O Capítulo 1 descreve a produção de celulases por 4 linhagens fúngicas de ambiente marinho (Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, Penicillium citrinum CBMAI 1186 e Mucor racemosus CBMAI 847) e uma linhagem de ambiente terrestre (Aspergillus sp. CBMAI 1198) cultivados em meio sólido composto por farelo de trigo (5 g) e solução de peptona (0,75 g.L-1) enriquecida com sais inorgânicos. Foram realizadas otimizações da temperatura, pH inicial e umidade do meio de cultura das linhagens obtendo-se maiores atividades celulolíticas na faixa de temperatura entre 25-35 °C, com exceção do fungo A. sydowii CBMAI 935 que foi de 40 °C, e valores diferentes de pH ótimo, desde condições acídicas até alcalinas, bem como valores diferentes de teor de umidade ótima. Quando avaliou-se a influência do pH, da temperatura e do volume de extrato enzimático durante a hidrólise do papel de filtro cada conjunto de celulases produzidas apresentou pontos ótimos diferentes entre elas, e em alguns casos, dois valores ótimos de pH e temperatura. As celulases produzidas nas condições ótimas determinadas foram aplicadas na hidrólise da celulose do bagaço da cana-de-açúcar pré-tratado usando-se 10 U FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar. As celulases dos fungos Aspergillus sp. CBMAI 1198 e A. sydowii CBMAI 934 apresentaram a maior capacidade para hidrolisar o bagaço da cana-de-açúcar pré-tratado, 75% e 78% de degradação do material lignocelulósico, respectivamente. No Capítulo 2 foi avaliada a capacidade de 6 bactérias isoladas de turfeira (Bacillus subtilis LQOB-SE1, B. coagulans LQOB-SE2, B. pumilus LQOB-SE3, Brevibacillus brevis LQOB-SE4, Lysinibacillus sp. LQOB-SE5 e Serratia marcescens LQOB-SE6) em produzir 2,3-butanodiol a partir da fermentação de glicerol e a bactéria que apresentou tal capacidade (S. marcescens LQOB-SE6) foi usada para produzir 2,3-butanodiol também a partir da fermentação de glicose visando o reaproveitamento dos resíduos gerados na produção de biodiesel e de etanol. As melhores condições para o uso do glicerol foram: pH inicial 7, Caldo nutriente 8 g.L-1, concentração inicial de glicerol 50 g.L-1 e tempo de cultivo de 7 dias. Foram obtidos bons rendimento (0,30 g.g-1), produtividade (0,13 g.L-1.h-1) e concentração máxima de 2,3-butanodiol (22,4 g.L-1). As melhores condições para a fermentação da glicose foram: pH inicial 7, Caldo nutriente 8 g.L-1, concentração inicial de glicose 75 g.L-1 e tempo de cultivo de 5 dias. Obteve-se um rendimento de 0,42 g.g-1 em 5 dias de fermentação, produtividade de 0,45 g.L-1.h-1 após 2 dias e concentração máxima de 2,3-butanodiol de 31,2 g.L-1. A produção de 2,3-butanodiol a partir do hidrolisado gerado na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pelas celulases do fungo de ambiente marinho A. sydowii CBMAI 934 não foi observada devido à baixa concentração de açúcares no hidrolisado. Os resultados obtidos nesta tese mostram o potencial biotecnológico da microbiota fúngica e bacteriana isoladas de diferentes biomas brasileiros. / In Chapter 1 it is reported the cellulase production by 4 marine-derived fungi strains (Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, Penicillium citrinum CBMAI 1186 and Mucor racemosus CBMAI 847) and 1 terrestrial fungi strain (Aspergillus sp. CBMAI 1198). They were grown in solid state fermentation using wheat straw as substrate (5 g) and with addition of peptone solution (0,75 g.L-1) enriched with inorganic salts. It was performed the enhancement of the growth conditions by changing the temperature, initial pH and moisture. The optimum temperature for all strains varied between 25-35 °C but A. sydowii CBMAI 935 with 40 °C. The optimum pH was different for each strain, varying from acidic to alkaline conditions. The optimum moisture content also varied accordingly the studied strain. In order enhance the cellulose hydrolysis performed by the produced cellulases, it was varied the pH, temperature and amount of the crude cellulase extract during the filter paper hydrolysis reaction. The obtained optimum values were different among strains and, in some cases, there were two optimum pH and temperature for the hydrolysis of the filter paper. Then, the obtained cellulases, using the best conditions for hydrolysis, were used in the sugarcane bagasse hydrolysis (10 FPU/g of sugarcane bagasse). The cellulases from the strains Aspergillus sp. CBMAI 1198 and A. sydowii CBMAI 934 were capable of degrading 75% and 78% of the sugarcane bagasse, respectively, generating reducing sugars. In Chapter 2, the capability of 6 strains (Bacillus subtilis LQOB-SE1, B. coagulans LQOB-SE2, B. pumillus LQOB-SE3, Brevibacillus brevis LQOB-SE4, Lysinibacillus sp. LQOB-SE5 and Serratia marcescens LQOB-SE6), isolated from peat soil, of producing 2,3-butanediol from glycerol fermentation. The only strain that produced 2,3-butanediol was S. marcescens LQOB-SE6, which was also applied in 2,3-butanediol production from glucose fermentation. Therefore, wastes from biodiesel and bioethanol production can be reused in industrial scale. The best conditions for glycerol fermentation: initial pH 7, Nutrient Broth (8 g.L-1), initial glycerol concentration (50 g.L-1) and fermentation time of 7 days. It were obtained good yield (0.30 g.g-1), productivity (0.13 g.L-1.h-1) and 2,3-butanodiol concentration (22.4 g.L-1). The best conditions for glucose fermentation: initial pH 7, Nutrient Broth (8 g.L-1), initial glucose concentration (75 g.L-1) and fermentation time of 5 days. It were also obtained good yield (0.42 g.g-1) and 2,3-butanodiol concentration (31.2 g.L-1) after 5 days and productivity (0.45 g.L-1.h-1) after 2 days. The 2,3-butanediol production from the hydrolysate of sugarcane bagasse, obtained by using cellulases from A. sydowii CBMAI 934, was not observed due the low sugar concentration in the hydrolysate.

O Capítulo 1 descreve a produção de celulases por 4 linhagens fúngicas de ambiente marinho (Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, Penicillium citrinum CBMAI 1186 e Mucor racemosus CBMAI 847) e uma linhagem de ambiente terrestre (Aspergillus sp. CBMAI 1198) cultivados em meio sólido composto por farelo de trigo (5 g) e solução de peptona (0,75 g.L-1) enriquecida com sais inorgânicos. Foram realizadas otimizações da temperatura, pH inicial e umidade do meio de cultura das linhagens obtendo-se maiores atividades celulolíticas na faixa de temperatura entre 25-35 °C, com exceção do fungo A. sydowii CBMAI 935 que foi de 40 °C, e valores diferentes de pH ótimo, desde condições acídicas até alcalinas, bem como valores diferentes de teor de umidade ótima. Quando avaliou-se a influência do pH, da temperatura e do volume de extrato enzimático durante a hidrólise do papel de filtro cada conjunto de celulases produzidas apresentou pontos ótimos diferentes entre elas, e em alguns casos, dois valores ótimos de pH e temperatura. As celulases produzidas nas condições ótimas determinadas foram aplicadas na hidrólise da celulose do bagaço da cana-de-açúcar pré-tratado usando-se 10 U FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar. As celulases dos fungos Aspergillus sp. CBMAI 1198 e A. sydowii CBMAI 934 apresentaram a maior capacidade para hidrolisar o bagaço da cana-de-açúcar pré-tratado, 75% e 78% de degradação do material lignocelulósico, respectivamente. No Capítulo 2 foi avaliada a capacidade de 6 bactérias isoladas de turfeira (Bacillus subtilis LQOB-SE1, B. coagulans LQOB-SE2, B. pumilus LQOB-SE3, Brevibacillus brevis LQOB-SE4, Lysinibacillus sp. LQOB-SE5 e Serratia marcescens LQOB-SE6) em produzir 2,3-butanodiol a partir da fermentação de glicerol e a bactéria que apresentou tal capacidade (S. marcescens LQOB-SE6) foi usada para produzir 2,3-butanodiol também a partir da fermentação de glicose visando o reaproveitamento dos resíduos gerados na produção de biodiesel e de etanol. As melhores condições para o uso do glicerol foram: pH inicial 7, Caldo nutriente 8 g.L-1, concentração inicial de glicerol 50 g.L-1 e tempo de cultivo de 7 dias. Foram obtidos bons rendimento (0,30 g.g-1), produtividade (0,13 g.L-1.h-1) e concentração máxima de 2,3-butanodiol (22,4 g.L-1). As melhores condições para a fermentação da glicose foram: pH inicial 7, Caldo nutriente 8 g.L-1, concentração inicial de glicose 75 g.L-1 e tempo de cultivo de 5 dias. Obteve-se um rendimento de 0,42 g.g-1 em 5 dias de fermentação, produtividade de 0,45 g.L-1.h-1 após 2 dias e concentração máxima de 2,3-butanodiol de 31,2 g.L-1. A produção de 2,3-butanodiol a partir do hidrolisado gerado na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pelas celulases do fungo de ambiente marinho A. sydowii CBMAI 934 não foi observada devido à baixa concentração de açúcares no hidrolisado. Os resultados obtidos nesta tese mostram o potencial biotecnológico da microbiota fúngica e bacteriana isoladas de diferentes biomas brasileiros. / In Chapter 1 it is reported the cellulase production by 4 marine-derived fungi strains (Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, Penicillium citrinum CBMAI 1186 and Mucor racemosus CBMAI 847) and 1 terrestrial fungi strain (Aspergillus sp. CBMAI 1198). They were grown in solid state fermentation using wheat straw as substrate (5 g) and with addition of peptone solution (0,75 g.L-1) enriched with inorganic salts. It was performed the enhancement of the growth conditions by changing the temperature, initial pH and moisture. The optimum temperature for all strains varied between 25-35 °C but A. sydowii CBMAI 935 with 40 °C. The optimum pH was different for each strain, varying from acidic to alkaline conditions. The optimum moisture content also varied accordingly the studied strain. In order enhance the cellulose hydrolysis performed by the produced cellulases, it was varied the pH, temperature and amount of the crude cellulase extract during the filter paper hydrolysis reaction. The obtained optimum values were different among strains and, in some cases, there were two optimum pH and temperature for the hydrolysis of the filter paper. Then, the obtained cellulases, using the best conditions for hydrolysis, were used in the sugarcane bagasse hydrolysis (10 FPU/g of sugarcane bagasse). The cellulases from the strains Aspergillus sp. CBMAI 1198 and A. sydowii CBMAI 934 were capable of degrading 75% and 78% of the sugarcane bagasse, respectively, generating reducing sugars. In Chapter 2, the capability of 6 strains (Bacillus subtilis LQOB-SE1, B. coagulans LQOB-SE2, B. pumillus LQOB-SE3, Brevibacillus brevis LQOB-SE4, Lysinibacillus sp. LQOB-SE5 and Serratia marcescens LQOB-SE6), isolated from peat soil, of producing 2,3-butanediol from glycerol fermentation. The only strain that produced 2,3-butanediol was S. marcescens LQOB-SE6, which was also applied in 2,3-butanediol production from glucose fermentation. Therefore, wastes from biodiesel and bioethanol production can be reused in industrial scale. The best conditions for glycerol fermentation: initial pH 7, Nutrient Broth (8 g.L-1), initial glycerol concentration (50 g.L-1) and fermentation time of 7 days. It were obtained good yield (0.30 g.g-1), productivity (0.13 g.L-1.h-1) and 2,3-butanodiol concentration (22.4 g.L-1). The best conditions for glucose fermentation: initial pH 7, Nutrient Broth (8 g.L-1), initial glucose concentration (75 g.L-1) and fermentation time of 5 days. It were also obtained good yield (0.42 g.g-1) and 2,3-butanodiol concentration (31.2 g.L-1) after 5 days and productivity (0.45 g.L-1.h-1) after 2 days. The 2,3-butanediol production from the hydrolysate of sugarcane bagasse, obtained by using cellulases from A. sydowii CBMAI 934, was not observed due the low sugar concentration in the hydrolysate.

P. americana e T. molitor são capazes de secretar β-1,3-glucanases no tubo digestivo, pelas glândulas salivares e pelo epitélio do ventrículo, respectivamente. As laminarinases majoritárias de P. americana (LIQ1, 42kDa; LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) e T. molitor (LAM_T, 50kDa) foram purificadas até a homogeneidade. Essas enzimas têm diferentes especificidades, padrões de ação e resíduos envolvidos em catálise, fazendo parte dos E.C. 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), E.C. 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) ou E.C. 3.2.1.58 - exo-β-1,3-glucanase (LAM_A e LAMT). O papel dessas enzimas é digerir β-glucanas de fungos e de cereais. LAM_P e LAMA são inibidas por laminarina, pela formação de complexos enzima-substrato não-produtivos. LIQ1, LAM_P e LAM_A são enzimas processivas, com diferentes graus de ataque múltiplo e produzem série distintas de oligossacarídeos. LAM_A possui um sítio acessório de ligação para laminarina, o qual pode estar envolvido no mecanismo de processividade. Quitinases digestivas de insetos podem ser diferentes das descritas até o momento. A. flavolineata e T. molitor possuem sistemas celulásicos completos. Os três insetos apresentam proteínas de baixo peso molecular capazes de ligar-se a celulose ou a pachyman. O ancestral dos hexapoda provavelmente possuía β-1,3 e β-1,3(4) glucanases digestivas associadas a um hábito detritívoro. / P. americana salivary glands and T. molitor midgut epithelium actively secrete laminarinases into the midgut. The major laminarinases from P. americana (LIQ1, 42kDa and LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) and T molitor (LAM_T, 50kDa) were purified until homogeneity. These enzymes have different specificities, action patterns and activesite catalytic groups, and correspond to E.C.s 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) or 3.2.1.58 -exo-β-1,3-glucanase (LAM_A and LAM_T). Their physiological role is fungai and cereal β-glucan digestion. LAM_P and LAM_A are inhibited by excess substrate (non-productive enzyme-substrate complexes). LIQ1, LAM_P and LAMA have different multiple attack degrees and produce different oligosaccharides. LAM_A has a second substrate binding site, probably involved with processivity. T. molitor digestive chitinase is different from other insect chitinases. A. flavolineata and T. molitor can hydrolyse cristalline cellulose efficiently. The three studied insects have cellulose or pachyman-binding proteins with low molecular weights. Hexapoda ancestors probably had digestive β-1,3 and β-1,3(4)-glucanases and a detritivore habit.

P. americana e T. molitor são capazes de secretar β-1,3-glucanases no tubo digestivo, pelas glândulas salivares e pelo epitélio do ventrículo, respectivamente. As laminarinases majoritárias de P. americana (LIQ1, 42kDa; LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) e T. molitor (LAM_T, 50kDa) foram purificadas até a homogeneidade. Essas enzimas têm diferentes especificidades, padrões de ação e resíduos envolvidos em catálise, fazendo parte dos E.C. 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), E.C. 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) ou E.C. 3.2.1.58 - exo-β-1,3-glucanase (LAM_A e LAMT). O papel dessas enzimas é digerir β-glucanas de fungos e de cereais. LAM_P e LAMA são inibidas por laminarina, pela formação de complexos enzima-substrato não-produtivos. LIQ1, LAM_P e LAM_A são enzimas processivas, com diferentes graus de ataque múltiplo e produzem série distintas de oligossacarídeos. LAM_A possui um sítio acessório de ligação para laminarina, o qual pode estar envolvido no mecanismo de processividade. Quitinases digestivas de insetos podem ser diferentes das descritas até o momento. A. flavolineata e T. molitor possuem sistemas celulásicos completos. Os três insetos apresentam proteínas de baixo peso molecular capazes de ligar-se a celulose ou a pachyman. O ancestral dos hexapoda provavelmente possuía β-1,3 e β-1,3(4) glucanases digestivas associadas a um hábito detritívoro. / P. americana salivary glands and T. molitor midgut epithelium actively secrete laminarinases into the midgut. The major laminarinases from P. americana (LIQ1, 42kDa and LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) and T molitor (LAM_T, 50kDa) were purified until homogeneity. These enzymes have different specificities, action patterns and activesite catalytic groups, and correspond to E.C.s 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) or 3.2.1.58 -exo-β-1,3-glucanase (LAM_A and LAM_T). Their physiological role is fungai and cereal β-glucan digestion. LAM_P and LAM_A are inhibited by excess substrate (non-productive enzyme-substrate complexes). LIQ1, LAM_P and LAMA have different multiple attack degrees and produce different oligosaccharides. LAM_A has a second substrate binding site, probably involved with processivity. T. molitor digestive chitinase is different from other insect chitinases. A. flavolineata and T. molitor can hydrolyse cristalline cellulose efficiently. The three studied insects have cellulose or pachyman-binding proteins with low molecular weights. Hexapoda ancestors probably had digestive β-1,3 and β-1,3(4)-glucanases and a detritivore habit.

Periplaneta americana apresenta em seu tubo digestivo pelo menos oito atividades β-glucanásicas distintas. Destas, cinco puderam ser purificadas até a homogeneidade e parcialmente caracterizadas. LAM (Mr=46.000) apresenta atividade exclusiva sobre laminarina, é inibida por altas concentrações de substrato e gera oligossacarídeos de baixo grau de polimerização (1 a 4) a partir de laminarina solúvel. LIQl (Mr=24.600) é capaz de hidrolisar laminarina e liquenana, produzindo oligossacarídeos de grau de polimerização 1, 2 e 4 a partir de laminarina solúvel e um único oligossacarídeo (grau de polimerização entre 3 e 4) a partir de liquenana. LIQ 2 (Mr= 22.300) é capaz de clivar laminarina e liquenana e é inibida por laminarina, clivando apenas ligações internas ao polímero. CELl e CEL2 (Mr=71.600 e 72.700) clivam liquenana e carboximetilcelulose, também atacando apenas ligações internas destes polissacarídeos. CELl e CEL2 também são capazes de atacar celulose cristalina. Todas as β-glucanases purificadas apresentam um pH ótimo em torno de 6,0, próximo ao pH luminal, e são relativamente estáveis em condições fisiológicas. Estas enzimas são purificadas a partir da fração solúvel do tubo digestivo do inseto em quantidades muito pequenas (até 7µg), o que inviabiliza sua caracterização estrutural refinada. Além destas proteínas, o sistema β-glucanásico de P. americana conta com duas celulases de baixo peso molecular (Mr= 15.000 e 17.000), e uma atividade ainda não caracterizada. Aparentemente, estas enzimas estão envolvidas na digestão incompleta da celulose e hemiceluloses ingeridas pelo inseto. LIQ 1 possui capacidade lítica sobre células de Saccharomyces cerevisiae, podendo estar envolvida na defesa do epitélio contra agentes infecciosos. / P. americana midgut has at least eight β-glucanases. Five were purified and partially characterized. LAM (Mr=46,000) is active only upon soluble laminarin, is inhibited by high amounts of substrate, and releases small oligosaccharides (1 to 4 glucoses). LIQ1 (Mr=24,600) is active upon laminarin and lichenan, releasing oligosaccharides with 1,2 and 4 glucosyl residues from soluble laminarin and only one oligossacharide, with a degree of polimerization between 3 and 4, from lichenan. LIQ2 (Mr=22,300) is active upon laminarin and lichenan and hydrolyzes only internal bond. CEL1 and CEL2 are active upon lichenan and carboxymethylcellulose, hydrolyzing internal bonds in these substrates. CEL1 and CEL2 also attack AVICEL. All β-glucanase activities have an optimum pH around 6.0 (near luminal pH) and are stable under physiological conditions. These enzymes are purified in very low amounts (up to 7µg from 10 animais). P. americana &#946,-glucanasic system also has two cellulases of low molecular weight (Mr= 15,000 and 17,000), and another not yet characterized. Probably these enzymes are involved in incomplete digestion of cellulose and hemicellulose ingested by the insect. LIQ 1 lyses Saccharomyces cerevisiae cells, and may be involved in epithelium defense against microorganisms.

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Marcia Maria de Souza Moretti / Banca: Márcia J. Rossini Mutton / Banca: Gustavo O. Bonilla Rodriguez / Resumo: Um dos interesses biotecnológicos e econômicos da atualidade é otimizar o emprego da biomassa em processos industriais mediado por biocatalisadores, como as enzimas. O objetivo do presente trabalho foi purificar e caracterizar uma endoglucanase produzida pelo fungo Rasamsonia emersonii S10, em fermentação em estado sólido, tendo como substrato resíduos lignocelulósicos. A partir de solução enzimática bruta detectou-se 2 isoformas da enzima, com massas moleculares de 45 e 60 kDa, sendo escolhida a primeira para ser purificada. A solução foi clarificada em carvão ativado e concentrada por ultrafiltração tangencial. A endoglucanase foi purificada em coluna cromatográfica iônica e de exclusão molecular, intermediada por diálise. O processo levou a um fator de purificação de 6,7 e rendimento de 8,8%. A enzima apresentou temperatura ótima de 85,3 ºC e pH 4,0. Ativação foi evidenciada quando a enzima foi mantida de 40 até 60 ºC. A enzima foi estável, quando mantida em temperaturas de 65 a 80 ºC e faixa de pH entre 6 e 7,5. Estudo do efeito de íons e compostos orgânicos revelaram ativação em presença de MnCl2 e inibição por HgCl2 e ácido 4-hidroxibenzóico e 5-hidroximetilfurfural. A enzima mostrou afinidade por CMC, porém também foi capaz de hidrolisar Avicel®. A CMCase exibiu Km de 3,53 mg.mL-1 e Vmax de 2,86 µmol/min.mL. Os parâmetros termodinâmicos indicaram uma endoglucanase estável a altas temperaturas, com tempo de meia vida de 355 min a 40 ºC e temperatura de fusão em 89 ºC / Abstract: Nowadays, one of the technological and economic interests is to optimize the use of biomass in industrial processes mediated by biocatalysts such as enzymes. The objective of this study was to purify and characterize an endoglucanase produced by the fungus Rasamsonia emersonii S10 in solid state fermentation, as substrate lignocellulosic residues. From the crude enzyme solution was detected 2 isoform of the enzyme, with a molecular weight of 45 kDa and 60, the first being chosen to be purified. The solution was clarified by activated carbon and concentrated by tangential ultrafiltration. The endoglucanase was purified by ion chromatographic and molecular exclusion mediated by dialysis. The process led to a purification factor of 6.7 and 8.8% yield. The enzyme showed optimum temperature of 85.3 °C and pH 4.0. Activation was observed when the enzyme was maintained at 40 to 60 °C. The enzyme was stable when maintained at temperatures 65-80 °C and pH between 6 and 7.5. Study of the effect of ions and organic compounds showed activation in the presence of MnCl2 and HgCl2 inhibition and 4- hydroxybenzoic acid and 5-hydroxymethylfurfural. The enzyme showed affinity for CMC, but was also able to hydrolyze Avicel®. The CMCase exhibited Km 3.53 mg.mL-1 and Vmax of 2.86 mmol/min.mL-1 . The thermodynamic parameters indicated endoglucanase stable at high temperatures, with half-life of 355 min at 40 °C and the melting temperature at 89 °C / Mestre

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.

Na produção do etanol 2G, as celulases representam um componente importante do custo. Com base em informações da literatura e resultados obtidos no Laboratório de Engenharia Bioquímica da Escola Politécnica da USP, foi feito um estudo do custo de produção das celulases via fermentação em estado sólido (FES) em escala industrial. Foram consideradas as seguintes variáveis no processo de produção das celulases, denominadas cenários de produção: concentração das celulases no meio de cultura de 1 a 150 FPU/gms; produtividade em celulases em 0,11 e 0,45FPU/gms.h; atividade de celulase na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar entre 7 e 30 FPU/g de substrato seco; massa de bagaço de cana a ser hidrolisada entre 5 e 30% do bagaço gerado numa usina sucroalcooleira de referência (1.000.000 ton. de cana-de-açúcar /ano); custo dos substratos para a FES variando entre US$6,00 a US$12,00 por tonelada para o bagaço de cana-de-açúcar (80% da massa do meio) e US$80,00 a US$110,00 por tonelada para o farelo de trigo (20% da massa do meio); capacidade volumétrica dos reatores de FES variando entre 5 e 50 m3. Os impactos das variáveis consideradas foram: concentração de celulases no meio de cultura, acima de 45FPU/gms causam reduções menores que 5% no custo de produção; produtividades iguais em celulases (0,45FPU/gms.h), apresenta um processo 11% menos custoso para aquela com maior produção de enzimas, em relação ao tempo de fermentação; destinação de até 10% do bagaço gerado pela usina, reduz em 7% o custo de produção das celulases e a dosagem de celulase não causa redução significativa nos custos de produção, assim como o custo das matérias-primas; o aumento da capacidade dos reatores de FES causam redução de até 47% no custo de produção das celulases. A análise de regressão linear das variáveis apresentadas indica qual o impacto percentual dobre o custo de produção das celulases: quantidade de bagaço de cana-de-açúcar destinado à hidrólise (0,6%), atividade enzimática para a reação de hidrólise (0,3%), produção de celulase (73,4%), volume dos reatores de inóculo (0,5%), volume dos reatores de FES (2,7%), tempo de crescimento do inóculo (0,1%), tempo de fermentação (3,7%), custo do bagaço de cana-de-açúcar (0,9%), custo do farelo de trigo (0,6%) e outras variáveis não analisadas (17,2%). Conclui-se que, com os dados atuais sobre FES, a probabilidade de se obter um processo em escala industrial com custo de produção de celulase menor que US$0,50/100.000FPU é de 15%. Desenvolvimento de culturas microbianas mais produtivas em celulases e tecnologias mais avançadas de reatores de grande escala, são necessárias à viabilidade da produção das celulases via FES para aplicação na hidrólise de celulose. / In ethanol 2G production, cellulases are an important component of the cost. Based on information from literature and results obtained in the Labotatório de Engenharia Bioquímica da Escola Politécnica da USP, a study was made of the production cost of cellulases via solid state fermentation (SSF) on industrial scale. The following variables were considered in the production of cellulases, called \"production scenarios\": the concentration of cellulase in the culture medium from 1 to 150 FPU / gms; productivity cellulases in 0.11 and 0.45 FPU / gms.h; cellulase activity in the hydrolysis of bagasse from sugar cane between 7 and 30 FPU / g substrate dry mass; cane bagasse hydrolyzed to be between 5 and 30% of sugarcane bagasse generated in a reference plant (1,000,000 ton of cane sugar per year) and the cost of substrates for SSF ranging from $ 6.00 to $ 12.00 per ton for the sugarcane bagasse (80% by weight of medium) and $ 80, 00 to $ 110.00 per ton for wheat bran (20% of the mass medium); volumetric capacity of the reactors of FES ranged between 5 and 50 m3. The impacts of the variables considered were: concentration of cellulase in the culture medium above 45FPU/gms cause reductions of less than 5% of the cost of production; for equal productivities of cellulose (0.45 FPU / gms.h) shows a process 11% less costly when the production of enzymes is higher in relation to fermentation time; using up to 10% of sugarcane bagasse generated by the reference plant, reduces by 7% the cost of production of cellulases and cellulase dosage does not cause significant reduction in production costs as well as the cost of raw materials; increasing the capacity of the reactors of FES cause a reduction of up to 47% on cost of production of cellulases. The linear regression analysis of the variables presented indicates what percentage impact the production cost of cellulases: The amount of bagasse cane sugar for the hydrolysis (0.6%), enzymatic activity for the hydrolysis reaction (0, 3%), production of cellulase (73.4%), the reactor volume of inoculum (0.5%), volume of the reactors of FES (2.7%), time of growth of the inoculum (0.1%) fermentation time (3.7%), cost of sugarcane bagasse (0.9%), cost of wheat bran (0.6%) and other variables not analyzed (17.2%). It was concluded that with current data on FES, the probability of obtaining a process on an industrial scale with production cost of cellulase less than $ 0.50/100.000FPU is 15%. Development of microbial cultures more productive in cellulases and more advanced technologies for large-scale reactors are necessary for the viability of the production of cellulases for FES for application in the hydrolysis of cellulose.

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas. / The increase in global energy demand, shrinkage perspective of energy resources and global concern about environmental issues, aroused interest in finding alternative sources of energy. Lignocellulosic biomass is plentiful and inexpensive, and has the potential to complement the large-scale production of fuel. The degradation of molecules that constitute the cell wall to fermentable sugars and then to ethanol, occurs via the enzymatic hydrolysis of biomass. However, the use of enzymes for this purpose is in exploratory stage and represents a bottleneck in the implementation of 2G ethanol technologies in industrial scale, supporting studies about biochemically most active, stable and economically viable cellulases. This work aimed the characterization of endoglucanase I from fungus Trichoderma harzianum and for that, was performed expression and biochemical and biophysical assays of the catalytic domain (ThCel7B-CCD) and full protein (ThCel7B-full). The enzyme exhibited a acidophilic profile, with optimal activity at pH 3.0 at 55°C. The protein was also able to hydrolyze a variety of substrates, with higher hydrolytic activity in β-glucano (75 U mg-1). Analyzing the thermal stability as pH 5, residual activity remained intact for over 2 months. Another important feature was the high degree of synergy between ThCel7B and ThCel7A (DS 3). Electron microscopy analysis of oat samples subjected to hydrolysis with ThCel7B show the substrate degradation effects in relation to the control samples. All these results, as well as important for understanding the molecular mechanism of ThCel7B and other endoglucanases of GH7 family, also disclose an enzyme of biotechnological interest because the acid behavior and thermal stability are promises of industrial applications under extremely acidic conditions.

Orientador: João Cláudio Thoméo / Banca: José Teixeira Freire / Banca: Pedro de Oliva Neto / Banca: Andreas Bück / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Resumo: Esta tese trata da ampliação de escala de biorreatores de leito empacotado para produção de celulases fúngicas por fermentação em estado sólido (FES), constando de etapas experimentais, desenvolvidas no Brasil, e de modelagem e simulação, realizada na Alemanha. Em escala de frascos, foram obtidos parâmetros cinéticos de crescimento dos fungos termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b e mesofílico Trichoderma reesei QM9414. O crescimento foi estimado com base no teor de proteínas e as velocidades específicas de crescimento foram μ = 0,06 e 0,10 h-1 para os fungos termo e mesofílico, respectivamente. No período sanduíche, foi proposto um modelo heterogêneo bidimensional capaz de prever perfis de temperatura, umidade e crescimento fúngico ao longo do processo em qualquer posição do biorreator. Simulações empregando este modelo ao cultivo de M. thermophila em biorreator de leito empacotado com 7,62 cm de diâmetro interno indicaram que não deveria haver sobreaquecimento, mas perfis de umidade poderiam comprometer a produtividade na zona próxima à entrada de ar. Em ampliação de escala, foram realizados experimentos em biorreatores de leito empacotado empregando-se ambos os fungos e, como substratos, bagaço de cana e farelo de trigo. O rendimento do processo foi medido em termos de atividades celulolíticas, bem como se analisaram perfis de temperatura ao longo do processo e de umidade final do fermentado. Para ambos os fungos, em biorreator com 7,62 cm de diâmetro, não houve sobreaquecimento do leito para substrato contendo fibras de bagaço, concordando com simulações. Em biorreator com diâmetro 20 cm, observou-se um perfil térmico radial expressivo, com aumento de temperatura de até 10 ºC no centro do leito. Com o fungo termofílico M. thermophila, as atividades médias de endoglucanase e xilanase atingiram, respectivamente, 785 e 2120 U/gss no biorreator estreito e 580 e 2070 U/gss no biorreator largo... / Abstract: This thesis deal with the scale-up of packed-bed bioreactors for fungal cellulases production by solid-state fermentation (SSF), comprising experimental steps, developed in Brazil, and modeling and simulation, developed in Germany. At flasks scale, growth kinetic parameters were obtained for thermophilic fungus Myceliophthora thermophila I-1D3b and mesophilic one Trichoderma reesei QM9414. Growth was estimated based on protein content and specific growth rates were μ = 0,06 and 0,10 h-1 for thermo and mesophilic fungi, respectively. During the abroad period, it has been proposed a heterogeneous two-dimensional model able to predict temperature, moisture content and fungal growth profiles throughout the process at any position of the bioreactor. Simulations using this model for the cultivation of M. thermophila in a packed-bed bioreactor with internal diameter 7.62 cm addressed that is shouldn't happen overheating; however, moisture content profiles could harm enzyme productivity in the vicinity of the air inlet. On scaling-up, experiments in packed-bed bioreactors employing both fungi and sugar cane bagasse and wheat bran as substrates were carried out. The process yield was measured as cellulolytic activities, as well as temperature profiles along the process and final moisture contents of the fermented materials were obtained. For both fungi, in bioreactor with 7.62 cm diameter, there was no overheating of the bed when substrate contained bagasse fibers, agreeing with simulations. In bioreactor with 20 cm diameter, an expressive radial thermal profile has been observed, with temperature increasing up to 10 ºC at bed central axis. With thermophilic fungus M. thermophila, average activities of endoglucanase and xylanase reached, respectively, 785 and 2120 U/gss in thin-bioreactor and 580 and 2070 U/gss in large-bioreactor. With mesophilic fungus T. reesei, average activities of endoglucanase and ... / Doutor