Orientador: Karina Gottardello Zecchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ortega_RoseMara_M.pdf: 2975676 bytes, checksum: afd715972fbc788aca5b999d67d862a8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Ácido graxo sintase (FASN - fatty acid synthase) é a enzima metabólica responsável pela síntese endógena do ácido graxo saturado palmitato, a partir dos precursores acetil-CoA e malonil-CoA. Diversos estudos mostram que, em contraste com a maioria das células normais, FASN é altamente expressa em vários tipos de neoplasias malignas humanas, tais como as de próstata, mama e melanoma sendo que, em alguns destes tumores, a alta expressão de FASN está associada a um pior prognóstico. Anteriormente demonstramos que a inibição específica da atividade de FASN reduz significativamente a proliferação celular e promove a apoptose em linhagem celular de melanoma murino, B16-F10. O objetivo deste trabalho foi investigar de que maneira a inibição farmacológica de FASN reduz a proliferação de células B16-F10, utilizando a cerulenina, um produto natural do fungo Cephalosporium caerulens, como inibidor de FASN. O tratamento com cerulenina reduziu significativamente a proliferação das células B16-F10 de maneira dose-dependente. Ensaios de lipogênese utilizando 3H2O confirmaram a inibição da atividade de FASN pelo tratamento com cerulenina. Tal inibição resultou em significativo bloqueio da proliferação, conforme evidenciado pelo aumento do número de células nas fases G0/G1, assim como redução de células na fase S, em comparação com os controles. Paralelamente, o tratamento com cerulenina também aumentou o número de células em apoptose. Western blottings, feitos a partir de extratos de células tratadas com cerulenina, mostraram aumento significativo da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1, assim como redução de cdk2, uma Ser/Thr necessária para a transição G1/S, e Skp2, uma proteína necessária para a degradação proteossômica de p27Kip1. Apesar de não ter alterado o conteúdo total de p27Kip1, a inibição de FASN aumentou a quantidade de p27Kip1 co-imunoprecipitada com cdk2. Por outro lado, o tratamento com cerulenina não alterou o conteúdo de outras proteínas envolvidas na progressão das fases G1-S do ciclo celular, tais como cdk4, cdk6, Rb total, ciclina D1 e ciclina E. Em conjunto estes resultados demonstram que a inibição de FASN primeiramente altera os níveis de proteínas envolvidas na transição de G1 para S, tais como p21WAF1/Cip1, p27Kip1 e Skp2, e posteriormente induz apoptose em células de melanoma murino B16-F10 / Abstract: Fatty acid synthase (FASN) is the metabolic enzyme responsible for the endogenous synthesis of the saturated long-chain fatty acid palmitate, from the precursors acetyl-CoA and malonyl-CoA. In contrast to most normal cells, the overexpression of FASN in several human malignancies, such as those of prostate, breast, ovary, melanoma, and soft tissue sarcomas has been associated with poor prognosis. We have previously shown that the specific inhibition of FASN activity significantly reduce proliferation and promote apoptosis in the mouse metastatic melanoma cell line B16-F10. Here we investigated the events involved in cell cycle arrest subsequent to pharmacological FASN inhibition with cerulenin, a natural antifungal antibiotic obtained from Cephalosporium caerulens, in B16-F10 cells. Cerulenin treatment significantly reduced melanoma cells proliferation in a dose dependent manner. Lipogenesis using 3H2O confirmed inhibition of FASN activity after cerulenin treatment. Such enzymatic inhibition culminated in cell cycle arrest, evidenced by a significant increase in G0/G1 phase, as well as decline of the S phase, in comparison with untreated cells. Cerulenin treatment also induced apoptosis in B16-F10 tumor cells. Western blotting analysis of cerulenin-treated cells showed a significant accumulation of the tumor suppressor proteins p21WAF1/Cip1 and p27Kip1, together with decreased amounts of cdk2, a Ser/Thr protein kinase necessary for the G1/S transition, and Skp2, essential for the proteasomal degradation of p27Kip1. Cerulenin treatment increased the levels of p27Kip1 co-immunoprecipitated with cdk2, despite western blotting analysis showed similar content of total p27Kip1. The levels of other proteins involved in G1/S cell cycle progression, such as cdk4, cdk6, total Rb, cyclins A and E, were not affected by FASN inhibition. Collectively these findings suggest that FASN inhibition first modify the levels of proteins involved in transition G1-S, as p21WAF1/Cip1, p27Kip1 and Skp2, to finally induce apoptosis in mouse melanoma B16-F10 cells / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Ana Carolina Deckmann / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VargasTapia_Eulalia_M.pdf: 2747166 bytes, checksum: 033342e772fb86dbb8d3a20cf75af774 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o melhoramento genético da linhagem de levedura Lipomyces starkeyi DSM 70296, visando sua utilização na biossíntese de precursores de biocombustíveis a partir de fontes renováveis. Inicialmente foram verificados os parâmetros de mutagênese. O melhoramento genético foi conduzido por mutagênese aleatória de DNA por irradiação ultravioleta. O tempo de exposição foi ajustado de forma a assegurar uma taxa de sobrevivência celular não superior a 5%, para obter indivíduos contendo elevado acúmulo de mutações no DNA. Os mutantes foram selecionados com o uso da cerulenina agente interferente ao metabolismo de interesse, de forma que fossem identificados os mutantes cujas alterações genéticas pudessem estar promovendo efeitos sobre este metabolismo. Os mutantes que demonstraram crescimento normal em meio de cultura suplementado com cerulenina foram considerados bons candidatos para estudos aprofundados. Nesta etapa foram selecionados 90 mutantes, dos quais foram selecionados os oito melhores candidatos para estudo através de fermentação em frascos agitados. A avaliação de desempenho fermentativo foi conduzida a partir da avaliação dos índices de crescimento e produtividade de lipídeo utilizando meio de cultura contendo xilose como única fonte de carbono. A fermentação da cepa padrão foi conduzida nas mesmas condições para permitir uma análise comparativa. Os resultados obtidos mostraram que um dos mutantes (identificado como A1) apresentou aumento significativo nos índices de produtividade de biomassa e lipídeo em relação à cepa padrão (teste de Tukey com 95% de significância). Este mutante foi então selecionado para estudo aprofundado através da fermentação em biorreator utilizando a mesma composição de açúcares observada em bagaço de cana-de-açúcar (30% glicose: 70% xilose), conforme determinado em outros estudos conduzidos em nosso laboratório. Novamente, a fermentação da cepa padrão foi conduzida nas mesmas condições para permitir a análise comparativa. Os resultados confirmaram que o mutante A1 apresenta maior produtividade tanto em biomassa (88 g/L) quanto em fração de lipídeo (54,6%), em comparação à cepa padrão (76 g/L e 47,5%, respectivamente). Estes resultados indicam a viabilidade da estratégia de mutagênese aleatória aliadas à seleção de mutantes por cerulenina para o melhoramento genético desta levedura oleaginosa, visando sua aplicação no processo de biossíntese de precursores de biocombustíveis de segunda geração / Abstract: In this work it were performed studies aiming the genetic improvement of the yeast Lipomyces starkeyi strain DSM 70296 for its utilization in the biosynthesis of biofuels' precursors from renewable sources (sugarcane bagasse). Initially, we defined the parameters of mutagenesis. The genetic breeding was carried out by random mutagenesis of DNA by ultraviolet irradiation. The exposure time was adjusted to ensure a cell survival rate not exceeding 5%, in order to obtaining individuals presenting high rates of DNA mutations. The mutants were selected by using cerulenin, an compound displaying effects on the metabolism of interest (biosynthesis of lipids). Thus, the selected mutants are potentially carriers of genetic alterations in this particular metabolism. The mutants demonstrating normal growth in culture medium supplemented with cerulenin were considered good candidates for in-depth studies. In this step we selected 90 mutants, of which eight were considered the best candidates for further studies by fermentation in shake flasks. The evaluation of fermentative performance was carried out based on growth and lipid productivity rates using culture medium containing xylose as sole carbon source. The fermentation of the wild-type strain was conducted under the same conditions to allow a comparative analysis. The results showed that the mutant identified as A1 presented a significant increase in the productivity rates of both biomass and lipid in comparison to wild-type strain (Tukey test with 95% significance). This mutant was then selected for detailed study by fermentation in bioreactor using the same carbohydrate composition observed in sugarcane bagasse (30% glucose: 70% xylose), as previously determined by other studies in our laboratory. Again, fermentation of the wild-type and the mutant A1 was performed under the same conditions in order to allow a comparative analysis. The results confirmed that the A1 mutant presents an increased productivity of both biomass (88 g/L) and lipids (54.6%) when compared to the wild-type strain (76 g/L and 47.5%, respectively). These results indicate the feasibility of random mutagenesis strategy coupled with mutant selection employing cerulenin for the genetic improvement of the oleaginous yeast L. starkeyi, focusing its use in the biosynthesis of precursors of second generation biofuels / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestra em Engenharia Química

Seja no meio ambiente, dentro de um hospedeiro ou em outro habitat, bactérias estarão frequentemente enfrentando condições adversas, como exposição a compostos antibacterianos ou carência nutricional. Em situações como essas, as bactérias são capazes de ativar a chamada resposta estringente, modulada pelo alarmônio (p)ppGpp. O acúmulo de (p)ppGpp promove a inibição da transcrição de rRNAs e tRNAs e a supressão do processo de tradução, e a ativação de operons de biossíntese de aminoácidos. Sabe-se também hoje que a resposta estringente está relacionada a outras importantes carências nutricionais em Escherichia coli, como a falta de ácidos graxos, porém não se sabe se o mesmo ocorre em Bacillus subtilis ou em outras Grampositivas. (p)ppGpp atua também direta e indiretamente em vários outros processos celulares, como motilidade, resistência a antibióticos, virulência e persistência, indicando que (p)ppGpp é um regulador central que integra informação metabólica e respostas adaptativas. O presente trabalho buscou estudar a correlação da resposta estringente de B. subtilis com a carência de ácidos graxos e a busca por pequenas moléculas capazes de modular RelA (a principal proteína envolvida na síntese de (p)ppGpp) e impedir o acúmulo de (p)ppGpp. Para a indução da carência de ácidos graxos, foram utilizadas duas estratégias; uso da droga Cerulenina (inibidor de FabF) e mutantes condicionais no gene FabF. Observou-se que mutantes incapazes de ativar a resposta estringente (cepa ppGpp(0) ou RelAD264G) apresentaram grande perda de viabilidade celular durante a carência de ácidos graxos, ao passo que a cepa selvagem manteve sua viabilidade celular. A causa da morte se deu majoritariamente devido ao colapso do potencial de membrana. Apesar de não termos observado aumento de (p)ppGpp nas células selvagens durante a carência de ácidos graxos, observou-se uma redução da razão GTP/ATP, ao passo que na cepa ppGpp(0), a razão GTP/ATP aumentou, devido ao acúmulo de GTP. O uso da droga decoinina, capaz de reduzir os níveis intracelulares de GTP, resgatou parcialmente a viabilidade da cepa e impediu a perda do potencial de membrana, indicando que os níveis de GTP são importantes durante a carência de ácidos graxos em B. subtilis. Para a triagem de pequenas moléculas inibidoras do acúmulo de (p)ppGpp, foi utilizada uma biblioteca de 2320 diferentes compostos químicos, e buscou-se drogas capazes de reverter o fenótipo de crescimento lento de cepas de B. subtilis que acumulam (p)ppGpp (via mutação pontual; mutante RelAH77A e via tratamento com o indutor hidroxamato de arginina) em meio rico. A primeira etapa selecionou 40 moléculas capazes de resgatar o crescimento de células tratadas com arginina-hidroxamato, porém apenas uma, salicilanilida, foi capaz de também resgatar o crescimento da cepa RelAH77A. Todavia, apesar de ser capaz de acelerar o crescimento de B. subtilis esse efeito é limitado. Diversos análogos de salicilanilida foram testados, porém não apresentaram efeito superior a salicilanilida para a reversão do fenótipo de crescimento lento de B. subtilis. Em adição, a droga não foi capaz de aumentar a sensibilidade dos organismos a diversos antibióticos testados, e aparentemente é incapaz de alterar os níveis internos de (p)ppGpp, porém é capaz de causar alterações nos níveis de ATP. Logo, acredita-se que o efeito observado para o crescimento das células seja devido a efeitos indiretos, possivelmente envolvendo alteração de outros nucleotídeos fosforilados. / In the environment, inside a host or other habitat, bacteria will always face adverse conditions, as for example exposure to antimicrobials or starvation. In situations like those, bacteria activate the stringent response, modulated by the alarmone (p)ppGpp. (p)ppGpp accumulation promotes inhibition of rRNA and tRNA transcription and suppression of translational process, at the same time that it activates several amino acid biosynthesis operons. It is known also that the stringent response it is related to other starvation stress in Escherichia coli, like lack of fatty acids, but there is no knowledge if the same occurs for Bacillus subtilis or other gram-positive bacteria. ppGpp acts directly and indirectly affecting several other cellular process, as motility, resistance to antibiotics, virulence and persistence, indicating that (p)ppGpp is a central regulator that integrates metabolic information and adaptive responses. This work aimed to study the correlation between the stringent response in B. subtilis with fatty acid starvation, and search for small moleculas capable of modulating RelA (the main enzyme responsible for ppGpp synthesis) and stop (p)ppGpp production. For fatty acid starvation induction, two strategies were used; use of the drug Cerulenin (inhibitor of the FabF protein) and conditional mutants of the FabF gene. We observed that mutants incapable of activating the stringent response (strains ppGpp(0) ou RelAD264G) presented great loss of viability during fatty acid starvation, whereas the wild-type strain keeps its viability. The main cause of death is due membrane rupture in some cells, but mainly due to membrane potential collapse. Although we did not observed increase of (p)ppGpp in wild-type strains during fatty acid starvation, we observed reduction in GTP/ATP ratios, a hallmark of (p)ppGpp production in gram-positive bacteria. In the strain ppGpp(0) GTP/ATP ratio increased, mainly due to GTP increase. Using the drug decoyinine, capable of reducing GTP levels, partially recued viability and protects cells of losing its membrane potential, indicating that GTP levels plays an important role during fatty acid starvation in B. subtilis. For the screening of small molecules capable of inhibit (p)ppGpp production, a library of 2320 different chemical compounds were used, and we looked for drugs capable of reverting the slow growth phenotype of B. subtilis strains with (p)ppGpp accumulation (using a mutant RelAH77A; and using a stringent response inductor, arginine hidroxamate). The first step selected for 40 molecules capable of rescuing the growth of cells treated with arginine hidroxamate, but only one drug, salicilanilyde could also rescue the growth of the strain RelAH77A. Although capable of rescuing growth of B. subtilis that accumulates (p)ppGpp, this rescue is limited. Several analogues of salicilanilyde were tested, but none were stronger than salicilanilyde itself in rescuing growth of slow growing strains of B. subtilis. In addition, the drug was not capable of increasing antibiotic sensibility and it is incapable of changing intracellular (p)ppGpp levels, but it does shifts ATP levels. Therefore, we believe that the observed effects of salicilanilyde is due indirect action, probably involving other phosphorylated nucleotides, rather than modifying (p)ppGpp levels

Seja no meio ambiente, dentro de um hospedeiro ou em outro habitat, bactérias estarão frequentemente enfrentando condições adversas, como exposição a compostos antibacterianos ou carência nutricional. Em situações como essas, as bactérias são capazes de ativar a chamada resposta estringente, modulada pelo alarmônio (p)ppGpp. O acúmulo de (p)ppGpp promove a inibição da transcrição de rRNAs e tRNAs e a supressão do processo de tradução, e a ativação de operons de biossíntese de aminoácidos. Sabe-se também hoje que a resposta estringente está relacionada a outras importantes carências nutricionais em Escherichia coli, como a falta de ácidos graxos, porém não se sabe se o mesmo ocorre em Bacillus subtilis ou em outras Grampositivas. (p)ppGpp atua também direta e indiretamente em vários outros processos celulares, como motilidade, resistência a antibióticos, virulência e persistência, indicando que (p)ppGpp é um regulador central que integra informação metabólica e respostas adaptativas. O presente trabalho buscou estudar a correlação da resposta estringente de B. subtilis com a carência de ácidos graxos e a busca por pequenas moléculas capazes de modular RelA (a principal proteína envolvida na síntese de (p)ppGpp) e impedir o acúmulo de (p)ppGpp. Para a indução da carência de ácidos graxos, foram utilizadas duas estratégias; uso da droga Cerulenina (inibidor de FabF) e mutantes condicionais no gene FabF. Observou-se que mutantes incapazes de ativar a resposta estringente (cepa ppGpp(0) ou RelAD264G) apresentaram grande perda de viabilidade celular durante a carência de ácidos graxos, ao passo que a cepa selvagem manteve sua viabilidade celular. A causa da morte se deu majoritariamente devido ao colapso do potencial de membrana. Apesar de não termos observado aumento de (p)ppGpp nas células selvagens durante a carência de ácidos graxos, observou-se uma redução da razão GTP/ATP, ao passo que na cepa ppGpp(0), a razão GTP/ATP aumentou, devido ao acúmulo de GTP. O uso da droga decoinina, capaz de reduzir os níveis intracelulares de GTP, resgatou parcialmente a viabilidade da cepa e impediu a perda do potencial de membrana, indicando que os níveis de GTP são importantes durante a carência de ácidos graxos em B. subtilis. Para a triagem de pequenas moléculas inibidoras do acúmulo de (p)ppGpp, foi utilizada uma biblioteca de 2320 diferentes compostos químicos, e buscou-se drogas capazes de reverter o fenótipo de crescimento lento de cepas de B. subtilis que acumulam (p)ppGpp (via mutação pontual; mutante RelAH77A e via tratamento com o indutor hidroxamato de arginina) em meio rico. A primeira etapa selecionou 40 moléculas capazes de resgatar o crescimento de células tratadas com arginina-hidroxamato, porém apenas uma, salicilanilida, foi capaz de também resgatar o crescimento da cepa RelAH77A. Todavia, apesar de ser capaz de acelerar o crescimento de B. subtilis esse efeito é limitado. Diversos análogos de salicilanilida foram testados, porém não apresentaram efeito superior a salicilanilida para a reversão do fenótipo de crescimento lento de B. subtilis. Em adição, a droga não foi capaz de aumentar a sensibilidade dos organismos a diversos antibióticos testados, e aparentemente é incapaz de alterar os níveis internos de (p)ppGpp, porém é capaz de causar alterações nos níveis de ATP. Logo, acredita-se que o efeito observado para o crescimento das células seja devido a efeitos indiretos, possivelmente envolvendo alteração de outros nucleotídeos fosforilados. / In the environment, inside a host or other habitat, bacteria will always face adverse conditions, as for example exposure to antimicrobials or starvation. In situations like those, bacteria activate the stringent response, modulated by the alarmone (p)ppGpp. (p)ppGpp accumulation promotes inhibition of rRNA and tRNA transcription and suppression of translational process, at the same time that it activates several amino acid biosynthesis operons. It is known also that the stringent response it is related to other starvation stress in Escherichia coli, like lack of fatty acids, but there is no knowledge if the same occurs for Bacillus subtilis or other gram-positive bacteria. ppGpp acts directly and indirectly affecting several other cellular process, as motility, resistance to antibiotics, virulence and persistence, indicating that (p)ppGpp is a central regulator that integrates metabolic information and adaptive responses. This work aimed to study the correlation between the stringent response in B. subtilis with fatty acid starvation, and search for small moleculas capable of modulating RelA (the main enzyme responsible for ppGpp synthesis) and stop (p)ppGpp production. For fatty acid starvation induction, two strategies were used; use of the drug Cerulenin (inhibitor of the FabF protein) and conditional mutants of the FabF gene. We observed that mutants incapable of activating the stringent response (strains ppGpp(0) ou RelAD264G) presented great loss of viability during fatty acid starvation, whereas the wild-type strain keeps its viability. The main cause of death is due membrane rupture in some cells, but mainly due to membrane potential collapse. Although we did not observed increase of (p)ppGpp in wild-type strains during fatty acid starvation, we observed reduction in GTP/ATP ratios, a hallmark of (p)ppGpp production in gram-positive bacteria. In the strain ppGpp(0) GTP/ATP ratio increased, mainly due to GTP increase. Using the drug decoyinine, capable of reducing GTP levels, partially recued viability and protects cells of losing its membrane potential, indicating that GTP levels plays an important role during fatty acid starvation in B. subtilis. For the screening of small molecules capable of inhibit (p)ppGpp production, a library of 2320 different chemical compounds were used, and we looked for drugs capable of reverting the slow growth phenotype of B. subtilis strains with (p)ppGpp accumulation (using a mutant RelAH77A; and using a stringent response inductor, arginine hidroxamate). The first step selected for 40 molecules capable of rescuing the growth of cells treated with arginine hidroxamate, but only one drug, salicilanilyde could also rescue the growth of the strain RelAH77A. Although capable of rescuing growth of B. subtilis that accumulates (p)ppGpp, this rescue is limited. Several analogues of salicilanilyde were tested, but none were stronger than salicilanilyde itself in rescuing growth of slow growing strains of B. subtilis. In addition, the drug was not capable of increasing antibiotic sensibility and it is incapable of changing intracellular (p)ppGpp levels, but it does shifts ATP levels. Therefore, we believe that the observed effects of salicilanilyde is due indirect action, probably involving other phosphorylated nucleotides, rather than modifying (p)ppGpp levels