Orientador: Roberto da Silva / Banca: Michel Brienzo / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Resumo: Celulases são essenciais para a hidrólise de materiais lignocelulósicos visando à produção de etanol de segunda geração. A fermentação em estado sólido é um processo que proporciona altas concentrações de enzimas que podem ser aplicadas nessa hidrólise. O objetivo do presente trabalho foi produzir enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas empregando os fungos Trichoderma reesei e Myceliophthora thermophila por fermentação em estado sólido em biorreator de leito empacotado e aplicar essas enzimas, combinadas ou não, na sacarificação de bagaço de cana-deaçúcar. Foram empregados bagaço in natura, bagaço pré-tratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino e bagaço com pré-tratamento hidrotérmico. A produção de enzimas foi avaliada pelas atividades CMCase, atividade sobre papel de filtro (FPU), xilanase e β-glicosidase. Para os experimentos de sacarificação com extratos dos fungos não combinados, foi adotado um planejamento de superfície de resposta central composto com 5 repetições do ponto central, tendo como fatores o volume de extrato enzimático e o tempo de hidrólise. Os resultados com os dois extratos indicaram como ótimos um volume de 7,0 mL e 6 horas de hidrólise para os bagaços in natura, pré-tratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino e com pré-tratamento hidrotérmico, exceto o extrato de M. thermophila que resultou em 5,0 mL e 6,8 horas para o bagaço hidrotérmico. Os melhores resultados de conversão em glicose com os dois extratos foram obtidos com o bagaço prétratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino, tendo sido de 34,0 % para M. thermophila e de 21,2 % para T. reesei. A partir destes resultados, foi elaborado um planejamento fatorial completo para os experimentos de hidrólises empregando coquetéis enzimáticos. Os fatores empregados foram composição (1:1; 1:3; 3:1) e temperatura... / Abstract: Cellulases are essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials aiming to the production of second generation ethanol. The solid-state fermentation is a process that allows obtaining high concentrations of enzymes which can be applied in this hydrolysis. The purpose of the current work was producing cellulolytic and hemicellulolytic enzymes by employing the fungi Trichoderma reesei and Myceliophthora thermophila by solid-state fermentation in packed-bed bioreactor and apply these enzymes, combined or not, in the saccharification of sugarcane bagasses. Bagasse in natura, bagasse pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium and bagasse with hydrothermal pretreatment have been employed. The enzymes production was evaluated by CMCase, filter paper activitie (FPU), xylanase and β-glucosidase activities. For the saccharification experiments with extracts from both fungi no-combined, it has been adopted a central-composed response surface design with 5 replications of the central point, having as factors the volume of enzyme extract and the duration of hydrolysis. The results with both extracts indicated as optimal a volume of 7,0 mL and 6 hours of hydrolysis for the bagasses in natura, pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium and with hydrothermal pretreatment, except the extract of M. themophila that resulted in 5,0 mL and 6,8 hours for the hydrothermal bagasse. The best results of conversion in glucoses with both extracts were obtained with the bagasse pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium, which have been 34,0 % for M. themophila and 21,2 % for T. reesei. From these results, it has been elaborated a full factorial design for the hydrolysis experiments employing enzymatic cocktails. The factors used were composition (1:1; 1:3; 3:1) and temperature (45, 55, 65 ºC and alternated). The best result was obtained by... / Mestre

Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, tendo as enzimas como as celulases, grande importância econômica e diferentes aplicações industriais. O objetivo deste trabalho foi à obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Um total de 46 isolados foram obtidos de bagaço de cana coletados em 3 destilarias. Quinze apresentaram a formação de halo pela coloração com vermelho Congo, os quais foram avaliados quanto a atividade celulolítica (F1 a F15), tendo como referência o fungo Trichoderma ressei 9414. Os isolados foram cultivados em bagaço de canade- açúcar 1% e conduziu-se a determinação da atividade de endoglucanase (CMCase) empregando-se carboximetilcelulose (CMC) como substrato, e da atividade da celulase total (FPase) empregando papel de filtro como substrato. Após 21 dias de cultivo em bagaço de canade- açúcar nenhum dos isolados apresentou atividade da celulase total maior que T. ressei QM9414. Destes isolados, F9 apresentou maior valor para a atividade da celulase total após 7 dias de cultivo. Com relação a atividade da endoglucanase, no sétimo dia de cultivo o isolado F27 obteve melhor resultado que T. ressei QM 9414. Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414). Os resultados mostram o grande potencial da biodiversidade existente em nichos industriais, na busca de linhagens com potencialidade na hidrólise enzimática de substrato lignocelulósico, como o bagaço de cana- de-açúcar. / Biotechnological processes are achieving increased relevance in today\'s technological development, being enzymes such as celullases, of great economical importance in different industrial applications. The objective of this work was the isolation and selection of fungi from agroindustrial environment, with capacity of hydrolysing the cellulosic fraction of sugar cane bagasse. Forty six isolates were evatuated for their cellulolytic activity using CMC as carbon source and Cong Red as staining indicator . Fifteen isolates showed halo formation by red Congo staining, and they were evaluated for cellulolytic activity (F1 to F15), using Trichoderma ressei 9414 as a reference. The isolates were cultivated in 1% sugar cane bagasse and the cellulolytic activities were assessed by the determination of endoglucanase activity (CMCase) using carboximetilcelulose (CMC) as substrate, and the total celullase activity (FPase) applying filter paper as substrate. After 21 days of cultivation in sugar cane bagasse neither of the isolates showed total cellulase activity higher than T. ressei QM9414. From these isolates, F9 showed higher total cellulase activity after 7 cultivation days. For endoglucanase activity, the isolate F27 showed better result than T. ressei QM 9414 in the seventh cultivation day. For the endoglucanase activity kinetics, the isolates 9, 23 and 27 showed enzymatic activities very close to the reference fungus (QM9414). These results allow to suggest a great biotechnological potential for the biodiversity found in industrial niches, regarding the enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates, namely the sugar cane bagasse.

Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, tendo as enzimas como as celulases, grande importância econômica e diferentes aplicações industriais. O objetivo deste trabalho foi à obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Um total de 46 isolados foram obtidos de bagaço de cana coletados em 3 destilarias. Quinze apresentaram a formação de halo pela coloração com vermelho Congo, os quais foram avaliados quanto a atividade celulolítica (F1 a F15), tendo como referência o fungo Trichoderma ressei 9414. Os isolados foram cultivados em bagaço de canade- açúcar 1% e conduziu-se a determinação da atividade de endoglucanase (CMCase) empregando-se carboximetilcelulose (CMC) como substrato, e da atividade da celulase total (FPase) empregando papel de filtro como substrato. Após 21 dias de cultivo em bagaço de canade- açúcar nenhum dos isolados apresentou atividade da celulase total maior que T. ressei QM9414. Destes isolados, F9 apresentou maior valor para a atividade da celulase total após 7 dias de cultivo. Com relação a atividade da endoglucanase, no sétimo dia de cultivo o isolado F27 obteve melhor resultado que T. ressei QM 9414. Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414). Os resultados mostram o grande potencial da biodiversidade existente em nichos industriais, na busca de linhagens com potencialidade na hidrólise enzimática de substrato lignocelulósico, como o bagaço de cana- de-açúcar. / Biotechnological processes are achieving increased relevance in today\'s technological development, being enzymes such as celullases, of great economical importance in different industrial applications. The objective of this work was the isolation and selection of fungi from agroindustrial environment, with capacity of hydrolysing the cellulosic fraction of sugar cane bagasse. Forty six isolates were evatuated for their cellulolytic activity using CMC as carbon source and Cong Red as staining indicator . Fifteen isolates showed halo formation by red Congo staining, and they were evaluated for cellulolytic activity (F1 to F15), using Trichoderma ressei 9414 as a reference. The isolates were cultivated in 1% sugar cane bagasse and the cellulolytic activities were assessed by the determination of endoglucanase activity (CMCase) using carboximetilcelulose (CMC) as substrate, and the total celullase activity (FPase) applying filter paper as substrate. After 21 days of cultivation in sugar cane bagasse neither of the isolates showed total cellulase activity higher than T. ressei QM9414. From these isolates, F9 showed higher total cellulase activity after 7 cultivation days. For endoglucanase activity, the isolate F27 showed better result than T. ressei QM 9414 in the seventh cultivation day. For the endoglucanase activity kinetics, the isolates 9, 23 and 27 showed enzymatic activities very close to the reference fungus (QM9414). These results allow to suggest a great biotechnological potential for the biodiversity found in industrial niches, regarding the enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates, namely the sugar cane bagasse.

Submitted by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-02-19T13:34:44Z No. of bitstreams: 5 ric.pdf: 5207435 bytes, checksum: f03a11b8bcdc89eef456751ccb1f74f2 (MD5) license_url: 52 bytes, checksum: 3d480ae6c91e310daba2020f8787d6f9 (MD5) license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) license.txt: 2110 bytes, checksum: b4c884761e4c6c296ab2179d378436d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-02-20T10:28:40Z (GMT) No. of bitstreams: 5 ric.pdf: 5207435 bytes, checksum: f03a11b8bcdc89eef456751ccb1f74f2 (MD5) license_url: 52 bytes, checksum: 3d480ae6c91e310daba2020f8787d6f9 (MD5) license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) license.txt: 2110 bytes, checksum: b4c884761e4c6c296ab2179d378436d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-20T10:28:40Z (GMT). No. of bitstreams: 5 ric.pdf: 5207435 bytes, checksum: f03a11b8bcdc89eef456751ccb1f74f2 (MD5) license_url: 52 bytes, checksum: 3d480ae6c91e310daba2020f8787d6f9 (MD5) license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) license.txt: 2110 bytes, checksum: b4c884761e4c6c296ab2179d378436d4 (MD5) Previous issue date: 2013-09-20 / A pesquisa b?sica e aplicada voltada para o conhecimento e produ??o de celulases e xilanases microbianas constituem-se em valorosa a??o para o desenvolvimento de produtos e processos biotecnol?gicos. Estas enzimas t?m sido utilizadas na ind?stria de alimentos, cervejarias, vin?colas, produ??o de ra??o, ind?stria t?xtil e fabrica??o de papel. A demanda por tais catalisadores tem crescido rapidamente, encorajada principalmente pela ind?stria de biocombust?veis, em especial para a produ??o de etanol de 2? Gera??o. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir enzimas celulol?ticas e xilanol?ticas com o uso de fungos filamentosos de ocorr?ncia natural, utilizando res?duos s?lidos da cadeia produtiva do biodiesel como fontes de carbono. Tr?s linhagens de fungos filamentosos isoladas de amostras ambientais foram avaliadas para produ??o de celulases e xilanases. Como par?metro de compara??o, utilizou-se o Trichoderma reesei CCT2768, linhagem conhecida como produtora de celulases. Dentre as linhagens avaliadas, um isolado denominado Aspergillus sp AN1257 foi o que se destacou para a produ??o de enzimas celulol?ticas e xilanol?ticas, superando inclusive a produ??o de celulases por T. reesei nas mesmas condi??es fermentativas. A fonte de carbono que melhor induziu a produ??o das enzimas investigadas pelo Aspergillus sp AN1257 foi a torta de caro?o de algod?o. Em busca da condi??o ?tima para a produ??o das enzimas estudadas foi realizado um planejamento fatorial e posteriormente aplicado um delineamento composto central rotacional (DCCR). Ap?s a aplica??o das condi??es ?timas para a produ??o enzim?tica desejada, o extrato obtido apresentou valores de 3,12 U/mL para atividade endoglucan?sica e 76,4 U/mL para a atividade xilan?sica. O extrato enzim?tico produzido apresentou atividade promissora quando utilizado na hidr?lise de lignocelulose em alguns res?duos agroindustriais. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2012. / ABSTRACT The basic and applied research focused on the knowledge and production of microbial cellulases and xylanases constitute a valuable action for the development of biotechnology products and processes. These enzymes have been used in the food industry, breweries, wineries, feed production, textile and paper manufacturing. The demand for such catalysts has grown rapidly, encouraged mainly by the biofuels industry, in particular for the production of 2nd Generation ethanol. In this context, the aim of this work was to produce cellulolytic and xylanolytic enzymes using naturally occurring filamentous fungi and solid waste of the biodiesel productive chain as carbon source. Three strains of filamentous fungi isolated from ambient samples have been evaluated for production of cellulases and xylanases. As reference microbial strain, it was used Trichoderma reesei CCT2768, known a good producer of cellulases. Among the strains tested, an isolated named Aspergillus sp AN1257 stood out for the production of cellulolytic and xylanolytic activity, surpassing even the production of cellulases by T. reesei under the same fermentation conditions. The carbon source which better induced the production of the investigated enzymes by Aspergillus sp AN1257 was cottonseed cake. In search of the optimum condition for the production of the investigated enzymes it was performed a factorial design and then it was applied a rotational central composite design (RCCD). After application of optimal condiction for enzyme production, the extract obtained showed values ??of 3.12 U/mL for endoglucanasic activity and 76.4 U/mL for xylanolytic activity. The enzyme extract produced showed promising application when used in the hydrolysis of lignocellulose in some agro-industrial residues.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:36:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8650_Resumo Dissertação Final - Raquel Nunes Fernandes.pdf: 5609 bytes, checksum: 70d1fe1ceffa22fcfc3a4d501f9c4e76 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / CAPES / A utilização de resíduos agroindustriais, como fontes de carbono para a obtenção de enzimas, tem garantido boa produção enzimática e redução dos custos do processo. Neste contexto, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar o crescimento do termofílico Bacillus sp. SMIA-2 e melhorar a secreção de celulases, em cultivos submersos contendo substratos alternativos e baratos como o bagaço de cana-de-açúcar, a água de maceração de milho e a farinha da casca de maracujá. Ao estudar os diferentes tipos de bagaço de cana foi observado que os melhores níveis de atividade específica de avicelase e FPase foram obtidos quando se utilizou o bagaço tratado com hidróxido de potássio. A condição ótima de cultivo, determinada usando a técnica do planejamento composto central (23), foi 0,625% (m/V) de bagaço, 0,625% (m/V) de água de maceração de milho e os tempos de incubação de 120 horas para CMCase e de 168 horas para avicelase. A adição de novas fontes de carbono ao meio demonstrou que o microrganismo foi capaz de utilizar satisfatoriamente cada uma delas, porém as atividades das enzimas celulolíticas variaram em função das fontes testadas. Foi observada uma inibição da síntese enzimática no meio contendo celobiose. No entanto, um grande aumento da secreção das celulases ocorreu quando se utilizou a farinha da casca de maracujá, bagaço e água de maceração de milho, obtendo-se valores de atividades específicas de 3,931 U.mg ptn-1 para a avicelase, 1,032 U.mg ptn-1 para a CMCase e 4,084 U.mg ptn-1 para a FPase. Níveis semelhantes foram obtidos nos meios que continham a pectina de maçã. A máxima produção das enzimas foi observada no intervalo de 168 horas, quando a cultura se encontrava na fase estacionária. O estudo do efeito das concentrações de farinha da casca de maracujá indicou que a adição de 0,5% (m/V) e 0,75% (m/V) deste substrato ao meio proporcionou igualmente uma melhor produção das celulases. Como uma visão geral deste estudo, foi possível aumentar a produção das celulases pela otimização do meio de cultivo.

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / CelE1 é uma endoglucanase, pertencente à família GH5, altamente ativa em ampla faixa de temperaturas e em condições alcalinas de pH. Foram examinamos os efeitos do pH sobre as estruturas secundárias e terciárias, carga líquida, e a atividade de CelE1. Embora a variação do pH tenha mostrado um pequeno efeito na estrutura da enzima, a atividade foi influenciada em condições ácidas, enquanto que atingiu a atividade ótima em pH 8. A fim de verificar a possibilidade de aplicação industrial como aditivo de detergentes, a atividade da enzimática da CelE1 foi avaliada na presença de agentes tensoativos. Surfactantes iônicos e não iônicos não foram capazes de reduzir significativamente a atividade CelE1. Portanto, notou-se que CelE1 pode ser uma candidata promissora para utilização como aditivos de detergentes. Foi relatada uma análise termodinâmica com base na estabilidade estrutural e química dos processos de desnaturação e renaturação da enzima. Os resultados indicaram que A enzima CelE1 apresenta atividade em temperaturas baixas e ambientes, em condições alcalinas e na presença de surfactantes, além de ter a capacidade de se desnaturar e renaturar, em diferentes concentrações de ureia. O processo de desnaturação e renaturação da CelE1 mostrou-se ser um processo reversível de dois estados. Estes dados podem ser úteis para aplicações biotecnológicas. / CelE1 is a cold-active endo-acting glucanase with high activity at a broad temperature range and under alkaline conditions. Here, we examined the effects of pH on the secondary and tertiary structures, net charge, and activity of CelE1. Although variation in pH showed a small effect in the enzyme structure, the activity was highly influenced at acidic conditions, while reached the optimum activity at pH 8. Furthermore, to estimate whether CelE1 could be used as detergent additives, CelE1 activity was evaluated in the presence of surfactants. Ionic and nonionic surfactants were not able to reduce CelE1 activity significantly. Therefore, CelE1 was found to be promising candidate for use as detergente additives. Finally, we reported a thermodynamic analysis based on the structural stability and the chemical unfolding/refolding process of CelE1. The results indicated that the chemical unfolding proceeds as a reversible two-state process. These data can be useful for biotechnological applications.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-07. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:55Z : No. of bitstreams: 1 000846173_20160507.pdf: 175843 bytes, checksum: cc1b5a4632f6867bdd6b16501c5e684d (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-09T17:15:59Z: 000846173_20160507.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-09T17:16:41Z : No. of bitstreams: 1 000846173.pdf: 2029632 bytes, checksum: e355dd2ad8b2cd1af7fdc1e7c65acf03 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Celulases são essenciais para a hidrólise de materiais lignocelulósicos visando à produção de etanol de segunda geração. A fermentação em estado sólido é um processo que proporciona altas concentrações de enzimas que podem ser aplicadas nessa hidrólise. O objetivo do presente trabalho foi produzir enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas empregando os fungos Trichoderma reesei e Myceliophthora thermophila por fermentação em estado sólido em biorreator de leito empacotado e aplicar essas enzimas, combinadas ou não, na sacarificação de bagaço de cana-deaçúcar. Foram empregados bagaço in natura, bagaço pré-tratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino e bagaço com pré-tratamento hidrotérmico. A produção de enzimas foi avaliada pelas atividades CMCase, atividade sobre papel de filtro (FPU), xilanase e β-glicosidase. Para os experimentos de sacarificação com extratos dos fungos não combinados, foi adotado um planejamento de superfície de resposta central composto com 5 repetições do ponto central, tendo como fatores o volume de extrato enzimático e o tempo de hidrólise. Os resultados com os dois extratos indicaram como ótimos um volume de 7,0 mL e 6 horas de hidrólise para os bagaços in natura, pré-tratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino e com pré-tratamento hidrotérmico, exceto o extrato de M. thermophila que resultou em 5,0 mL e 6,8 horas para o bagaço hidrotérmico. Os melhores resultados de conversão em glicose com os dois extratos foram obtidos com o bagaço prétratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino, tendo sido de 34,0 % para M. thermophila e de 21,2 % para T. reesei. A partir destes resultados, foi elaborado um planejamento fatorial completo para os experimentos de hidrólises empregando coquetéis enzimáticos. Os fatores empregados foram composição (1:1; 1:3; 3:1) e temperatura... / Cellulases are essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials aiming to the production of second generation ethanol. The solid-state fermentation is a process that allows obtaining high concentrations of enzymes which can be applied in this hydrolysis. The purpose of the current work was producing cellulolytic and hemicellulolytic enzymes by employing the fungi Trichoderma reesei and Myceliophthora thermophila by solid-state fermentation in packed-bed bioreactor and apply these enzymes, combined or not, in the saccharification of sugarcane bagasses. Bagasse in natura, bagasse pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium and bagasse with hydrothermal pretreatment have been employed. The enzymes production was evaluated by CMCase, filter paper activitie (FPU), xylanase and β-glucosidase activities. For the saccharification experiments with extracts from both fungi no-combined, it has been adopted a central-composed response surface design with 5 replications of the central point, having as factors the volume of enzyme extract and the duration of hydrolysis. The results with both extracts indicated as optimal a volume of 7,0 mL and 6 hours of hydrolysis for the bagasses in natura, pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium and with hydrothermal pretreatment, except the extract of M. themophila that resulted in 5,0 mL and 6,8 hours for the hydrothermal bagasse. The best results of conversion in glucoses with both extracts were obtained with the bagasse pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium, which have been 34,0 % for M. themophila and 21,2 % for T. reesei. From these results, it has been elaborated a full factorial design for the hydrolysis experiments employing enzymatic cocktails. The factors used were composition (1:1; 1:3; 3:1) and temperature (45, 55, 65 ºC and alternated). The best result was obtained by... / FAPESP: 2013/1756-1

Submitted by Emily Colferai Bonfá null (miemilymi@hotmail.com) on 2016-03-22T01:17:39Z No. of bitstreams: 1 Mestrado-Emily Finall.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T17:56:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bonfa_ec_me_sjrp.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T17:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bonfa_ec_me_sjrp.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As celulases podem ser utilizadas na bioconversão da fração de celulose de resíduos agro-industriais em açúcares fermentáveis, visando a obtenção de combustíveis renováveis e produtos químicos. As β-glicosidases são cruciais para a total sacarificação da celulose, mas na maioria dos casos elas são fortemente inibidas pelo seu produto, a glicose. Portanto, o conhecimento das cinéticas de hidrólise e as respostas dessa enzima frente a diferentes substratos e produtos pode definir a eficiência de hidrólise e do processo biotecnológico no qual poderia ser incorporada. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a β -glicosidase de 50 kDa (BG50) produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 cultivado em estado sólido, em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). O zimograma do extrato bruto evidenciou duas isoformas, de aproximadamente 200 e 50 kDa, as quais foram separadas por cromatografia de filtração em gel. A caracterização da BG50 mostrou atividade ótima a 60 ˚C e pH 5,0 quando usado o 4-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo (pNPG), enquanto com celobiose o valor da temperatura e pH ótimo foram de 50 ˚C e pH 4,5, respectivamente. Testes realizados com adição de íons e reagentes mostraram diferenças nos efeitos sobre a atividade da enzima dependendo do substrato, principalmente com a adição de Ditiotreitol (DTT) utilizando celobiose, e inibição completa com Cu2+ e Fe3+ para pNPG e celobiose. Além disso, a enzima não mostrou efeito inibitório quando testada na presença de nove compostos fenólicos, uma característica significativa. Os estudos cinéticos revelaram um perfil de inibição competitiva pela glicose quando utilizado pNPG com valor de KI=1,5 mM e um Km significativamente menor (0,52 mM) pelo pNPG do que pela celobiose (Km=8,50 mM). Os parâmetros termodinâmicos mostraram que a BG50 é bastante estável, destacando seu tempo de meia vida de 855,6 minutos a 60 °C, porém desnatura facilmente acima dessa temperatura. Os resultados enfatizam a importância de investigar potencialidades de β-glicosidases baseadas na celobiose, uma vez que no processo industrial a enzima atuará sobre o substrato natural, além da compreensão da termoestabilidade da enzima. / Cellulases can be used in bioconversion of cellulose from agro-industrial waste into fermentable sugars in order to obtain renewable fuels and chemicals. The β-glucosidases are crucial to the overall saccharification of cellulose, but in most cases, they are strongly inhibited by its product, glucose. Therefore, knowledge of the hydrolysis kinetics of the enzyme and its responses against different substrates and products can set the hydrolysis efficiency and possible incorporation in biotechnological process. This study aimed to characterize the 50 kDa β-glucosidase (BG50) produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 grown in solid state, in a mixture of sugarcane bagasse and wheat bran (1:1). The zymogram of the crude extract showed two isoforms of 200 and 50 kDa, which were separated by gel filtration chromatography. The characterization of BG50 showed optimal activity at 60 °C and pH 5.0 when used pNPG, whereas using cellobiose the values of the optimal temperature and pH were 50 °C and pH 4.5, respectively. Tests with addition of reactants and ions showed differences in the effects on enzyme activity depending on the substrate, especially with the addition of dithiothreitol (DTT) utilizing cellobiose, and complete inhibition with Cu2+ and Fe3+ for 4-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose. Furthermore, the enzyme showed no inhibitory effect when tested in the presence of nine phenolic compounds, a remarkable characteristic. Kinetic studies showed a profile of competitive inhibition by glucose when using pNPG with Ki = 1.5 mM and Km significantly lower (0.52 mM) with pNPG than using cellobiose (Km = 8.50 mM). The thermodynamic parameters show that BG50 is quite stable, highlighting its half life of 855.6 minutes at 60 ° C, but above this temperature easily denatured. The results emphasize the importance of investigating β-glucosidases’ potential based on cellobiose, since for the industrial processes the enzyme will function with its natural substrate, in addition to understanding the thermal stability of the enzyme.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6150.pdf: 1801179 bytes, checksum: d2366a6c320c54df184a270c81c7c653 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / The present situation of energy and environmental setting in the world has favored the development of alternative energy sources, and has emerged as an option the use of biofuels, such as bioethanol. Besides ethanol produced from sugarcane, there is the alternative of to use plant biomass to get called second-generation ethanol. In Brazil, the major lignocellulosic material used to produce bioethanol is sugarcane bagasse, and this ethanol is obtained by fermentation of the hydrolyzate of the plant cell wall polysaccharides, this hydrolysis is performed normally by enzymes cellulolytic. Microorganisms, such as fungi of the genus Trichoderma, which are filamentous fungi present in the soil, have a variety of these enzymes that convert cellulose into glucose. In this context, the aim of this study was the recombinant production of Trichoderma harzianum IOC-3844 endoglucanase IV and its biochemical characterization. This Endo IV, which presents high similarity with Endo IV of other Thichoderma species, was expressed using the heterologous expression system of the yeast Pichia pastoris, and after be purified, assays were performed to test their activity. The recombinant enzyme hasn t show sign of degradation in any of the substrates used and can t be confirmed its hydrolytic action. However, the literature has been showed that these enzymes have capacity to increase the breaking of lignocellulose by cellulases (or a mix of them). Based on these data, a test was performed to evaluate the ability of endo IV supplemental activity in the cocktail Acellerase 1500 (Genencor) in the hydrolysis of biomass. In the experiment, copper was added as an electron donor and despite the increase in the hydrolysis of sugarcane bagasse the results showed that copper alone improves the cocktail performance. A circular dichroism analysis was performed and showed that the recombinant Endo IV is correctly coiled. The study showed that the enzyme produced at the laboratory has a high level of expression, but its activity couldn t be detected. The intention now is to perform tests with cocktails that don t contain expansins and isolated enzymes in order to verify that the Endo IV has effect upon them. / A atual situação do cenário energético e ambiental do mundo tem favorecido o desenvolvimento de fontes alternativas de energia, e como opção tem surgido a utilização de biocombustíveis, como o bioetanol. Além do etanol produzido a partir do caldo de cana, há a alternativa de utilizar a biomassa vegetal para obter o chamado etanol de segunda geração. No Brasil o principal material lignocelulósico utilizado para produção de bioetanol é o bagaço de cana-de-açúcar, e este etanol é obtido por meio da fermentação do hidrolisado dos polissacarídeos da parede celular dos vegetais, sendo esta hidrólise, realizada, normalmente, por enzimas celulolíticas. Microrganismos, como os fungos do gênero Trichoderma, que são fungos filamentosos presentes no solo, possuem uma variedade dessas enzimas capazes de converter a celulose em glicose. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção recombinante da enzima endoglucanase IV de Trichoderma harzianum IOC-3844 e sua caracterização bioquímica. Esta Endo IV, que apresenta alta similaridade com as Endo IV de outras espécies de Thichoderma, foi expressa utilizando-se o sistema de expressão heteróloga da levedura Pichia pastoris e, após ser purificada, foram realizados ensaios para testar sua atividade. A enzima recombinante não demonstrou sinal de degradação em nenhum dos substratos utilizados, não podendo ser comprovada sua ação hidrolítica. Porém, na literatura consta que essas enzimas têm a capacidade de aumentar a quebra de lignocelulose por celulases (ou uma mistura delas). Com base nesses dados, um teste foi realizado para avaliar a capacidade da endo IV de suplementar a atividade do coquetel Acellerase 1500 (Genencor) na hidrólise de biomassa. No experimento, foi adicionado cobre como doador de elétrons e apesar do aumento na hidrólise do bagaço-de-cana os resultados mostraram que o cobre sozinho melhora a performance do coquetel. Uma análise de dicroísmo circular foi realizada e revelou que a Endo IV recombinante se encontra corretamente enovelada. O estudo mostrou que a enzima produzida em laboratório possui alto nível de expressão, porém sua atividade não pôde ser constatada. Pretende-se agora realizar testes com coquetéis que não contêm expansinas e com enzimas isoladas, a fim de verificar se a Endo IV possui efeito sobre elas.

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-24Bitstream added on 2014-08-27T15:57:05Z : No. of bitstreams: 1 000778079.pdf: 2078209 bytes, checksum: f253bd93ea489feb471ed9cad8e18c13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-?-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades ?-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por ?-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de ?-glucanos... / The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-?-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has ?-glucanase and xiloglucanase activities, preferring ?-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of ?-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material