Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-16Bitstream added on 2014-06-13T19:08:55Z : No. of bitstreams: 1 marques_np_me_araiq_parcial.pdf: 117061 bytes, checksum: 111016526ed0a98902d9d6c8b01f9d3b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-22T12:53:53Z: marques_np_me_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-22T12:54:47Z : No. of bitstreams: 1 000721712_20150917.pdf: 105117 bytes, checksum: bd9855c12b3ec4afdcb5547ce783e4e6 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-17T16:31:32Z: 000721712_20150917.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T16:32:27Z : No. of bitstreams: 1 000721712.pdf: 835904 bytes, checksum: fd7bf1792a2e5436543d83a39fa9040f (MD5) / Os fungos filamentosos são conhecidos por sua notável capacidade de produção de enzimas, particularmente as de degradação de material vegetal. O campo de aplicações industriais destas enzimas tem crescido consideravelmente, especialmente em relação às celulases, que tem sido extensivamente estudadas visando à sacarificação da celulose para a obtenção de etanol de segunda geração. Os fungos endofíticos estão entre os potenciais produtores de enzimas de degradação de material vegetal, são pouco estudados neste sentido e, uma vez que colonizam os tecidos vegetais, suas enzimas devem apresentar características interessantes do ponto de vista do ataque aos componentes da parede celular. Dentro deste contexto, o presente estudo teve por finalidade a prospecção de celulases, xilanases, pectinases e amilases entre fungos endofíticos, bem como estudos da produção e das características das enzimas. Inicialmente, 14 fungos endofíticos foram cultivados por fermentação estado sólido (FES) em bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo (1:1 m/m), durante 7 dias, a 28 °C. Nesta etapa, 8 fungos se destacaram na produção de celulases e foram posteriormente cultivados, em FES, em outras misturas de substratos lignocelulósicos. Os isolados Botryosphaeria sp. AM01 e Saccharicola sp. EJC04 foram os mais versáteis em relação à produção das enzimas em diferentes meios, sendo selecionados para dar continuidade ao trabalho. A partir desta etapa foram focadas as produções de celulases e xilanases, visando à aplicação destas enzimas em trabalhos futuros envolvendo a sacarificação de materiais lignocelulósicos. O substrato selecionado foi composto por farelo de algodão e farelo de trigo e a influência do tempo de cultivo, da concentração de inóculo e da umidade inicial do substrato foram avaliadas, pelo cultivo em... / Filamentous fungi are known for their remarkable ability for enzymes production, particularly those for plant material degradation. The field of industrial applications of these enzymes has increased considerably, particularly regarding to cellulases which have been extensively studied for cellulose saccharification aiming the production of second generation ethanol. Endophytic fungi are among the potential producers of enzymes for plant material degradation. They are underexplored in this sense and, once they colonize the plant tissues. Their enzymes should present interesting features from the point of view of the attack to the cell wall components. In this context, the present study had as purpose the prospecting of cellulases, xylanases, pectinases and amylases among endophytic fungi, as well as studies of the enzymes production and characteristics. As an initial evaluation of enzymes production, 14 endophytic fungi were cultivated under solid state fermentation (SSF) in sugar cane bagasse and wheat bran (1:1 w/w), for 7 days, at 28 ºC. In this phase, 8 fungi stood out and were subsequently cultivated by SSF, in other mixtures of lignocellulosic substrates. The isolates Botryosphaeria sp. AM01 and Saccharicola sp. EJC04 were the most versatile in relation to enzymes production on different substrates and were selected to continue the work. From this stage on the productions of cellulases and xylanases were focused, aiming the application of these enzymes in future studies involving the saccharification of lignocellulosic materials. The selected substrate was composed by cotton bran and wheat bran and the influence of cultivation time, concentration of inoculum and substrate initial moisture were evaluated, by FES.For almost all the enzymes produced by the two fungi, the peak of production occurred in 192h or... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-30T19:41:54Z No. of bitstreams: 1 TeseFMC.pdf: 10316673 bytes, checksum: f573f766bc0883a633c51238239a4856 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:35:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseFMC.pdf: 10316673 bytes, checksum: f573f766bc0883a633c51238239a4856 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:35:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseFMC.pdf: 10316673 bytes, checksum: f573f766bc0883a633c51238239a4856 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T14:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseFMC.pdf: 10316673 bytes, checksum: f573f766bc0883a633c51238239a4856 (MD5) Previous issue date: 2015-03-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / The second generation ethanol (2G) production from sugarcane bagasse is a promising strategy to increase ethanol production per hectare. The 2G ethanol production comprises the steps of biomass pretreatment, hydrolysis of lignocellulose polymers into simple sugars, fermentation and purification. Aiming to reduce 2G ethanol production costs, the development of more efficient bioprocesses for the production of cellulase with high specificity to lignocellulose hydrolysis is needed. Therefore, the goal of this work was finding the cultivation condition more favorable to the production of enzymatic cocktails with higher performance on sugarcane bagasse hydrolysis and 2G ethanol production. In order to achieve this, the implementation of strategies to improve the bioprocess for cellulase production by Aspergillus niger in a stirred tank bioreactor was carried out. The enzymatic production under a new fermentation method, referred to as sequential fermentation (FSeq), was compared to the conventional submerged fermentation method in both shake flasks and stirred tank bioreactor. Experiments were performed to evaluate the effect of the fermentation method, agitation speed, pH control, sugarcane bagasse pretreatment and particle size, and impeller type on enzyme production using sugarcane bagasse as substrate. The highest enzymes production in cultivations using Rushton turbine impeller were 1,599 and 4,212 IU.L-1 for endoglucanase and xylanase, respectively, in cultivations under the new FSeq method, using steam explosion pretreated sugarcane bagasse of particle sizes smaller than 0.5 mm, agitation speed of 700 rpm, aeration of 0,5 vvm and pH 5.0. Cultivations carried out using the Elephant ear up-pumping flow impeller allowed higher enzymes production of 2,712 and 5,837 IU.L-1 for endoglucanase and xylanase, respectively. Given the superior performance of FSeq method in comparison to the FSm method, the decision was made to evaluate the FSeq method in cultivations employing different Aspergillus sp strains and with different lignocellulosic substrates, such as wheat bran, soybean meal, and mixtures of wheat bran and sugarcane bagasse, in shake flasks cultivations. Besides the steam-explosion pretreatment of the sugarcane biomass, which had shown to be favorable to endoglucanase production, the liquid hot water pretreatment was also evaluated, which was found to be favorable to xylanase induction. The enzymatic cocktails produced were employed on sugarcane bagasse hydrolysis, combined with a commercial enzyme, and the extracts produced under the FSeq method resulted in a percentual hydrolysis gain about 10% higher than FSm cocktails. Moreover, the 2G ethanol production from sugarcane bagasse hydrolysates by FSeq cocktails were up to 7% more efficient than the ethanol production using FSm sugarcane bagasse hydrolysates. The results obtained here validate the new sequential fermentation method as a promising strategy for the production of enzymatic cocktails with higher enzymatic activities as well as with higher performance on sugarcane bagasse hydrolysis and 2G ethanol production in comparison to the FSm method. The findings concerning the effects of different operational variables and cultivation methods on (hemi)cellulolytic enzymes production in a stirred tank bioreactor will contribute to the development of three-phasic cultivation systems employing different types of lignocellulosic biomass in bioreactors. / A produção de etanol de segunda geração (2G) a partir do bagaço de cana-de-açúcar é uma estratégia promissora para aumentar a produção de etanol sem necessidade do aumento da área de plantio de cana. A produção do etanol 2G compreende as etapas de pré-tratamento do material lignocelulósico, hidrólise dos polímeros constituintes da lignocelulose à açúcares simples, fermentação alcoólica e purificação. Em busca da redução de custos no processo de produção de etanol 2G, há a demanda de desenvolvimento de bioprocessos mais eficientes para a produção de celulases e de coquetéis enzimáticos com maior atividade específica na hidrólise de materiais lignocelulósicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar a seleção das condições de cultivo mais favoráveis à produção de complexos enzimáticos com altos títulos enzimáticos e melhor desempenho na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol 2G. Para tal, a implementação de estratégias de melhoria do bioprocesso de produção de celulases por Aspergillus niger em biorreator tipo tanque agitado foi realizada. A produção enzimática por um novo método de cultivo, denominado fermentação sequencial (FSeq), foi comparada com a do método de cultivo submerso convencional (FSm) em cultivos em frascos agitados e em biorreatores tipo tanque agitado e aerado. Cultivos foram realizados para avaliação do efeito do método de cultivo, frequência de agitação, controle de pH, prétratamento do bagaço de cana e de seu tamanho de partícula e do tipo de impelidor utilizado na produção enzimática utilizando bagaço de cana como substrato indutor. A maior produção enzimática foi de 1.599 e 4.212 UI.L-1 de endoglucanase e xilanase, respectivamente, obtida em cultivos conduzidos com impelidor turbina de Rushton pelo método FSeq, utilizando bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor de tamanho de partículas menores que 0,5 mm, frequência de agitação de 700 rpm, aeração de 0,5 vvm e pH fixo em 5,0. Cultivos empregando um impelidor tipo orelha de elefante com escoamento ascendente resultaram em produções enzimáticas ainda mais altas, de 2.712 e 5.837 UI.L-1 de endoglucanase e xilanase, respectivamente. Dados os resultados superiores obtidos em cultivos conduzidos pelo novo método FSeq, foi decidido avaliar o método de cultivo FSeq utilizando diferentes linhagens de Aspergillus sp e também em cultivos utilizando diferentes materiais lignocelulósicos como substrato indutor, como farelo de trigo, farelo de soja, e combinações entre farelo de trigo e bagaço de cana-de-açúcar, em frascos agitados. Além do método de pré-tratamento por explosão a vapor, o qual se mostrou vantajoso para a produção de endoglucanases, o prétratamento hidrotérmico também foi avaliado na produção enzimática pelo método FSeq, o qual se mostrou vantajoso para a indução de xilanases. Os coquetéis enzimáticos produzidos foram aplicados na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar, em combinação com um coquetel enzimático comercial, e um melhor desempenho de hidrólise foi obtido com os coquetéis produzidos pelo novo método de fermentação FSeq em comparação com os produzidos por FSm, representando ganhos percentuais de hidrólise de até 10%. Além disso, a produção de etanol 2G a partir de bagaço de cana-de-açúcar hidrolisado com coquetéis enzimáticos produzidos por FSeq resultou em eficiência até 7% maior do que a produção de etanol a partir do bagaço hidrolisado por coquetéis produzidos por FSm. Os resultados obtidos validam que o novo método de fermentação sequencial favorece a produção de coquetéis enzimáticos não somente com maiores atividades enzimáticas, mas também com melhor desempenho no processo de produção de etanol 2G a partir de bagaço de cana-de-açúcar. Os resultados relacionados aos efeitos das variáveis operacionais e do método de cultivo na produção enzimática devem contribuir para o desenvolvimento de sistemas de cultivos trifásicos empregando diferentes tipos de materiais lignocelulósicos em biorreatores.

As celulases e as xilanases são enzimas que hidrolisam a celulose e a xilana, respectivamente, contidas nos resíduos lignocelulósicos. A possibilidade de aplicar estas enzimas na produção de etanol vem sendo objeto de diversos estudos. No entanto, ainda não há uma tecnologia economicamente viável para a produção deste biocombustível a partir da biomassa lignocelulósica. Entre os microrganismos que apresentam altos títulos para estas enzimas, incluem-se linhagens de Penicillium echinulatum; porém, ainda faltam dados de sua fisiologia e estudos da produção de enzimas em biorreator. Neste trabalho, empregou-se a linhagem mutante celulolítica desreprimida S1M29 de P. echinulatum e o meio de cultivo foi composto por celulose, sacarose, solução de sais, Tween 80, farelo trigo e farelo de soja. Avaliou-se o efeito de diferentes temperaturas e pHs na produção das enzimas. O efeito da concentração da celulose sobre as atividades enzimáticas foi avaliada em regime descontínuo (RD) e regime descontínuo alimentado (RDA). Verificou-se que a temperatura mais apropriada para a produção de celulases e xilanases é de 28ºC e dentre os valores de pHs avaliados, o pH 6,0 apresentou a maior produção das enzimas. O aumento da concentração da celulose no RD proporcionou maiores atividades para endoglicanases, porém o mesmo não foi obtido para xilanases. Para FPA (Filter Paper Activity), aumentos proporcionais nas atividades foram obtidos somente com concentrações de até 3% de celulose em RD, condição que também proporcionou as maiores atividades de - glicosidases. O RDA incrementou as atividades de FPA, endoglicanases e xilanases, mas não de -glicosidases. Estes resultados contribuem para a otimização de processos e para a produção econômica de enzimas por P. echinulatum, visando o desenvolvimento de tecnologias economicamente viáveis para produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-11T13:29:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Laisa dos Reis.pdf: 1870988 bytes, checksum: 956ace97d10d44f22cb5eba7cea275d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-11T13:29:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Laisa dos Reis.pdf: 1870988 bytes, checksum: 956ace97d10d44f22cb5eba7cea275d1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cellulases and xylanases are enzymes that hydrolyze cellulose and xylan respectively, which are found in lignocellulosic residues. Although the applicability of these enzymes in the ethanol production has been the subject of several studies, an economically viable technology for the production of biofuel from lignocellulosic biomass is currently not available. Strains of Penicillium echinulatum are among the microorganisms that have high titers of these enzymes. However, data related to physiology and enzyme production in bioreactor for such strains are still missing. A cellulolytic mutant strain of P. echinulatum S1M29 and a culture medium composed of cellulose, sucrose, salt solution, Tween 80, wheat bran and soybean meal were used in this study. The effect of different temperatures and pHs during the enzymes production was evaluated. The effect of cellulose concentration in the enzymatic activity was evaluated in batch cultivation (BC) and fed-batch cultivation (FBC). It was found that the appropriate temperature for the production of cellulases and xylanases is 28°C, while the higher enzyme production occurred at pH 6.0. The high cellulose concentration in BC provided the greatest activities for endoglicanases, but the same result was not obtained for xylanases. For Filter Paper Activity (FPA), proportional increases in activity were obtained only with concentrations up to 3% of cellulose in BC, which is also linked to the highest activities for -glucosidases. FBC increased the activities of FPA, endoglucanases and xylanases, but it did not increase the -glucosidases activities. Such results contribute towards the optimization of enzyme production using P. echinulatum and the development of economically viable technologies for the production of ethanol from lignocellulosic materials.

O estudo de fungos celulolíticos tem-se mostrado relevante, tendo em vista o interesse econômico do complexo celulases, especialmente na indústria têxtil e, mais recentemente, para propósitos energéticos. No presente trabalho, a fusão de protoplastos foi utilizada para combinar genótipos de mutantes parcialmente desreprimidos para produção de celulases de Penicillium echinulatum (9A02S1B9) e richoderma harzianum (AS5CH3), utilizando a técnica do doador morto, buscando-se obter recombinantes com maior produção de celulases. Nesta estratégia, ambas as linhagens tiveram seu micélio tratado com Glucanex 0,01 g/mL, para quebra da parede celular. Os protoplastos resultantes da linhagem portadora de marca de resistência ao benomil (9A02S1B9) foram inativados por calor (técnica do doador morto) de 60oC antes da etapa de fusão, a qual após foi induzida por PEG4000 e Ca2+, com protoplastos da linhagem sensível ao benomil (AS5CH3). A partir de um produto de fusão, foram selecionados 24 sub-clones, após estratégias de estabilização e seleção para precocidade e eficiência na formação de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri. Os produtos de fusão apresentaram morfologia e esporulação semelhantes a um dos parentais, sendo treze semelhantes à Penicillium, nove semelhantes à Trichoderma e dois mostrando formas alteradas. Os produtos de fusão que segregaram para morfologia de T. harzianum apresentaram a característica de resistência ao benomil, sendo capazes de crescer e esporular em meios contendo até 100 μg/mL deste inibidor. A morfologia, o perfil de bandas, obtidos por RAPD, e o padrão de secreção de celulases dos produtos de fusão foram sempre mais semelhantes a um dos parentais. Os clones apresentaram variação quanto ao halo de hidrólise de celulose em placas de Petri e na atividade sobre papel filtro FPAases, -glicosidase ou endoglicanase, quando crescidas em cultivo submerso ou em estado sólido. Desta variabilidade, verificaram-se aumentos significativos para algumas das linhagens em relação aos parentais. A aplicação da metodologia de fusão de protoplastos para obter recombinantes entre P. echinulatum e T. harzianum, empregando a técnica do doador morto, mostrou-se adequada na geração de variabilidade para produção de celulases. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-02-12T12:22:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Barbara Lizandra Perini de Souza.pdf: 2248330 bytes, checksum: 2a20339f50d031a74d2a889ddbe2435e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T12:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Barbara Lizandra Perini de Souza.pdf: 2248330 bytes, checksum: 2a20339f50d031a74d2a889ddbe2435e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study of cellulolytic fungi has proved to be important, considering economic interest of the cellulase complex, especially in the textile industry and, more recently, for energy purposes. In this work, the protoplast fusion was used to combine genotypes of mutants partially non repressed for cellulases production of Penicillium echinulatum (9A02S1B9) and Trichoderma harzianum (AS5CH3) using the technique dead donor, intending to obtain recombinants with higher cellulases production. In this strategy, both strains had their mycelium treated with Glucanex  0,01 g/mL, to lyse the cell wall. The protoplast obtained from the benomyl-resistant (9A02S1B9) were heat-inactivated (technique of dead donor) at 60ºC, before the step of fusion, induced by PEG4000 and Ca2+, with protoplast of the sensitive-benomyl strain (AS5CH3). Twenty four sub-clones were selected from one fusion product, after stabilization and selection strategies for precocity and efficiency in the formation clearing zones of by cellulose hydrolysis in Petri plates. The fusion products showed similar morphology and sporulation to one of parents, thirteen similar to Penicillium, nine similar to Trichoderma and two showed altered forms. The fusion products which segregate to the morphology of T. harzianum resistance to benomyl, being able to grow and sporulate in media containing up to 100 μg/mL of this inhibitor. The morphology, the profile of bands, obtained by RAPD, and the pattern of cellulase secretion by fusion products were ever more similar to one of parents. The fusants presented variation in the halo of cellulose hydrolysis in Petri plates, and in the activity on filter paper (FPAases), - glicosidase or endoglicanase, when grown submerged cultivation or solid state. From this variability, significant improvement was verified for some of the parental strains. The application of the protoplast fusion methodology to obtain recombinant between P. echinulatum and T. harzianum, using the technique of dead donor, has proved to be adequate to generate variability in the production of cellulases.

O emprego de enzimas lignocelulolíticas secretadas por microrganismos para a produção de etanol de segunda geração tem motivado pesquisas na área da engenharia de processos fermentativos, genômica e secretômica. Entre os microrganismos com potencial para a produção de celulases destacam-se variantes genéticos do fungo filamentoso Penicillium echinulatum caracterizados por produzirem altos títulos enzimáticos. Neste trabalho, estudouse a secretômica da linhagem selvagem 2HH e do mutante S1M29 de P. echinulatum, em cultivo submerso, empregando diferentes fontes de carbono: glicose, glicerol, celulose e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. Análises enzimáticas possibilitaram identificar que P. echinulatum produz celulases, hemicelulases, esterases e, em menor proporção, pectinases e amilases. Outrossim, os maiores títulos enzimáticos para a maioria das enzimas foram verificados na linhagem mutante. Nos meios formulados com bagaço de cana-de-açúcar ou celulose verificou-se a indução das maiores produções enzimáticas para ambas as linhagens. A análise do secretoma por 1D-PAGE seguido de LCMS/ MS das amostras de 96 horas de cultivo permitiu identificar que em ambas as linhagens há predominância de enzimas CAZy, sendo celulases, hemicelulases e enzimas degradadoras de parede celular fúngica as mais predominantes. Celobiohidrolases, endoglicanases, β-glicosidases, xilanases, β-xilosidases e mananases foram identificadas e, em quantidades menores, ligninases, pectinases, amilases, esterases e solenina, entre outras proteínas (adesão, chaperonas, oxidoredutases, proteases, peptidases, lipases, glutaminases e hipotéticas). Os meios elaborados com glicose ou glicerol foram utilizados pelo fungo para a produção de amilases, ligninases e enzimas degradadoras da parede celular fúngica. Destaca-se a secreção 2 a 3 vezes maior de celulases pela linhagem mutante, sendo que o meio de cultivo elaborado com bagaço de cana-de-açúcar proporcionou a secreção de maiores quantidades de celulases para o mutante. Nesta condição, o complexo celulolítico da linhagem S1M29 constitui-se de 55% de celobiohidrolases, 38% de endoglicanases e 1% de β-glicosidases. Estes dados sugerem que durante o melhoramento genético do fungo ocorreram mudanças, embora não direcionais, possivelmente em nível da regulação da expressão gênica, modificações póstraducionais e alterações na capacidade para secretar proteínas extracelulares que tornaram a linhagem mutante S1M29 com potencial para ser empregada na hidrólise de lignocelulósicos. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-02-12T12:51:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Willian Daniel Hahn Schneider.pdf: 2455680 bytes, checksum: 6b4ce5e7e2a0bd9fc7714d8979b4ee29 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T12:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Willian Daniel Hahn Schneider.pdf: 2455680 bytes, checksum: 6b4ce5e7e2a0bd9fc7714d8979b4ee29 (MD5) / The use of lignocellulolytic enzymes secreting by microorganisms for the production of second-generation ethanol has motivated research in the field of fermentation processes engineering, genomics and secretomics. Among the microorganisms with the potential for cellulases production are genetic variants of the filamentous fungus Penicillium echinulatum characterized by produce high enzymatic titers. In this work, it was studied the secretome of the wild type 2HH and mutant S1M29 of P. echinulatum in submerged cultivation on different carbon sources: glucose, glycerol, cellulose and sugar cane bagasse pretreated by steam explosion). Enzymatic analysis allowed verifying that P. echinulatum produces cellulases, hemicellulases, esterases, and minor proportion, pectinases and amylases. Furthermore, the major enzymes titers for most enzymes dosed were verified in the mutant strain. It was verified in the media formulated with sugar cane bagasse or cellulose the induction of the highest enzyme production for both strains. The analysis of secretome by 1DPAGE followed by LC-MS/MS, of samples collected at 96 hours of cultivation, showed that in both strains there is a predominance of CAZy enzymes, being cellulases, hemicellulases and fungal cell wall degrading enzymes the most prevalent. Cellobiohydrolases, endoglucanases, β-glucosidase, xylanase, endoxylanase, β-mannanases and xylosidases were identified and, in smaller amounts, ligninases, pectinases, amylases, esterases and swollenin, among other proteins (adhesion, chaperones, oxidoreductases, proteases, peptidases, lipases, glutaminases and hypothetical). The media elaborated with glucose or glycerol were used for producing of amylases, ligninases and fungal cell wall degrading enzymes. Highlights the secretion of 2-3 times more cellulases by the mutant, being the medium prepared with sugar cane bagasse afforded the secretion of large cellulases quantities for the mutant. In this condition, the cellulolytic complex of S1M29 strain consists of 55% cellobiohydrolases, 38% endoglucanases and 1% β-glucosidase. These data suggest that during the genetic improvement of the fungus changes occurred, although not directional, possibly at the level of regulation of gene expression, post-translational modifications and changes in the ability to secrete extracellular proteins, that have made the mutant S1M29 a potential strain to be employed in hydrolysis of lignocellulose.

Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-10-01T16:43:18Z No. of bitstreams: 1 Tese Carla Eliana Todero Ritter.pdf: 192233 bytes, checksum: 7751f00ffe27681835ffe3c324f029fa (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-01T16:43:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Carla Eliana Todero Ritter.pdf: 192233 bytes, checksum: 7751f00ffe27681835ffe3c324f029fa (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES.

Orientador: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: Os fungos filamentosos são conhecidos por sua notável capacidade de produção de enzimas, particularmente as de degradação de material vegetal. O campo de aplicações industriais destas enzimas tem crescido consideravelmente, especialmente em relação às celulases, que tem sido extensivamente estudadas visando à sacarificação da celulose para a obtenção de etanol de segunda geração. Os fungos endofíticos estão entre os potenciais produtores de enzimas de degradação de material vegetal, são pouco estudados neste sentido e, uma vez que colonizam os tecidos vegetais, suas enzimas devem apresentar características interessantes do ponto de vista do ataque aos componentes da parede celular. Dentro deste contexto, o presente estudo teve por finalidade a prospecção de celulases, xilanases, pectinases e amilases entre fungos endofíticos, bem como estudos da produção e das características das enzimas. Inicialmente, 14 fungos endofíticos foram cultivados por fermentação estado sólido (FES) em bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo (1:1 m/m), durante 7 dias, a 28 °C. Nesta etapa, 8 fungos se destacaram na produção de celulases e foram posteriormente cultivados, em FES, em outras misturas de substratos lignocelulósicos. Os isolados Botryosphaeria sp. AM01 e Saccharicola sp. EJC04 foram os mais versáteis em relação à produção das enzimas em diferentes meios, sendo selecionados para dar continuidade ao trabalho. A partir desta etapa foram focadas as produções de celulases e xilanases, visando à aplicação destas enzimas em trabalhos futuros envolvendo a sacarificação de materiais lignocelulósicos. O substrato selecionado foi composto por farelo de algodão e farelo de trigo e a influência do tempo de cultivo, da concentração de inóculo e da umidade inicial do substrato foram avaliadas, pelo cultivo em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Filamentous fungi are known for their remarkable ability for enzymes production, particularly those for plant material degradation. The field of industrial applications of these enzymes has increased considerably, particularly regarding to cellulases which have been extensively studied for cellulose saccharification aiming the production of second generation ethanol. Endophytic fungi are among the potential producers of enzymes for plant material degradation. They are underexplored in this sense and, once they colonize the plant tissues. Their enzymes should present interesting features from the point of view of the attack to the cell wall components. In this context, the present study had as purpose the prospecting of cellulases, xylanases, pectinases and amylases among endophytic fungi, as well as studies of the enzymes production and characteristics. As an initial evaluation of enzymes production, 14 endophytic fungi were cultivated under solid state fermentation (SSF) in sugar cane bagasse and wheat bran (1:1 w/w), for 7 days, at 28 ºC. In this phase, 8 fungi stood out and were subsequently cultivated by SSF, in other mixtures of lignocellulosic substrates. The isolates Botryosphaeria sp. AM01 and Saccharicola sp. EJC04 were the most versatile in relation to enzymes production on different substrates and were selected to continue the work. From this stage on the productions of cellulases and xylanases were focused, aiming the application of these enzymes in future studies involving the saccharification of lignocellulosic materials. The selected substrate was composed by cotton bran and wheat bran and the influence of cultivation time, concentration of inoculum and substrate initial moisture were evaluated, by FES.For almost all the enzymes produced by the two fungi, the peak of production occurred in 192h or... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Rubens Monti / Banca: Aldo José Pinheiro Dillon / Resumo: O uso e produção de enzimas têm se tornado uma das áreas de maior interesse da indústria biotecnológica. As enzimas obtidas de microrganismos por processos fermentativos têm sido amplamente pesquisadas e utilizadas em todo mundo. A aplicação de enzimas na extração de óleos é uma alternativa consistente aos processos convencionais, por se tratar de um processo que consome menor energia, melhora a qualidade de vários produtos como, por exemplo, o óleo de oliva, e causa um mínimo de impacto ambiental. Para realizar a extração do óleo, que se encontra nos vacúolos intracelulares, há a necessidade do rompimento das paredes e membranas celulares. Os tratamentos mecânico e térmico causam a ruptura das estruturas celulares, porém, não são suficientes, já que parte do óleo permanece na célula, sem ser extraído. Para aumentar o rendimento no processo de extração do óleo se faz necessário a utilização de um complexo multienzimático que irá atuar sobre os componentes da parede, facilitando a sua liberação. O objetivo deste trabalho foi utilizar uma mistura de enzimas contendo celulases, xilanases e pectinases produzidas por microrganismos para extração de óleos essenciais de plantas. As enzimas foram produzidas pelos fungos T. reesei Rut C-30 e Aspergillus niger, em processo fermentativo incubado em biorreator de 10 L. A composição do meio de cultura, bem como as condições de cultivo, foram estabelecidas a fim de se obter maior produção de enzimas. A produção de enzimas em biorreator para a linhagem Rut C-30 de T. reesei mostrou os melhores níveis em pH 4,0, temperatura de 28º C, agitação de 400 rpm e taxa de aeração de 1,5 vvm, obtendo uma produção de 2,01 U/mg, 1,79 U/mg e 0,2 U/mg de celulase, xilanase e pectinase, respectivamente. A produção utilizando A. niger apresentou melhores níveis enzimáticos nas mesmas condições usadas para T. reesei e foram: 1,21 U/mg, 2,96 U/mg e 4,2 U/mg de celulase, / Abstract: The use and production of enzyme have become one of the areas of great interest of the biotechnological industry. The enzymes produced by microorganisms in fermentation processes have been widely searched and used in the world. The enzyme application in the oil extraction is a consistent alternative to the conventional processes, because represents a process that consumes less energy, improves the quality of some products as, for example, the olive oil, and cause a minimum of environmental impact. To perform the extraction of the oil, which is found in the intracellular vacuoles, it is necessary break the cellular and membranes walls. The mechanical and thermal treatments cause the rupture of the cellular structures, however, they are not enough, since part of the oil remains in the cell, without be extracted. To increase the yield in the process of oil extraction is necessary to use a multienzymatic complex that will act on the components of the wall, facilitating its release. The objective of this work was to utilize a enzyme mixture containing cellulases, xylanases and pectinases produced by microorganisms to extract plants essential oils. The enzymes had been produced by the microorganisms Trichoderma reesei QM9414 and T. reesei Rut C-30 and Aspergillus niger, in fermentative process incubated in a 10L bioreactor. The composition of the culture medium, and the culture conditions were established in order to obtain higher level of enzyme production. The enzyme production in bioreactor by T. reesei Rut C-30 showed the best levels in pH 4.0, temperature of 28º C, agitation of 400 rpm and tax of aeration of 1,5 vvm, and obtaining production of 2.01 U/mg, 1.79 U/mg and 0.2 U/mg of cellulase, xylanase and pectinase, respectively. The production using A. niger showed the best leves at the same conditions used to T. reesei and the were: 1.21 U/mg, 2.96 U/mg and 4.2 U/mg of cellulase, xylanase and pectinase, respectively. Melampodium divaricatum (Rich. / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Adalberto Pessoa Júnior / Banca: Gustavo O. Bonilla / Resumo: Devido à crescente demanda por combustíveis, pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o intuito de se obterem novos tipos de biocombustíveis provenientes de fontes renováveis. O etanol celulósico tem sido cogitado como complemento da produção de etanol, entretanto, a viabilização desse processo requer o desenvolvimento de tecnologias de sacarificação dos materiais lignocelulósicos, por via bioquímica, como a enzimática, ou por métodos abióticos. Os fungos filamentosos são um grupo de microrganismos secretores de enzimas que atuam na degradação de biomassa. As enzimas do complexo celulolítico e hemicelulolítico clivam as ligações que formam os polímeros de polissacarídeos liberando hexoses e pentoses fermentescíveis a etanol, porém, enzimas acessórias como a celobiose desidrogenase, são importantes na eficiência do processo. O presente projeto visou o isolamento de cepas fúngicas termofílicas com habilidade de secretar aquelas enzimas, assim como, a obtenção de preparados enzimáticos com estabilidade às variações de temperatura e pH que ocorrem durante as etapas da hidrólise. Foram isoladas 32 linhagens de fungos capazes de crescer em temperaturas entre 45 e 60ºC, tendo sido selecionadas cinco para as etapas seguintes do trabalho (Thermomyces lanuginosus S1, T. lanuginosus S3, Rasamsonia emersonii S10, T. lanuginosus FZI e R. emersonii BC) em função de apresentarem crescimento a 60ºC. Entre essas linhagens, as maiores atividades de β-glicosidase (52 U/g) e endoglucanase (579 U/g) foram obtidas em meio de cultivo da cepa R. emersonii S10 em 240h para ambas as enzimas. A melhor atividade de FPase foi apresentada pelo fungo T. lanuginosus S1 em 168h de cultivo, tendo produzido 262,8 U/g da enzima. O fungo R. emersonii S10 foi o único que apresentou a produção detectável das enzimas avicelase (9,2 U/g) e β-xilosidase (910,7 U/g). Esse isolado também produziu as maiores atividades de xilanase com ... / Abstract: Owing the growing demand for fuels, research is being done with the aim of obtaining new types of biofuels from renewable resources. Cellulosic ethanol, obtained from residual biomass from agricultural and agro-industrial processes has been considered as a complement of ethanol production by decreasing the need for expansion of sugarcane areas. However, the viability of the process requires the development of technologies saccharification of lignocellulosic materials by biochemical route, such as enzymatic or abiotic methods. The filamentous fungi are a group of microorganisms that produce (secretory) of enzymes involved in the degradation of biomass. The enzymes cleave hemicellulolytic and cellulolytic complex connections that form polymers of polysaccharides present in the biomass releasing fermentable hexoses and pentoses to ethanol, however, accessory enzymes such as cellobiose dehydrogenase are important in the process efficiency. This design aimed at the isolation of thermophilic fungal strains with the ability to secrete those enzymes, as well as the enzyme preparations to obtain stability to pH and temperature variations that occur during the hydrolysis step. 32 fungal strains capable of growing at temperatures between 45 and 60 °C were isolated, five were selected to continue the following work steps (Thermomyces lanuginosus S1, T. lanuginosus S3, Rasamsonia emersonii S10, R. emersonii BC and T. lanuginosus FZI) as a function of experiencing growth at 60 °C. Among these strains, the highest activities of β-glucosidase (52 U/g) and endoglucanase (579 U/g) were obtained from the culture medium of strain R. emersonii S10 in 240h for both enzymes. The best activity FPase (cellulase that hydrolyzes filter paper) was presented by the fungus T. lanuginosus S1 in 168h of cultivation, having produced 262.8 U/g enzyme. The R. emersonii S10 was the only fungus that showed detectable avicelase production of enzymes (9.2 U/g) and ... / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Sandra Helena da Cruz / Resumo: As endoglicanases EC 3.2.1.4 são enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas β-1,4 da celulose, resultando na liberação de glicose, celobiose e celo-oligossacarídeos. Empregadas mundialmente em diversos processos industriais, por exemplo, como amaciante de tecidos de algodão e bioestonagem de jeans, na extração de sucos de frutas, na adição em detergentes comerciais, na fabricação de cerveja, e na produção de papel e de etanol. Atualmente, há um grande interesse em enzimas que hidrolisem biomassa lignocelulósica para obtenção de etanol de segunda geração. A imobilização de enzimas em matrizes sólidas oferece muitas vantagens, entre as quais, reuso da enzima, a fácil separação do produto e o aumento da estabilidade operacional. Os objetivos deste trabalho foram: produzir CMCases secretadas por Aspergillus niger e Humicola grisea var. thermoidea em cultivo sólido e submerso; imobilizar CMCases em suporte agarose com diferentes ativações químicas; determinar a estabilidade térmica e as propriedades cinéticas dos derivados obtidos, comparando-os com as enzimas livres; avaliar a capacidade de reuso dos derivados ativos e estáveis e analisar qualitativamente o produto de hidrólise dos substratos celulósicos. O fungo A. niger secretou grandes quantidades de CMCases, 34,1 U.mg-1, em meio Vogel, utilizando pó de bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. O pH 5 foi determinado como o ótimo para a enzima, apresentando instabilidade ao pH 10. Com a utilização de aditivos estabilizante, a trealose a 10% (m/v), manteve, em pH 10, 80% de atividade residual, por 25 horas. Em relação à temperatura, apresentou uma faixa ampla de atividade entre 45°C a 75°C, tendo como temperatura ótima 65°C. O derivado enzimático que ofereceu melhor estabilidade foi aquele em que a imobilização foi conduzida juntamente com o substrato carboximeticelulose (CMC 1%), em... / Abstract: The endoglucanases EC 3.2.1.4 are enzymes that hydrolyze the β-1, 4 glycosidic linkages of the cellulose producing glucose, cellobiose and cello-oligosaccharides. Used worldwide in many industrial processes such as fabric softener and bioestonagem cotton jeans, extraction of fruit juices, in the addition of commercial detergents, in brewing, and the production of paper and ethanol. Currently, there is great interest in enzymes that hydrolyze lignocellulosic biomass to obtain second-generation ethanol. The immobilization of enzymes on solid arrays provides many advantages as the enzyme reuse, easy separation of the product and increased operational stability. The aims of this study were to produce secreted: CMCases produce secreted by Aspergillus niger and Humicola grisea var. thermoidea in solid and submerged cultivation; CMCases immobilized on agarose support with different chemical activations; determine the thermal stability and kinetic properties of the derivatives obtained comparing them with the free enzyme; evaluate the reuse capacity assets and stable derivatives and qualitatively analyze the product of hydrolysis of cellulosic substrates. The fungus A. niger secreted large amounts of CMCases, 34.1 U.mg-1 amid Vogel, using powdered sugarcane bagasse as a carbon source. The pH of 5 was determined as the optimum for the enzyme, presenting instability to pH 10. With the use of stabilizing additives, the 10% trehalose (w / v), kept at pH10, 80% residual activity for 25 hours. Regarding temperature there was a broad activity range from 45 °C to 75 °C and the optimum temperature as 65 °C. The enzyme derivative which offered better stability was one in which immobilization was conducted with the carboxymethycellulose substrate (1% CMC) in agarose support Glutaraldehyde (70% of reactive groups), preserving catalytic activity of 35% at 60 °C for 250 hours. Through qualitative TLC analysis, it... / Doutor