaras de difusão vertical tipo Franz apresentou-se adequado na avaliação do mecanismo de efluxo dos fármacos antirretrovirais, o que foi confirmado com os estudos realizados em MDCK-MDR1. Assim, os fármacos antirretrovirais estudados apresentaram interação significativa com a P-gp. Em relação aos estudos de metabolismo realizados em câmaras de difusão vertical tipo Franz, os resultados demonstraram grande variação na permeabilidade dos três antirretrovirais quando o inibidor de CYP3A foi empregado, sendo: de 15,6 x 10-6 para 23,5 x 10-6 cm/s para a estavudina, de 12,6 x 10-6 para 27,3 x 10-6 cm/s para a lamivudina e de 25,4 x 10-6 para 40,5 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Já no modelo que emprega microssomas, os resultados de metabolização na ausência e na presença de inibidor de CYP3A foram: de 16,56% para 19,79% para a estavudina, de 14,56% para 15,55% para a lamivudina e de 17,85% para 16,48% para a zidovudina. Com base nisso, sugerese o emprego de microssomas para a determinação de metabolismo, uma vez que o método ex vivo empregado demonstrou grande variação entre os valores obtidos. Desta forma, observou-se que, para cada fármaco, não houve influência significativa no metabolismo pré-sistêmico relacionado às enzimas do complexo CYP3A, o que indica que a absorção oral das referidas substâncias não é limitada por tais enzimas. Portanto, a utilização dos diferentes métodos empregados no desenvolvimento do presente trabalho permitiu compreender os mecanismos envolvidos no transporte dos fármacos antirretrovirais, o que se torna de grande relevância nas etapas de desenvolvimento farmacêutico de novas moléculas e na compreensão de eventos clínicos ainda não esclarecidos atualmente. / For orally administered drugs, control of the extent and rate of absorption depends on two important steps: solubility of the drug in physiological liquids and their permeability across biological membranes. Thus, the Biopharmaceutics Classification System (BCS) has been proposed as a tool for the development of new drugs, new formulations and aid in the biowaiver processes. However, another factor related to bioavailability that should be considered in biopharmaceutic studies is the metabolism. Thus, the Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System (BDDCS) has been proposed for drug classification according to their solubility and metabolism characteristics, so it is possible to evaluate and predict the in vivo behavior of a compound. Metabolism has been extensively investigated, especially cytochrome P450 enzymes, which are also expressed in enterocytes. Besides, BDDCS provides support in evaluating the permeability mechanisms involved in the absorption processes, drug-drug interactions and drug-food interactions. Thus, the present study aimed to evaluate the mechanisms of permeability of antiretroviral drugs through the ex vivo (Franz cells) and in vitro (PAMPA, MDCK-MDR1 and microsomes) models considering aspects related to the intestinal metabolism and efflux of these drugs. Given the importance of the use of antiretroviral drugs in drug therapy against Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) and that these drugs are usually administered in a long-term way, understanding the mechanisms involved in the permeability is of a great importance, since they are not totally elucidated and no information is found in the literature. In addition, drugs as stavudine, lamivudine and zidovudine indicate variation in the permeability, which require further scientific investigation of absorptive processes. Thus, jejunum segments from rats were used to evaluate the intestinal permeability of these antiretroviral drugs, considering the evaluation of efflux by P-glycoprotein and intestinal metabolism by CYP3A. In a complementary manner, in vitro studies using parallel artificial membranes (PAMPA) and cell cultures MDCK-MDR1 were performed to aid in the elucidation of the permeability mechanisms of antiretroviral drugs. Also, the evaluation of the metabolism was carried out using microsomes to verify if such substances are substrates of CYP3A, and verify the impact of the intestinal metabolism in the absorption. The permeability results obtained in PAMPA were: 0.74±0.11x10-6 cm/s for stavudine, 0.25±0.12x10-6 cm/s for lamivudine and 1.14±0.25x10-6 cm/s for zidovudine. In ex vivo method using the intestinal segments in Franz cells, the results were: 1.56±0.32x10-5 cm/s for stavudine, 1.26±0.27x10-5 cm/s for lamivudine and 2.54±0.49x10-5 cm/s for zidovudine. Thus, based on the results obtained from these two methods, it is suggested that the antiretroviral drugs present other transport mechanism that is different from transcellular passive diffusion. For efflux studies, results obtained from experiments performed in Franz cells shown the increase of the permeability of the three antiretroviral drugs when the P-gp inhibitor was used: from 15.6x10-6 to 42,5x10-6 cm/s for stavudine, from 12.6x10-6 cm/s to 37.5x10-6 cm/s for lamivudine, and 25.4x10-6 to 56.6x10-6 cm/s for zidovudine. In MDCK-MDR1, the permeability results were used for obtaining ratio values between the directions B&#8594;A and A&#8594;B. The Papp values obtained with 33 inhibitor shown a ratio less than 1. For ratio B&#8594;A/A&#8594;B for each drug in experiments without inhibitor, the values obtained was equal or greater than 2, which shows the interaction between drug and transporter. Based on that, the ex vivo model using intestinal segments in Franz cells seems to be adequate for evaluation of efflux mechanism of antiretroviral drugs, which was confirmed by MDCK-MDR1 studies. Thus, the antiretroviral drugs presented interaction with P-gp. For metabolism studies in intestinal segments in Franz cells, a wide range of standard deviation was observed for the three antiretroviral drugs when the CYP3A inhibitor was used: from 15.6x10-6 cm/s to 23.5x10-6 cm/s for stavudine, from 12.6x10-6 cm/s to 27.3x10-6 cm/s for lamivudine, and from 25.4x10-6 cm/s to 40.5x10-6 cm/s for zidovudine. In experiments in microsomes, the results of metabolization in the absence and presence of CYP3A inhibitor were: from 16.56 to 19.79% for stavudine, from 14.56 to 15.55% for lamivudine and from 17.85 to 16.48% for zidovudine. Based on that, it is suggested the use of microsomes for metabolism evaluation, since the ex vivo method presented high variability between the results obtained. For each drug, no significative influence in pre-systemic metabolism related to CYP3A enzymes was observed, which indicates that the oral absorption of the drugs is not limited by these enzymes. The use of different methods in this work allowed to understand the mechanisms involved in the transport of antiretroviral drugs, which is of a great relevance in drug development and in the understanding of clinical events currently not clarified.

Para fármacos administrados por via oral, o controle da extensão e da velocidade de absorção depende basicamente de duas importantes etapas: solubilidade do fármaco nos líquidos fisiológicos e sua permeabilidade através das membranas biológicas. Assim, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) foi proposto como uma ferramenta para o desenvolvimento de novos fármacos, de novas formulações e para auxiliar nos processos de bioisenção. No entanto, outro fator relacionado à biodisponibilidade e que deve ser considerado nos estudos biofarmacêuticos é o metabolismo. Desta forma, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica de Distribuição de Fármacos (SCBDF) foi proposto com a finalidade de classificar os fármacos de acordo com suas características de solubilidade e de metabolismo de modo que seja possível avaliar e predizer o comportamento do fármaco in vivo. O metabolismo tem sido amplamente investigado, sobretudo as enzimas do citocromo P450, as quais estão presentes também nos enterócitos. Além disso, o SCBDF oferece um suporte quanto à avaliação dos mecanismos de permeabilidade envolvidos nos processos de absorção, interações fármaco-fármaco e interações fármaco-alimento. Assim, o presente trabalho teve como objetivo elucidar os mecanismos envolvidos na permeabilidade de fármacos antirretrovirais por meio dos modelos ex vivo (câmaras de difusão vertical tipo Franz) e in vitro (PAMPA, MDCK-MDR1 e microssomas) considerando os aspectos relacionados ao metabolismo intestinal e ao efluxo destes fármacos. Dada a importância da utilização de fármacos antirretrovirais na terapia medicamentosa contra a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e que estes medicamentos são normalmente administrados cronicamente, a compreensão dos mecanismos envolvidos na permeabilidade é de suma importância, uma vez que estes não estão totalmente esclarecidos e poucas informações são encontradas na literatura. Além disso, a biodisponibilidade de fármacos como estavudina, lamivudina e zidovudina indica variação na permeabilidade, necessitando de uma investigação científica mais aprofundada dos processos absortivos. Assim, segmentos de jejuno provenientes de ratos machos Wistar foram utilizados para a avaliação da permeabilidade intestinal dos referidos antirretrovirais considerando a avaliação de efluxo pela glicoproteína-P e o metabolismo intestinal pela CYP3A. De maneira complementar, estudos in vitro com o emprego de membranas artificiais paralelas (PAMPA) e culturas celulares de MDCK-MDR1 foram realizados com a finalidade de auxiliar na elucidação dos mecanismos de permeabilidade dos fármacos antirretrovirais. Além disso, a avaliação do metabolismo dos referidos fármacos foi realizada com o emprego de microssomas a fim de verificar se tais substâncias são substratos de enzimas da família CYP3A e, assim, verificar o impacto do metabolismo intestinal na absorção. Os resultados de permeabilidade obtidos em PAMPA foram: 0,74±0,11 x 10-6 cm/s para a estavudina, 0,25±0,12 x 10-6 cm/s para a lamivudina e 1,14±0,25 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Já no modelo ex vivo com o emprego de câmaras de difusão vertical tipo Franz, os resultados foram: 1,56±0,32 x 10-5 cm/s para a estavudina, 1,26±0,27 x 10-5 cm/s para a lamivudina e 2,54±0,49 x 10-5 cm/s para a zidovudina. Portanto, com base nos resultados obtidos a partir dos dois métodos empregados, sugere-se que 30 outro mecanismo de transporte que não envolva a permeabilidade por difusão transcelular passiva possa estar relacionado à permeabilidade dos fármacos antirretrovirais. Com relação aos estudos de efluxo, os resultados obtidos a partir dos experimentos realizados em câmaras de difusão vertical tipo Franz demonstraram o aumento significativo da permeabilidade dos três antirretrovirais quando o inibidor de P-gp foi empregado, sendo: de 15,6 x 10-6 para 42,5 x 10-6 cm/s para a estavudina, de 12,6 x 10-6 para 37,5 x 10-6 cm/s para a lamivudina e de 25,4 x 10-6 para 56,6 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Em culturas celulares MDCK-MDR1, os resultados de permeabilidade foram utilizados para a obtenção das razões entre as direções B&#8594;A e A&#8594;B. Os valores de Papp na condição inibida para os fármacos estudados apresentaram razão menor do que 1. Já a razão B&#8594;A/A&#8594;B para cada fármaco nos ensaios sem inibidor apresentou-se igual ou maior que 2, evidenciando a interação fármaco-transportador. Com base nisso, o modelo ex vivo com o emprego de segmentos intestinais em câmaras de difusão vertical tipo Franz apresentou-se adequado na avaliação do mecanismo de efluxo dos fármacos antirretrovirais, o que foi confirmado com os estudos realizados em MDCK-MDR1. Assim, os fármacos antirretrovirais estudados apresentaram interação significativa com a P-gp. Em relação aos estudos de metabolismo realizados em câmaras de difusão vertical tipo Franz, os resultados demonstraram grande variação na permeabilidade dos três antirretrovirais quando o inibidor de CYP3A foi empregado, sendo: de 15,6 x 10-6 para 23,5 x 10-6 cm/s para a estavudina, de 12,6 x 10-6 para 27,3 x 10-6 cm/s para a lamivudina e de 25,4 x 10-6 para 40,5 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Já no modelo que emprega microssomas, os resultados de metabolização na ausência e na presença de inibidor de CYP3A foram: de 16,56% para 19,79% para a estavudina, de 14,56% para 15,55% para a lamivudina e de 17,85% para 16,48% para a zidovudina. Com base nisso, sugerese o emprego de microssomas para a determinação de metabolismo, uma vez que o método ex vivo empregado demonstrou grande variação entre os valores obtidos. Desta forma, observou-se que, para cada fármaco, não houve influência significativa no metabolismo pré-sistêmico relacionado às enzimas do complexo CYP3A, o que indica que a absorção oral das referidas substâncias não é limitada por tais enzimas. Portanto, a utilização dos diferentes métodos empregados no desenvolvimento do presente trabalho permitiu compreender os mecanismos envolvidos no transporte dos fármacos antirretrovirais, o que se torna de grande relevância nas etapas de desenvolvimento farmacêutico de novas moléculas e na compreensão de eventos clínicos ainda não esclarecidos atualmente. / For orally administered drugs, control of the extent and rate of absorption depends on two important steps: solubility of the drug in physiological liquids and their permeability across biological membranes. Thus, the Biopharmaceutics Classification System (BCS) has been proposed as a tool for the development of new drugs, new formulations and aid in the biowaiver processes. However, another factor related to bioavailability that should be considered in biopharmaceutic studies is the metabolism. Thus, the Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System (BDDCS) has been proposed for drug classification according to their solubility and metabolism characteristics, so it is possible to evaluate and predict the in vivo behavior of a compound. Metabolism has been extensively investigated, especially cytochrome P450 enzymes, which are also expressed in enterocytes. Besides, BDDCS provides support in evaluating the permeability mechanisms involved in the absorption processes, drug-drug interactions and drug-food interactions. Thus, the present study aimed to evaluate the mechanisms of permeability of antiretroviral drugs through the ex vivo (Franz cells) and in vitro (PAMPA, MDCK-MDR1 and microsomes) models considering aspects related to the intestinal metabolism and efflux of these drugs. Given the importance of the use of antiretroviral drugs in drug therapy against Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) and that these drugs are usually administered in a long-term way, understanding the mechanisms involved in the permeability is of a great importance, since they are not totally elucidated and no information is found in the literature. In addition, drugs as stavudine, lamivudine and zidovudine indicate variation in the permeability, which require further scientific investigation of absorptive processes. Thus, jejunum segments from rats were used to evaluate the intestinal permeability of these antiretroviral drugs, considering the evaluation of efflux by P-glycoprotein and intestinal metabolism by CYP3A. In a complementary manner, in vitro studies using parallel artificial membranes (PAMPA) and cell cultures MDCK-MDR1 were performed to aid in the elucidation of the permeability mechanisms of antiretroviral drugs. Also, the evaluation of the metabolism was carried out using microsomes to verify if such substances are substrates of CYP3A, and verify the impact of the intestinal metabolism in the absorption. The permeability results obtained in PAMPA were: 0.74±0.11x10-6 cm/s for stavudine, 0.25±0.12x10-6 cm/s for lamivudine and 1.14±0.25x10-6 cm/s for zidovudine. In ex vivo method using the intestinal segments in Franz cells, the results were: 1.56±0.32x10-5 cm/s for stavudine, 1.26±0.27x10-5 cm/s for lamivudine and 2.54±0.49x10-5 cm/s for zidovudine. Thus, based on the results obtained from these two methods, it is suggested that the antiretroviral drugs present other transport mechanism that is different from transcellular passive diffusion. For efflux studies, results obtained from experiments performed in Franz cells shown the increase of the permeability of the three antiretroviral drugs when the P-gp inhibitor was used: from 15.6x10-6 to 42,5x10-6 cm/s for stavudine, from 12.6x10-6 cm/s to 37.5x10-6 cm/s for lamivudine, and 25.4x10-6 to 56.6x10-6 cm/s for zidovudine. In MDCK-MDR1, the permeability results were used for obtaining ratio values between the directions B&#8594;A and A&#8594;B. The Papp values obtained with 33 inhibitor shown a ratio less than 1. For ratio B&#8594;A/A&#8594;B for each drug in experiments without inhibitor, the values obtained was equal or greater than 2, which shows the interaction between drug and transporter. Based on that, the ex vivo model using intestinal segments in Franz cells seems to be adequate for evaluation of efflux mechanism of antiretroviral drugs, which was confirmed by MDCK-MDR1 studies. Thus, the antiretroviral drugs presented interaction with P-gp. For metabolism studies in intestinal segments in Franz cells, a wide range of standard deviation was observed for the three antiretroviral drugs when the CYP3A inhibitor was used: from 15.6x10-6 cm/s to 23.5x10-6 cm/s for stavudine, from 12.6x10-6 cm/s to 27.3x10-6 cm/s for lamivudine, and from 25.4x10-6 cm/s to 40.5x10-6 cm/s for zidovudine. In experiments in microsomes, the results of metabolization in the absence and presence of CYP3A inhibitor were: from 16.56 to 19.79% for stavudine, from 14.56 to 15.55% for lamivudine and from 17.85 to 16.48% for zidovudine. Based on that, it is suggested the use of microsomes for metabolism evaluation, since the ex vivo method presented high variability between the results obtained. For each drug, no significative influence in pre-systemic metabolism related to CYP3A enzymes was observed, which indicates that the oral absorption of the drugs is not limited by these enzymes. The use of different methods in this work allowed to understand the mechanisms involved in the transport of antiretroviral drugs, which is of a great relevance in drug development and in the understanding of clinical events currently not clarified.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T01:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vencatto_RobyWill_M.pdf: 2327467 bytes, checksum: 906caea2ae7f9182396080360689d4a1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O câncer de mama é classificado mundialmente, como o segundo tipo de câncer mais frequente e comum entre as mulheres e tem natureza multifatorial. O tratamento sistêmico do câncer é denominado quimioterapia antineoplásica, e o seu efeito terapêutico depende da concentração plasmática e tempo de exposição à droga. A resposta aos medicamentos possui variação entre os pacientes, podendo decorrer de fatores como: outras patologias, farmacocinética e farmacodinâmica diferenciadas, fatores ambientais e genéticos, sendo este último, estudado na farmacogenética e farmacogenômica, onde se verifica a resposta ao tratamento pela variação herdada de cada indivíduo. Em determinadas populações, polimorfismos podem levar a respostas diferenciadas de um medicamento por induzir peculiaridades na genética, farmacocinética ou farmacodinâmica. Em muitos medicamentos em uso, os transportadores de drogas são importantes na questão de absorção, acumulação no tecido e eliminação do organismo. O gene 'ABCB1' codifica a glicoproteína-P que é um transportador de membrana, responsável pelo efluxo celular de uma variedade de drogas, xenobióticos, metabólitos celulares e agentes anticancerígenos, estruturalmente independentes. Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar se os polimorfismos C1236T e G2677T/A do gene 'ABCB1', possuem associação com a resposta ao tratamento quimioterápico. Foi realizado estudo com 146 pacientes do sexo feminino, que usaram os quimioterápicos doxorrubicina e ciclofosfamida de forma adjuvante, independente se fizeram quimioterapia neoadjuvante. A presença de recidiva foi utilizada como parâmetro de avaliação do tratamento. A genotipagem dos polimorfismos foi feita por reação da polimerase em cadeia alelo específica. As análises de sobrevivência livre da doença e global foram realizadas pelo software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) vs20.0 e as demais avaliações no SAS (StatisticalAnalysis Software) vs 9.3. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Breast cancer is classified worldwide as the second most frequent and common cancer among women and has a multifactorial nature. The systemic treatment of the cancer is called chemotherapy, and its therapeutic effect depends on the plasma concentration and length of exposure to the drug. The drug response varies among patients and may be the result of many things, such as: other diseases, different pharmacokinetics and pharmacodynamics, environmental and genetic factors. Genetic factors are studied in pharmacogenetics and pharmacogenomics, which verify the response to the treatment through the inherited variation of each individual. In some populations, polymorphisms can lead to different responses to a drug by inducing peculiarities on the pharmacokinetics or pharmacodynamics. In many drugs in use, the drug carriers are important in terms of absorption, accumulation in tissue and elimination from the body. The 'ABCB1' gene, which encodes the P-glycoprotein that is a membrane transporter, responsible for the cellular efflux of a variety of drugs, xenobiotics, cellular metabolites and anticancer agents, structurally independent. Thus, the objective of this study was to determine whether the C1236T and G2677T/A of the 'ABCB1' genes could be associated with the response to chemotherapy. The study featured 146 female patients who used doxorubicin and cyclophosphamide adjuvantly, independent of the neoadjuvant chemotherapy. The relapse was used as a parameter of association to the treatment. Genotyping of polymorphisms was performed by polymerase in specific allele chain reaction. The free and global survival analysis, was performed by the SPSS (Statistical Package for Social Sciences) software vs 20.0. Other statistical tests were performed by SAS (Statistical Analysis Software) vs 9.3.... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertation / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas