Bacillus cereus est un pathogène opportuniste à l'origine de deux types de toxi-infections alimentaires classées en syndrome émétique ou diarrhéique. Le syndrome diarrhéique résulte de la production d'entérotoxines (Hbl, Nhe et CytK) au niveau de l'intestin grêle de l'hôte, caractérisé par une atmosphère anaérobie et un faible potentiel d'oxydo-réduction (POR). La capacité de B. cereus à se développer et à produire des entérotoxines dans ces conditions est sous le contrôle de deux systèmes qui agissent, en partie, indépendamment du régulateur pléiotrope connu, PlcR (Phospholipase C Regulator). Il s'agit du système à deux composants ResDE et de la protéine Fnr (Fumarate Nitrate Reductase). Le but de cette étude a été de caractériser d'un point de vue fonctionnel l'implication du régulateur Fnr et du système ResDE dans la toxinogenèse de B. cereus. Les résultats ont montré que la régulation de la transcription de hbl et nhe était sous le contrôle direct et indirect de Fnr et de ResD. En aérobiose, la fixation de Fnr (forme Apo) sur les régions promotrices des gènes de structure des entérotoxines (pnhe et phbl) et des gènes de régulation (presDE, pfnr et pplcR) dépend des conditions redox. L'affinité de ResD pour pnhe, phbl, presDE, pfnr et pplcR dépend des séquences de ces régions promotrices et son affinité pour les régions promotrices presDE et pfnr dépend de son état de phosphorylation. ResD et ApoFnr sont capables de se fixer simultanément sur les régions promotrices étudiées et sont également capables d'interagir physiquement en l'absence d'ADN. Nous avons proposé un modèle de régulation de la toxinogenèse dans lequel ResDE et Fnr pourraient agir en synergie. Enfin des expériences de double hybride ont permis de mettre en évidence que la protéine PlcR pourrait interagir in vivo avec les régulateurs ResD et Fnr. La régulation de la toxinogenèse impliquerait donc la formation d'un complexe multi-moléculaire / Bacillus cereus is an opportunistic pathogen responsible of two types of food-borne diseases, classified as emetic and diarrhoeal syndromes. The diarrhoeal syndrome results from the production of enterotoxins (Hbl, Nhe and CytK) in the host small intestine, which constitutes a high reducing anoxic environment. The ability of B. cereus to produce enterotoxins and grow well in such environment is controlled by two global regulators that may function independently of the pleiotropic virulence regulator PlcR (Phospholipase C Regulator). These two regulators are the two-component system ResDE and the redox regulator Fnr (Fumarate Nitrate Reductase). The aim of this study was to establish the role of Fnr and ResDE in the virulence regulatory pathway of B. cereus. The results showed that transcriptional regulation of hbl and nhe was directly and indirectly controlled by Fnr and ResD. In aerobiosis, Fnr interaction (apo form) with the promoter regions of the enterotoxin structural genes (pnhe and phbl) and the enterotoxin regulator genes (presDE, pfnr and pplcR) depends on its oligomeric state. DNA binding affinity of ResD for pnhe, phbl, presDE, pfnr and pplcR depends on the promoter sequences and affinity for presDE and pfnr depends on its phosphorylation state. ResD and Fnr were found to physically interact and simultaneously bind their target DNAs. We proposed a model for regulation of enterotoxin genes expression in which ResD and Fnr could act synergically. Finally, yeast two-hybride experiments showed that PlcR could physically interact in vivo with Fnr and ResD. Enterotoxin genes expression of B. cereus could thus be controlled through a mechanism including a ternary complex

Cereus triangularis est un cactus non endémique de la sous-famille des Cactoïdées très présent dans le nord de Madagascar. Ses cladodes sont utilisées sous la forme de décoctions dans la pharmacopée Malgache. Bien que riche en hydrocolloides comme la plupart des cactus appartenant à cette sous famille il n’est pas exploité pour la production de polysaccharide. Notre travail a donc consisté à définir les conditions d’extraction des polysaccharides hydrosolubles des cladodes de cette plante, à en identifier la structure, à en caractériser les propriétés physico-chimiques et à explorer des voies enzymatiques pour leur dégradation en oligomères et/ou en polymères de faibles masses molaires. Nos travaux ont conduit à l’identification d’un arabinogalactane de type I de haute masse molaire. Ce polysaccharide est constitué d’une chaîne principale de galactane de type β-(1,4)-D-GalP substituée en position 3 par des groupements T-α-L-Araƒ-(1, ou des chaînes latérales d’arabinanes. Le comportement rhéologique de ce galactane est typique des polymères rheofluidifiants ayant des propriétés de gel faible. La mise en œuvre de dégradations enzymatique à l’aide d’une galactanase fongique a conduit à l’obtention de fractions de plus faibles masses molaires que celles des polymères natifs qui ont pu être testées avec succès pour leurs propriétés prébiotiques. / Cereus triangularis is a non endemic cactus belonging to the sub-family of Cactoideae, well represented in the north of Madagascar. Its cladodes are used in food decoction as a traditional medicine in Madagascar. Even if the hydrocolloid content of this cactus is high as observed with other ones from the same sub-family, it is not exploited for the production of polysaccharides. In this study we have defined an extraction procedure to collect the soluble polysaccharide from the cladodes of this cactus and characterized the structure of it before to investigate its physico-chemical properties and to degrade it into oligosaccharides using enzymes. Structural analyses have revealed that this polysaccharide is a type I arabinogalactan with a high molecular weight. It is mainly composed of a galactan backbone of β-(1,4)-D-GalP substituted at position 3 by T-α-L-Araƒ-(1, or arabinan chains. The rheological properties of this galactan are characteristic of a pseudoplastic fluid with a weak gel behavior. Its enzymatic degradation using a fungal galactanase led to the production of oligomers and low molecular weight polysaccharides which have been successfully tested as prebiotics.

L’effet de la température et de la composition du milieu en nutriments sur les propriétés des spores (résistance et germination) de B. cereus a été largement étudié contrairement à l'effet de l'anaérobiose. Or, les cellules végétatives de B. cereus peuvent se retrouver dans une grande variété de milieux naturels avec un faible niveau d'oxygène (intestin, sol, lignes de traitement des aliments…) où la sporulation peut avoir lieu. Les spores produites dans ces conditions anaérobies pourraient donc avoir des propriétés particulières. Dans ce travail, un panel de 18 souches de B. cereus appartenant aux groupes phylogénétiques de II à VII a été étudié pour sa capacité à sporuler en anaérobiose dans un milieu de sporulation approprié que nous avons développé (MODS). En anaérobiose, la capacité de sporulation a été plus faible et plus hétérogène qu’en aérobiose. La souche AH187 a produit le niveau de spores le plus important en anaérobiose, elle a donc été choisie pour étudier les propriétés de ces spores. Les spores produites en anaérobiose étaient plus résistantes à la chaleur humide entre 90°C et 100°C, à 1M de NaOH, 1M d'acide nitreux et à la lumière pulsée. Aucune différence dans la résistance à 5 % de peroxyde d'hydrogène ou à 0.25 mM de formaldéhyde, ni aux UV-C, n'a été observée entre les deux conditions. En présence de L- alanine, les spores produites en anaérobiose germaient plus efficacement que celles produites en aérobiose tandis qu’aucune différence dans la germination n’a été observée en présence d'inosine. Aucune différence dans la taille des spores produites dans les deux conditions n’a été observée par microscopie électronique à transmission. Toutefois, les spores obtenues dans des conditions anaérobies avaient un exosporium endommagé ou dans certains cas un exosporium complètement détaché, contrairement aux spores produites dans des conditions aérobies. Afin de comprendre les différences dans la capacité de sporulation de B.cereus entre les 2 conditions, des PCR en temps réel (RT-PCR) ont été utilisées pour étudier l'expression des gènes de l'initiation de la sporulation spo0A, spo0B, spo0F, KinA et kinB. Les cinétiques d'expressions des gènes spo0A, spo0B, spo0F et KinA avaient la même tendance. Ils étaient caractérisés par une expression plus élevée en anaérobiose par rapport à l’aérobiose au début et à la fin de la phase exponentielle de croissance. En outre, l'expression du gène kinB était caractérisée par une augmentation en anaérobiose par rapport à l’aérobiose pour atteindre un pic entre 4 h (milieu de phase exponentielle) et 6 h (début de phase stationnaire) de croissance. Les gènes spo0A, spo0B, spo0F, KinA et kinB sont exprimés de manière différentielle entre l’aérobiose et l’anaérobiose. Ces données pourraient aider à comprendre la différence de capacité de sporulation de B. cereus entre la condition aérobie et anaérobie / The effect of temperature and nutrient composition of the medium on B. cereus spore properties (resistance and germination) has been extensively studied unlike to the effect of anaerobiosis. Nevertheless, B. cereus vegetative cells can be found in a large variety of natural environments with low oxygen level (intestine, soil, food processing line) where sporulation take place. Spores produced in these anaerobic environments could have particular properties. In this work, a panel of B. cereus strains belonging to phylogenetic groups II to VII was studied for their capacity to sporulate in anaerobiosis in an appropriate sporulation medium we developed (MODS). In anaerobiosis, sporulation ability was lower and more heterogeneous than in aerobiosis. The B. cereus AH187 strain produced the highest level of spores in anaerobiosis, it was therefore chosen to study spore properties. Spores produced in anaerobiosis were more resistant to wet heat from 90°C to 100 °C, 1M NaOH, 1M nitrous acid and pulsed light. No difference in resistance to 5 % hydrogen peroxide or 0.25 mM formaldehyde or UV-C was observed between these two conditions. In the presence of L-alanine, spores produced in anaerobiosis germinated more efficiently than spore produced in aerobiosis. No difference in germination was observed with inosine. No difference in the spores size produced in the two conditions was observed by transmission electron microscopy. However, spores obtained under anaerobic conditions had a damaged exosporium, or in some cases a completely detached exosporium, unlike spores produced under aerobic conditions. To understand differences in sporulation ability between both conditions, Real-time reverse transcription-PCR was used to study the expression the expression of sporulation initiation genes spo0A, spo0B, spo0F, kinA and kinB. The kinetics of gene expression spo0A, spo0B, spo0F and kinA had the same trend. They were characterized by a higher expression in anaerobiosis compared to aerobiosis at the beginning and the end of exponential growth phase. Furthermore, kinB gene expression was characterized by an increase in anaerobiosis compared to aerobiosis to achieve a peak between 4 (middle exponential phase) and 6 (early stationary phase) hours of growth. The spo0A, spo0B, spo0F, kinA and kinB genes are differentially expressed between aerobiosis and anaerobiosis. These data may help to understand the difference in B. cereus sporulation capacity between aerobic and anaerobic condition

Bacillus cereus est une bactérie à coloration de Gram positive capable de s'adapter à un grand nombre de stress tels que les bas pH ou les bas potentiels d'oxydo-réduction (Eh). Si certains des mécanismes d'adaptation de B. cereus à chacun de ces stress sont connus, les intéractions entre ces deux facteurs sur la physiologie bactérienne n'ont jamais été étudiés. Nous nous sommes donc intéressés à l'effet des variations de Eh sur la résistance au stress acide de B. cereus, aux adaptations métaboliques de B. cereus à pH acide et à l'intéraction de cette bactérie avec son environnement redox. Les résultats obtenus ont démontré, dans un premier temps, que la survie de B. cereus au choc acide était légèrement augmentée sous atmosphères à Eh réducteurs par rapport aux atmosphères à Eh oxydants. Nous avons également observé une réorientation majeure du métabolisme de B. cereus exposé à pH acide depuis la fermentation des acides mixtes vers la fermentation butanediolique. Cette réorientation joue vraisemblablement un rôle important dans la résistance au stress acide de B. cereus. Dans un second temps, nous avons étudié les intéractions de B. cereus avec son environnement redox et nous avons montré l'importance des groupements thiols exofaciaux dans l'activité réductrice de cette bactérie. L'ensemble de ces résultats permettent de mieux comprendre la physiologie de B. cereus confronté à un stress acide et aux variations de Eh et ouvre la voie à de nombreuses pistes de recherches novatrices. / Bacillus cereus is a Gram positive bacterium able to adapt and survive to numerous stress, including acid stress or oxydo-reduction potential (Eh) variations. Some adaptations are documeted for each of these two stress. However, the interaction between Eh and pH on B. cereus physiology was never studied. Here, we focus on the impact of Eh variation on the acid resistance of B. cereus, on the metabolic adaptation of these bacteria under low pH and on the interaction of bacterial cells with their redox environement. Results obtained demonstrate that the acid survival of B. cereus was slighlty higher under reductive Eh than under oxdative Eh. Concerning acid adaptations, we observed a major metabolic adjustement for cells cultivated at low pH with an important shift from mixed acid fermentation to butanediolic fermentation. Finally, we demonstrate the importance of exofacials thiols groups in the reductive abilities of B. cereus. All these conclusions will help to better understand the response of B. cereus exposed to acid stress and Eh.

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Raquel Monteiro Cordeiro de Azevedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_CelinaMara_D.pdf: 3203111 bytes, checksum: 0aa846a0bcf7bb5eb0b55f95d9a7f9ff (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Amostras ambientais e de alimentos foram coletadas em dois restaurantes institucionais da cidade de Campinas/SP para a investigação das fontes de contaminação por Bacillus cereus e caracterização do perfil enterotoxigênico dos isolados. A pesquisa foi realizada em três etapas: i) análise da contaminação ambiental geral; ii) diagnóstico da contaminação durante processamentos de pratos cárneos e; iii) estudo do comportamento do microrganismo em substrato cárneo mantido a 10 e 30°C. A avaliação da contaminação ambiental geral e durante os processamentos revelou a presença do microrganismo em 80 (74,8%) das 107 amostras de ar ambiente (2,0 a 38,4 UFC/m³) e em 58 (46,4%) das 125 amostras de superfícies de bancadas e de equipamentos analisadas. O microrganismo também foi identificado em amostras de carne processada (10² UFC/g a 2,4x10³ UFC/g) e de condimentos e temperos (1,0x10 a 5,0x10² UFC/g) coletadas durante os processamentos. A produção de enterotoxinas foi investigada através da técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) para os genes hblA, hblD e hblC (codificadores da "hemolisina BL" - HBL) e para os genes nheA, nheB e nheC (codificadores da "enterotoxina não hemolítica" - NHE). Do total de 124 isolados, 117 (94,3%) foram positivos para ao menos um dos genes pesquisados; 18 (14,5%) foram positivos para os três genes codificadores da HBL; 25 (20,2%) foram positivos para os três genes codificadores da NHE; e 7 (5,6%) foram positivos para todos os genes. Um teste imunoenzimático de detecção da NHE (kit BDE-VIA: Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immunoassay; Tecra) também foi utilizado. Os resultados obtidos com o BDE-VIA revelaram que 89 (71,8%) dos 124 isolados são produtores de NHE. B. cereus apresentou rápido crescimento em substrato cárneo mantido a 30°C, com tempo de geração entre 28,8 e 36,0 min, indicando que a carne exposta a temperaturas abusivas é propícia ao desenvolvimento do microrganismo. A 10°C, o tempo de geração oscilou entre 10,16 e 28,38 h. A presença de cepas potencialmente enterotoxigênicas observadas em amostras ambientais atestam a importância do ambiente como fonte de contaminação pelo microrganismo. Os resultados da pesquisa permitem concluir que, tanto o controle do microrganismo no ambiente de serviços de alimentação como o adequado processamento dos alimentos, são fundamentais para a redução do risco de doenças de origem alimentar associadas a B. cereus / Abstract: Environmental and food samples were collected in two food services in the city of Campinas/SP for investigation of Bacillus cereus contamination sources and characterization of strains toxin profiles. The research has been made in three steps: i) analysis of general environmental contamination; ii) diagnosis of contamination during processing cooked meat; and iii) study of microorganism behavior in meat substrate stored at inappropriate temperatures. The results indicated the presence of microorganism in 80 (74.8%) of the 107 environmental air samples (2.0 to 38.4 CFU/m³) and in 58 (46.4%) of the 125 samples of equipments and benches surfaces. The microorganism also was identified in cooked meat samples (10² CFU/g to 2.4x10³ CFU/g) and in spices samples (1.0x10 CFU/g to 5.0x10² CFU/g), collected during the processing. The potential of enterotoxin production was investigated using polymerase chain reaction (PCR) methods for genes hblA, hblD e hblC (encoding hemolysin BL) and for genes nheA, nheB and nheC (encoding non-hemolytic enterotoxin - NHE). From all the 124 strains, 117 (94.3%) were positive for at least one gene; 16 (12.9%) were positive for the three HBL encoding genes; 25 (20.2%) were positive for the three NHE encoding genes; and 7 (5.6%) were positive for all genes. The Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immunoassay (BDE-VIA; Tecra) also was used for NHE detection. The results obtained with BDE-VIA revealed that 89 (71.8%) from the 124 strains are NHE producers. B. cereus cells showed fast growth in meat substrate stored at 30°C with generation time between 28.8 and 36.0 min, indicating that meat stored at inadequate temperatures is propitious to the microorganism development. At 10°C, the generation time varied between 10.16 and 28.38 h. The presence of potentially enterotoxigenic strains in the environmental samples confirm the importance of environment as a source of microorganism contamination. The results allow to conclude that either the control of microorganism in food services environment either the proper food processing are fundamental to reduce the risks of foodborne diseases associated to B. cereus / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Les exopolysaccharides - des polymères de sucres exportés - sont impliqués dans des fonctions essentielles de la physiologie bactérienne. Ce sont en effet des composants majeurs, respectivement, de la paroi bactérienne, des polymères secondaires attachés à cette paroi, des capsules, et de la matrice du biofilm. Bacillus thuringiensis est une bactérie entomopathogène, appartenant au groupe Bacillus cereus, capable de former un biofilm à l’interface air-liquide. Ce biofilm comporte deux structures distinctes: une pellicule flottant sur le milieu de culture et, en périphérie, en continuité avec celle-ci, un anneau adhérent sur les surfaces solides. Pour identifier les exopolysaccharides constitutifs de la matrice du biofilm chez cette bactérie, j'ai recherché, dans le génome séquencé de la souche 407 de B. thuringiensis, les différents loci chromosomiques susceptibles d'être impliqués dans la production de ces exopolymères. Deux loci ont étés identifiés, que nous avons appelé eps1 et eps2. Le locus eps1 avait déjà été décrit comme n'ayant aucun rôle dans la formation des biofilms chez B. cereus et sa fonction était restée inconnue. Nous avons montré que l'exopolysaccharide Eps1, dépendant du locus eps1, forme une capsule en phase stationnaire et en condition d'hypoxie. Cette capsule, qui présente des propriétés adhésives importantes sur des surfaces biotiques et abiotiques, permet l'adhésion du biofilm sur les surfaces solides et est requise pour la formation de l'anneau du biofilm. En accord avec ces résultats, nous avons observé que Eps1 n'est présent que dans l'anneau du biofilm. En revanche, l'exopolysaccharide Eps2 dépendant du locus eps2 est un élément essentiel de la matrice du biofilm et est nécessaire pour la formation de la pellicule. Enfin, à l'aide de marqueurs fluorescents, nous avons montré que deux souches mutantes capables de ne produire, respectivement, que Eps1 ou Eps2, se distribuent de façon hétérogène dans le biofilm lorsqu'elles sont mises en co-culture. En effet, la souche ne produisant que Eps1 est localisée dans l'anneau tandis que la souche ne produisant que Eps2 est localisée dans la pellicule. L'étude de la régulation de la transcription des loci eps1 et eps2 montre que ces deux loci sont régulés de façon identique. Le répresseur SinR, qui contrôle la formation de la composante protéique de la matrice du biofilm chez B. thuringiensis, n'a aucun effet sur la transcription de eps1 et eps2 chez cette bactérie. En revanche, cette transcription est activée par Spo0A et réprimée par AbrB. Enfin, le régulateur CodY réprime l’expression de ces loci en phase exponentielle, mais stimule cette expression en phase stationnaire tardive. Nos résultats montrent également un rétrocontrôle négatif d’Eps2 sur la production d’Eps1, suggérant l'existence d'une bascule ne permettant la production, au niveau d'une cellule isolée, que d'un seul de ces exopolysaccharides. / Exopolysaccharides - polymers of exported sugars - are involved in essential functions of bacterial physiology. Exopolysaccharides are in fact major components, of the bacterial wall, secondary polymers attached to this wall, the capsules, and finally the biofilm’s matrix. Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacterium of the cereus group, capable of forming a biofilm at the air-liquid interface. This biofilm has two distinct structures: a floating pellicle on the culture medium and, at the periphery, in continuity with the pellicle, a ring adhering to the solid surfaces. To identify the exopolysaccharides, which constitute the biofilm matrix in B. thuringiensis, I investigated the various chromosomal loci in the sequenced genome of B. thuringiensis strain 407. Two loci have been identified and were called eps1 and eps2. To date, no role in the formation of biofilms in B. thuringiensis had been attributed to eps1 locus. Our data showed that the exopolysaccharide Eps1, depending on the eps1 locus, forms a capsule in the stationary phase and in hypoxic conditions. This capsule, which has significant adhesive properties on biotic and abiotic surfaces, allows adhesion of the biofilm to the solid surfaces, thus forming of the biofilm ring. Consistently with these results, we observed that Eps1 is present only in the biofilm ring. We found that Eps2 exopolysaccharide depending on the eps2 locus is an essential element of the biofilm matrix and is necessary for the formation of the pellicle. We have shown using fluorescent markers that two mutant strains capable of producing only type of exopolysaccharides Eps1 or Eps2 are distributed heterogeneously in the biofilm when they are cocultured. The mutant strain producing only Eps1 is localized in the ring while the mutant strain producing only Eps2 is located in the pellicle. Our data show that the transcription of eps1 and eps2 loci is regulated identically by the same set of regulators. The SinR repressor, which controls the formation of the protein component of the biofilm’s matrix in B. thuringiensis, has no effect on the transcription of eps1 and eps2 in this bacterium. The transcription is activated by Spo0A and repressed by AbrB. The CodY regulator represses the expression of these loci in exponential phase, but activates it in the late stationary phase. Our results also show a negative feedback from Eps2 on the production of Eps1, suggesting the existence of a switch, allowing only one of these exopolysaccharides to be produced in an isolated cell.

Bacillus cereus est une bactérie connue pour être le deuxième agent responsable de Toxi-Infections Alimentaires Collectives (TIAC) en France depuis 2012. Plusieurs cas d'infections locales et systémiques à B. cereus ont également été signalés. Par sa capacité à former des biofilms et à sporuler, B. cereus pose de vrais problèmes en agroalimentaire et en santé publique en résistant aux procédures de nettoyage et désinfection. Il reste néanmoins beaucoup d’interrogations sur les différences de toxicité observées chez les souches de B. cereus, des souches étant inoffensives pour l’Homme alors que d’autres sont mortelles. Or, les industries agroalimentaires et les hôpitaux ont besoin de savoir si une souche retrouvée dans leur environnement présente un danger et nécessite une intervention qui pourra avoir des répercussions économiques et humaines. Pour répondre à ces enjeux, mon travail a consisté à collecter et caractériser 564 souches isolées dans le cadre de TIAC et 56 souches isolées suite à des cas d’infections non-gastro-intestinales dans le but de les comparer avec des souches environnementales de B. cereus non reliées à des infections et identifier ce qui les différencie.A la suite de l’analyse complète des données épidémiologiques et cliniques des souches de B. cereus ainsi que leur typage et leur caractérisation sur un modèle de caractérisation génétique basé sur la détection de dix gènes présumés impliqués dans la virulence, des souches d’intérêts ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une étude approfondie de toxicité et de transcriptomique. Cette première partie du travail a également permis d’approfondir les connaissances portant sur les foyers de TIAC causés par B. cereus et aussi de mettre en évidence des cas de contaminations croisées survenues au sein de plusieurs hôpitaux français pouvant conduire au décès du patient.L’étude portant sur la toxicité in vitro des souches sur trois modèles cellulaire eucaryotes a montré des différences significatives entre des B. cereus qui ont causé des infections et ceux non reliés à des infections. L’étude de trancriptomique différentielle a permis d’identifier une liste de marqueurs qui pourraient être utilisés, après validation, pour différencier les souches pathogènes et environnementales considérées comme non pathogènes. À la suite d’un transfert de connaissance et de méthode, ces marqueurs pourront être utilisés par les laboratoires de terrain en agro-alimentaire et les laboratoires d’analyses médicales pour aider à la prise de décision en cas de contamination à B. cereus. / Bacillus cereus is the second cause of foodborne outbreaks (FBO) in France since 2012. Several cases of local and systemic infections caused by B. cereus were also reported. By its ability to form biofilms and spores, B. cereus arises real problems in the food industry and public health by resisting to cleaning and disinfection procedures. It remains many questions about the toxicity differences observed among B. cereus strains, several are harmless to humans while others can cause death. But the food industry and hospitals need to know if a strain found in their environment is unsafe and requires intervention that can have an economic and human impact. Face to these challenges, my work was to collect and characterize 564 strains isolated from FBO and 56 strains isolated from patients following cases of non-gastrointestinal infections in order to compare them with environmental strains of B. cereus and identify what differentiates them to others.By a full analysis of epidemiological and clinical data of B. cereus strains and their molecular typing and characterization by a genetic model based on the detection of ten genes potentially involved in virulence, interest strains have been selected to deal with toxicity and transcriptomic in depth. This first part has also allowed increasing knowledge about FBO caused by B. cereus and also to highlight cross-contaminations occurred in several French hospitals leading to death.The in vitro toxicity studies performed on three eukaryotic cell models showed significant differences between toxicity levels of B. cereus strains that have caused infections and those no linked to infections. The differential trancriptomic study has allowed identifying a list of markers that could be used, after validation, for differentiating pathogenic strains from those considering as non-pathogenic. Following the transfer of knowledge and methods, these markers could be used by food safety laboratories and medical laboratories to be a decision aid in case of B. cereus contamination.

This particular work is proposed as a test of the expedience of using the fluorescent-antibody technique as a method for enumeration and identification of certain strains of B. cereus that have been found to be effective in preventing taste and odor in water supplies resulting from certain Actinomycete blooms.

Com a ampla disseminação da AIDS, uma grande gama de microrganismos tem aparecido como patógenos emergentes, causando importantes infecções em pacientes imunocomprometidos. Por exemplo, Rhodococcus equi, um agente incomum de infecções em humanos, tem sido isolado em pacientes imunocomprometidos. A presença deste microrganismo oportunista em produtos farmacêuticos não tem tido considerável atenção. No presente trabalho, o método de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi comparado com métodos convencionais para rápida detecção de três espécies bacterianas em amostras de cremes tópicos contaminadas artificialmente. As amostras foram incubadas por 24 horas a 37ºC. Depois da incubação em caldo com 10% de tween 20, amostras foram semeadas em meio para crescimento seletivo. Identificação bioquímica de Bacillus cereus e Rhodococus equi foram feitas utilizando o sistemas de identificação API 20E® e API Coryne®, respectivamente. Para identificação de Micrococcus luteus foram utilizados os testes de catalase, oxidase, morfologias das colônias e o sistema Gram. O DNA foi extraído usando o método do fenol-clorofórmio. Os iniciadores utilizados contendo a seqüência específica foram para B. cereus (BC1 e BC2), R. equi (COX-F e COX-R) e para M. luteus (ML-ISR-R e ML-ISR-F) foram utilizados na reação de PCR. Para validação da metodologia molecular, as seqüências dos produtos de PCR foram determinadas e analizadas utilizando-se os programas Blastn e Blastx. Foi observado uma alta similaridade (E .value 0,0) e uma alta identidade ( > 99%) para as bactérias utilizadas neste estudo. Os métodos convencional e de PCR detectaram B. cereus, R. equi e M. luteus em todas as amostras contaminadas artificialmente. O tempo para completar o método de PCR incluindo o preparo de amostras e a amplificação específica do DNA bacteriano foi de 27 horas. Para o método convencional foi necessário de 72 a 96 horas para o isolamento e identificação bioquímica dos microrganismos pesquisados. A rápida detecção de PCR para B. cereus, R. equi e M. luteus mostrada neste trabalho sugerem o uso desta metodologia em controle de qualidade microbiológica de produtos tópicos não estéreis, especialmente utilizados por pacientes imunocomprometidos. / With the ample dissemination of the AIDS, a wide range microorganisms has blunted as emergent pathogens, causing important infection in immunocompromised patients. For example, Rhodococcus equi, an unusual cause of infection in humans, has been isolated from HIV-infected patients. The presence of these opportunistic microorganisms in pharmaceutical products has not receiv considerable attention. In the present work PCR assay were compared with standard microbiological methods for rapid detection of three bacterial species from artificially contaminated sample of topical creams. Artificially contaminated samples were incubated for 24 horas at 37º C. After incubation in broth with 10% tween 20, samples were streaked on seletive growth media. Biochemical identification of Bacillus cereus and R. equi was performed using API 20E® and API Coryne® identification systems, respectivelly. For Micrococcus luteus identification, colony an Gram-stained morphology of the bacterium and the biochemical tests of catalase and oxidase were used.DNA was extracted using phenol-chloroform method. DNA primers containing the specific sequences of the BC1 and BC2 for B. cereus, COX-R and COX-F for R. equi and ML-ISR-F and ML-ISR-F for M. luteus were used for detection in the PCR reaction. In order to validate this methodology, DNA sequences of the products were determined. The sequences of the cloned PCR products were analysed using Blastn and Blastx programs. It was observed a marked similarity (E.value 0,0) and a high identity (> 99%) to the bacteria used in the study. Both the PCR and the standard enrichment tests method detected B. cereus, R. equi and M. luteus in all of the deliberately contaminated samples. The time to complete the PCR assay including sample preparation and PCR amplification of the specific DNA bacterial targets was 27 h. Standard plating methods required 72-96 h for the bacteria to be isolated, purified and biochemecally identified. Rapid PCR detection of B. cereus, R. equi and M. luteus showed in this work suggests the use of this methodology in the microbiology control of non-sterile topical products, specially intended for use with immunocompromised patients.

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