Les maladies à polyglutamines (polyQ) sont des maladies neurodégénératives héréditaires dominantes causées par une expansion de CAG traduite en longue expansion de polyglutamine dans la protéine correspondante. Ces maladies comprennent l’ataxie spinocérébélleuse 7 (SCA7) et la maladie de Huntington (MH) causées par une expansion de polyQ dans les protéines ataxine-7 (ATXN7) et huntingtine (htt), respectivement. Les souris SCA7 et MH développent des rétinopathies similaires suggérant des pathomécanismes communs toujours inexpliqués. Durant ma thèse, j’ai trouvé qu’en réponse à la toxicité des polyQ, les photorécépteurs (PR) perdent leur différenciation alors que d’autres migrent ou meurent. De plus, cette mortalité cellulaire active la prolifération des cellules gliales de Müller et leur différenciation en PR. Récemment, j’ai trouvé que l’ATXN7 et la htt se trouvent dans le cil primaire et leur mutation mène à une perte des protéines endogènes des cils associée à des défauts du cil. / Polyglutamine (polyQ) disorders are dominantly inherited neurodegenerative disorders caused by the expansion of CAG repeats translated into long polyQ tracts in the corresponding proteins. These diseases include Spinocerebellar ataxia 7(SCA7) and Huntington’s Disease (HD), caused by polyQ expansion ataxin-7 (ATXN7) and huntingtin (htt), respectively. SCA7 and HD mouse models develop similar retinopathies suggesting common pathomechanisms. In my thesis, I found that, in response to polyQ toxicity, SCA7 photoreceptors (PR) undergo several cell fates ranging from their deconstruction, to their migration and their death. Moreover, this cell death activates the proliferation of Müller glial cells and their differentiation into PR like cells. The pathomechanisms underlying HD and SCA7 are still unknown. Recently, I found that ATXN7 and htt are localized to the PR cilia and that the mutant proteins lead to a progressive loss of the wild-type proteins that correlates with defects in the PR cilia.

La conversion conformationnelle de la protéine prion cellulaire PrPC neuroprotectrice en protéine prion PrPSc infectieuse et pathogène caractérise les maladies à prions. Dans le cerveau infecté par les prions, la perte de PrPC, le gain de PrPSc neurotoxique et l’inflammation concourent à la mort neuronale par des mécanismes encore mal connus.Ces travaux valident les cultures organotypiques de cervelet de souris comme système expérimental ex vivo favorable à l’étude de ces mécanismes et montrent que l’absence de PrPC aussi bien que PrPSc activent des mécanismes apoptotiques et autophagiques qui conduisent à la mort des cellules de Purkinje du cervelet. Une deuxième étude in situ chez la souris montre que la compartimentation anatomo-fonctionnelle du cervelet est un paramètre endogène de la pathogenèse des prions de tremblante 22L. Une troisième série d’expériences in situ montre que les prions provoquent l’augmentation du récepteur TNFR1 de la cytokine pro-inflammatoire TNF-α à la membrane des astrocytes enveloppant les synapses excitatrices des cellules de Purkinje dans le cortex cérébelleux de souris infectées. Ceci implique une composante astrocytaire dans la réaction des complexes synaptiques aux prions. / The conversion of the protective cellular prion protein PrPC into an infectious, neurotoxic conformer PrPSc is a feature of prion diseases. In the prion-diseased brain, the loss of PrPC, the production of pathogenic PrPSc and inflammation contribute to neuronal death by still unknown mechanisms.The present results validate cerebellar organotypic cultures as a valuable experimental system to study ex vivo these mechanisms and provide insight into the apoptotic and autophagic processes activated by the absence of PrPC in Prnp-deficient mice and by PrPSc prions and lead to the death of the cerebellar Purkinje cells. A second line of research in situ showed that the anatomo-functional compartmentation of the mouse cerebellum is an endogenous parameter of the pathogenesis of the 22L scrapie prions. Finally, another in situ approach revealed that prions increase the levels of TNFR1, a receptor for the pro-inflammatory cytokine TNF-α at the membrane of the astrocytes enveloping Purkinje cell excitatory synapses in the cerebellar cortex of infected mice. This implies that the response of synaptic complexes to prions involves a glial component.

La dystrophie myotonique de type I (DM1) constitue la plus fréquente des pathologies musculaires héréditaires chez l’adulte. Bien qu’initialement considérée comme une maladie musculaire, la DM1 présente une atteinte neurologique très handicapante. Cette maladie autosomique dominante résulte de l’expansion anormale d’un triplet CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK. Un effet trans du transcrit DMPK muté entraine une dérégulation de l‘épissage alternatif dans de nombreux tissus. Cependant, les mécanismes pathologiques de la DM1 dans le cerveau restent encore peu compris. Afin de disséquer ce mécanisme, notre laboratoire a créé des souris transgéniques exprimant le transcrit DMPK avec de larges expansions CUG dans de nombreux tissus. Ces souris nommées DMSXL, recréent d’importants aspects pathologiques de la DM1, comme des anomalies du comportement et électrophysiologiques du cerveau. Elles représentent donc un excellent outil pour explorer l’effet pathologique de la mutation dans le SNC. En m’appuyant sur ce modèle, j’ai exploré dans un premier temps l’effet trans des ARNs toxiques et l’ampleur de la splicéopathie dans le SNC. De façon intéressante, certains défauts d’épissage sont régions spécifiques, et ne montrent pas d’aggravation avec l’âge des souris DMSXL. Mes résultats démontrent que les ARNs mutés sont capables de déréguler l’épissage alternatif dans l’ensemble du SNC. La région du cervelet a aussi montré des anomalies de l’épissage dans les souris DMSXL, qui, en plus, présentent des perturbations cognitives dépendantes de cette région cérébrale. Le cervelet des souris DMSXL présente aussi des déficits électrophysiologiques suggérant une dysfonction cérébelleuse et plus précisément une dysfonction des cellules de Purkinje. Dans la recherche des populations cellulaires les plus affectées dans le cervelet, j’ai démontré la présence de signes de la toxicité de l’ARN plus marqués dans la glie de Bergman, entourant les cellules de Purkinje. Pour trouver les voies moléculaires perturbées dans le cervelet, et disséquer le mécanisme derrière les anomalies observées, j’ai réalisé une approche protéomique globale et trouvé une sévère baisse de l’expression du transporteur glial de glutamate GLT1/EAAT2, suggérant une dysfonction du cervelet, en conséquence d’un possible métabolisme anormal du glutamate. L’analyse protéomique globale du cerveau des souris DM1 a aussi identifié des différences d’expression et des modifications post-traductionnelles de protéines impliquées dans la signalisation du calcium. L’étude du métabolisme des ARNm dans la DM1 a mis en évidence la dérégulation de l’épissage de gènes impliqués dans le métabolisme du calcium, soutenant l’hypothèse d’une dysfonction calcique dans le SNC. Pour étudier les conséquences de la mutation sur les variations calciques cellulaires, j’ai caractérisé un modèle cellulaire astrocytaire de la DM1. Ce modèle m’a permis de démontrer une localisation anormale du récepteur GRIN1/NMDAR1, ainsi qu’une réponse calcique anormale dans les astrocytes primaires porteurs des amplifications CTG. Malgré les avancés thérapeutiques dans le muscle, on ne sait pas à quel point les stratégies en cours de développement sont efficaces dans le SNC. Pour étudier ce problème, j’ai utilisé le modèle astrocytaire de la DM1 afin de valider in cellulo une stratégie thérapeutique qui vise à rétablir une activité normale du facteur d’épissage MBNL1 endogène. Mes travaux de thèse ont permis d’avancer dans la compréhension de la neuropathologie de la DM1. Ils ont mis en évidence pour la première fois une dysfonction du cervelet, ainsi que la possible dérégulation de la voix calcique dans le SNC. Mes résultats ont donc contribué à mieux comprendre le mécanisme de la DM1 dans le SNC, pour, à long terme, développer des approches thérapeutiques ciblant des évènements moléculaires précis. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most frequent inherited muscular disorder in adults. Although traditionally regarded as a muscle disease, DM1 presents debilitating neurological manifestations. DM1 is an autosomic dominant disease caused by the abnormal expansion of a CTG triplet within the 3’UTR of the DMPK gene. Many molecular aspects of the DM1 are mediated by a trans effect of the expanded DMPK transcripts, whose accumulation leads to splicing deregulation in many tissues. Despite recent progress in the understanding of DM1 pathogenesis in muscle and central nervous system (CNS), the detailed molecular disease mechanism operating in the brain is still poorly understood. In order to investigate the pathophysiology, our laboratory has generated DMSXL transgenic mice expressing DMPK transcripts containing large CUG expansions in many tissues. DMSXL mice mimic important features of the DM1, notably in the CNS, showing behaviour as well as electrophysiological abnormalities. Therefore, this mouse line represents an excellent tool to investigate the toxic effects of the mutation in the CNS. Taking advantages of this transgenic model, I have first explored the trans effect of the toxic RNA and the extent of DM1-associated spliceopathy in the CNS. Interestingly, some splicing defects were region-specific, and their severity did not increase with the age of the DMSXL mice. My data demonstrate that CUG-containing RNAs have a wide deleterious effect and deregulate alternative splicing in many areas of the CNS. In addition to splicing abnormalities in cerebellum, DMSXL mice also displayed deficits in cerebellum-dependant motor coordination. Plus, DMSXL cerebellum showed electrophysiological abnormalities, suggesting cerebellar dysfunction and more precisely Purkinje cell dysfunction. In the search for the cellular populations showing the greatest susceptibility to RNA toxicity in the cerebellum, I have found extensive foci accumulation as well as pronounced splicing defects in the Bergman glia, surrounding Purkinje cells, in DMSXL and DM1 patients cerebellum. In order to identify molecular pathways and mechanisms behind the behaviour and electrophysiological abnormalities detected, I have performed a global proteomics approach and found a severe decrease in the expression of a glial glutamate transporter GLT1/EAAT2, suggesting that DM1 causes cerebellum dysfunction, through abnormal glutamate metabolism. Global proteomic analysis of DMSXL cerebellum also identified expression and post-translational changes of several proteins involved in calcium signalling. Missplicing of different transcripts involved in calcium metabolism reinforces the idea of calcium dysfunction in the neuropathogenesis of the DM1. To study the effects of toxic RNA on calcium homeostasis and flux, I have established and characterised a brain cell model of DM1. DMSXL primary astrocyte cultures allowed me to show the mislocalisation of the glutamate receptor GRIN1/NMDAR1, as well as abnormal calcium responses to stimulation. Despite recent therapeutic advances in muscle, we do not know the CNS efficiency of the therapeutic strategies currently being developed. To address this problem, I have used the DM1 astrocyte cell model to validate in cellulo a therapeutic strategy aiming to restore the activity of the endogenous splicing factor MBNL1. My thesis work provided a significant step in the understanding of the DM1 pathology in the CNS. My results revealed for the first time signs of cerebellum dysfunction in DM1, as well as signs of calcium homeostasis deregulation in the SNC. My work contributed to better understand the pathological mechanisms of DM1, the brain pathways and cell types most susceptible to toxic RNA. In the long term, my data will contribute to the rational development of therapeutic strategies targeting precise and deleterious molecular events.

La cellule de Purkinje (CP) est la seule sortie anatomique du cortex cérébelleux. Des études récentes ont montré que les récepteurs NMDA (NMDA-R) jouaient un rôle essentiel dans le Depression à long terme (DLT) à la synapse entre les fibres parallèles (FP) et les CPs. Les NMDA-Rs pourraient jouer un rôle prépondérant dans l’intégration des informations somato-sensorielles des FPs et ainsi contribuer au rôle du cervelet dans l'apprentissage moteur. Nous montrons que les NMDA-Rs sont fonctionnels et recrutés uniquement lors de patrons de décharges des FPs haute fréquences. Ces résultats étant potentiellement liés aux propriétés biophysiques des NMDA-Rs, nous avons démontré que la PLT dépend des NMDA-Rs comportant les sous unité GluN2A et que l'expression post synaptique de la plasticité s'effectuait à travers une diffusion anterograde du monoxyde d'azote (MA). De plus, nous avons confirmé et disséqué les propriétés de filtre passe haut des NMDA-Rs in vivo et in vitro.Nous avons montré que la PLT nécessitait des trains d'activité des FPs plus long que dans le cadre de la DLT, nous postulons que la quantité de MA produite est plus importante lors de l'induction de PLT. Utilisant nos données, nous avons implémenté un model mathématique de plasticité à la synapses FP-CP pouvant prédire le signe de plasticité synaptique selon les patrons d'activité rencontrés par cette synapse. / Synaptic plasticity is thought to be the cellular mechanism underlying learning and memory and has been the subject of intense experimental and theoretical research. The experimental work has led to detailed knowledge of the receptors and signalling pathways involved in the induction of different types of synaptic plasticity. In parallel, theoretical studies have built ’plasticity rules’, formal descriptions linking spike timings to changes in synaptic efficacy, such as the spike-timing-dependent plasticity (STDP) rule [Gerstner et al., 1996, Song et al., 2000]. However, these plasticity rules are generally quite abstract and their link to the underlying biophysical mechanisms is often unclear. The best known mechanisms in synaptic plasticity are linked to N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA-R) function. NMDA-Rs are biophysical coincidence detectors of glutamate and membrane depolarization [Mayer et al., 1984, Nowak et al., 1984]. The activation of postsynaptic NMDA-Rs defines learning rules where the relative timing of pre- and post-synaptic activity is a key parameter [Debanne et al., 1994, Nevian and Sakmann, 2006, Sjostrom et al., 2003]. In the few cases where the participation of presynaptic NMDA-Rs has been proposed, these have invariably been involved in presynaptically-expressed LTD [Rodríguez-Moreno and Paulsen, 2008b, Sjostrom et al., 2003]. Cerebellar parallel fibre-Purkinje cell (PF–PC) synaptic plasticity follows non-Hebbian plasticity rules. We have previously reported that PF-PC LTD induction needs PF bursting activity (at least pairs of spikes) [Bidoret et al., 2009] and is linked to the presence of presynaptic NMDA-Rs [Casado et al., 2002b]. In this thesis, we set out to characterise the activity requirements for bidirectional synaptic plasticity in young and adult animals, and to investigate the signalling pathways involved. Surprisingly, we found that LTP induction shares many properties with LTD induction, including a similar frequency-dependence for presynaptic activity and an absolute requirement for NMDA-R activation and NO production. However, LTP requires a different source of post-synaptic calcium increase [Ly et al., 2013a]. In contrast with other synapses [Bender et al., 2006, Fino, 2010], our data indicate that both LTP and LTD share signalling mechanisms. These involve presynaptically produced NO and postsynaptic Ca rises. Supporting the notion that the frequency dependence of plasticity arises from the involvement of presynaptic NMDA-Rs, we provide the first direct evidence for Ca influx through presynaptic NMDA-Rs in PFs in young and adult animals, settling a long-lasting controversy [Bidoret et al., 2009, Casado et al., 2002a, Shin and Linden, 2005a, Wang et al., 2014a]. Based on our data, we propose a novel mechanistic plasticity rule. This deliberately parsimonious rule can be used to interpret and predict the plasticity arising from arbitrary patterns of PF and climbing fibre (CF) activity. Our results support the notion that bidirectional synaptic plasticity depends on multi-spike activity patterns in an intricate fashion [Bidoret et al., 2009, Froemke and Dan, 2002, Pfister and Gerstner, 2006, Sjöström et al., 2001].

L’ischémie cérébrale est caractérisée par une interruption totale ou partielle de l’apport sanguine au cerveau, conduisant à une privation d’oxygène et de glucose pour les cellules du cerveau. La série de processus cellulaires qui sont déclenchées par une ischémie cérébrale sont nombreux et complexes. La réduction sévère d’oxygène et de glucose la diminution de la production d’ATP et un changement drastique de la concentration de K+, du pH intracellulaire et extracellulaire et de la production de lactate. La perturbation du métabolisme énergétique au sein des tissus ischémiés conduit rapidement à la dépolarisation membranaire et au relarguage de neurotransmetteurs dans le milieu extracellulaire. Dans le cervelet, l’impact d’un stress ischémique à largement été étudié sur les cellules de Purkinje, seule voie de sortie neuronale du cortex cérébelleux. Il a été montré que le glutamate, relargué par une surexcitation des fibres glutamatergique et par l’inversion des transporteurs du glutamate, est la cause principale de la dépolarisation anoxique des cellules de Purkinje. Cependant, la compréhension de la réponse astrocytaire et l’influence des astrocytes vis-à-vis de l’ischémie ne sont pas encore connu.La cellule de Bergmann est un astrocyte radiaire qui compose un réseau couplé électriquement, formant des interactions anatomiques et fonctionnelles complexes avec les neurones du cortex cérébelleux. En utilisant un modèle in vitro d’ischémie cérébrale, la privation d’oxygène et de glucose (OGD), plusieurs caractéristiques de base de la réaction astrocytaire à l'ischémie sont analysés. Des expériences en patch clamp et d’imagerie calcique sont réalisées sur tranche de cervelet adulte révélant la réponse de la glie de Bergmann à l’OGD par une dépolarisation progressive de la membrane, avec en parallèle une augmentation de calcium cytosolique soutenue. L’enregistrement apparié entre cellule de Purkinje et cellule de Bergmann révèle des différences importantes de réponse à l’OGD entre ces deux types cellulaires. De plus, nous avons mesuré les changements de la concentration de K+ extracellulaire durant l’OGD en utilisant des microélectrodes sensibles aux ions. Nos résultats montrent une corrélation importante entre la dynamique du K+ extracellulaire et la dépolarisation membranaire de la cellule de Bergmann au cours de l’OGD. / Cerebral ischemia is characterized by partial or total interruption of the blood supply to the brain resulting in glucose and oxygen deprivation to brain cells. The series of cellular processes that are unleashed by cerebral ischemia are complex. The severe reduction in oxygen and glucose induces decreases in ATP production and dramatic changes in extracellular K concentration, pH of intracellular and extracellular space and lactate production. The disruption of energy metabolism in the ischemic tissue rapidly lead to membrane depolarisation and neurotransmitters are released into the extracellular space. In the cerebellum, the impact of an ischemic stress has been extensively studied in Purkinje cells, the only neuronal output of the cerebellar cortex. It has been shown that glutamate released from overexcited fibers and from reversal of glutamate transporters, is the principal cause of the dramatic, anoxic depolarization in Purkinje cells. However a detailed understanding of the astrocytic response to cerebellar ischemia and the potential influence of astrocyte to ischemia outcome is still lacking.Bergmann glia (BG) are radial gial cells that form networks of electrically coupled cells underling complex anatomical and functional interactions with the neurons of the cerebellar cortex. Using an in vitro model of cerebral ischemia, the oxygen and glucose deprivation (OGD), several basic features of astrocytic reaction to ischemia are analyzed. Patch clamp and calcium imaging experiments performed in cerebellar slices from adult mice revealed that BG respond to OGD with a progressive membrane depolarisation that is paralleled with a sustained cytosolic calcium increase. Double patch-clamp recordings between Purkinje neurons and BG reveal different responses to OGD in these cell types. Furthermore, we measured extracellular potassium concentration changes during OGD by using ion-sensitive microelectrodes. Our results indicate an important correlation between the BG membrane depolarisation and the extracellular K dynamics during OGD.

Le cervelet est indispensable à la coordination motrice ainsi qu’au maintien de la posture. Le traitement de l’information dans le cortex cérébelleux repose sur une organisation modulaire : chaque module est impliqué dans le contrôle de muscles spécifiques. Des lésions focales du cervelet entrainent des troubles moteurs dans une région précise du corps, conduisant à des pathologies telles que l’ataxie. Ce travail vise à comprendre comment les modules cérébelleux traitent l’information sensorimotrice, communiquent entre eux et leur implication dans la coordination motrice chez la souris. Des approches optiques et électrophysiologiques ont permis d’établir les cartes de connexions synaptiques entre différents modules. L’étude du développement de ces cartes a démontré que la mise en place des synapses entre des modules distants coïncide avec l’émergence de la locomotion. L’emploi de modèles de perturbation de la locomotion a démontré que les cartes synaptiques sont réorganisées suite à l’adaptation de la coordination motrice. Ce projet apporte de nouvelles hypothèses quant au contrôle de la coordination motrice en conditions normales et pathologiques. / The cerebellum is essential for motor coordination and to learn new motor skills. In the cerebellar cortex, information processing is based on a modular organization: each module is involved in the control of specific motor units. Localized lesions of the cerebellum impair coordinated movements in only one part of the body and lead to movement disorders like ataxia. This project aims to understand how cerebellar modules communicate, process incoming information and how they relate to coordinated movements in mice. We combine optical and electrophysiological approaches in vitro in order to determine the functional synaptic maps between different modules. The development of these maps revealed that the establishment of connections between distant modules coincide with the appearance of motor coordination in mice. Using models of motor alteration, we showed that synaptic maps are reorganized following motor adaptation. The results bring new hypotheses about the control of motor coordination in normal and pathological conditions. Future directions will be to assess how a specific activation of identified modules may compensate for motor impairments.

Les médulloblastomes (MB) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes en pédiatrie. Ils apparaissent le plus souvent au niveau du cervelet. Ils peuvent être stratifiés en quatre groupes : les groupes WNT et SHH, où ces voies de signalisation sont altérées, et les groupes 3 et 4, présentant des anomalies chromosomiques et amplifications multiples, dont c-Myc (groupe 3) et N-Myc (groupe 4). L’une des altérations génétiques les plus retrouvées dans les MB est la surexpression du facteur de transcription OTX2. Ce facteur est exprimé dans les précurseurs des cellules granulaires (GCP) du cervelet, cellules d’origine de la majorité des MB. Pendant la période périnatale, les GCP subissent une phase de prolifération très intense en réponse au mitogène Sonic Hedgehog (SHH), ce qui les rendrait particulièrement sensibles à la tumorigenèse. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressé à la fonction d’Otx2 dans ces GCP. Nous avons montré que l’ablation conditionnelle d’Otx2 conduit à un défaut de prolifération des ces cellules. L’analyse approfondie de ce phénotype a permis de révéler qu’Otx2 stimule la prolifération des GCP parallèlement à la voie de signalisation Shh. Par ailleurs, l’ablation d’Otx2 dans un modèle murin mimant la formation de MB Shh-dépendants a montré qu’Otx2 s’avère indispensable pour leur maintien à long terme. En parallèle, nous avons tenté de créer un nouveau modèle murin mimant la formation de MB de groupe 3 en induisant l’expression, pendant la période postnatale, d’un dominant actif de c-Myc dans les cellules exprimant Otx2. Cette approche a donné des résultats inattendus : des carcinomes de plexus choroïdes, et non des MB, ont été obtenus. / Medulloblastomas (MB) are the most common brain tumors in paediatrics. They appear during development in the posterior part of the brain, mainly in cerebellum. MB can be stratified in four groups: the WNT and SHH groups, where these signalling pathways are aberrantly activated, and the groups 3 and 4, which display chromosomal abnormalities and multiple amplifications, including c-Myc (group 3) and N-Myc (group 4). One of the most frequent genetic alterations in MB is the overexpression of the Otx2 transcription factor (in 75% of cases). This factor, which is essential for central nervous system development, is expressed in granule cell precursors (GCP) of the cerebellum, which represent the cell of origin of the majority of MB. During the perinatal period, GCPs undergo intense proliferation in response to Sonic Hedgegog (SHH), making them particularly susceptible to tumorigenesis. During this thesis, we were interested in examining the function of Otx2 in GCPs. We have shown that conditional ablation of Otx2 leads to a GCP proliferation defect and that Otx2 stimulates the proliferation of these cells independently of the Shh signaling pathway. Moreover, ablation of Otx2 in a mice model of Shh-dependent medulloblastomas yielded very interesting results: while Otx2 does not seem to be required for the initiation of these tumors, it is essential for their long-term maintenance. In parallel, we tried to create a new murine model for the MB group 3 by inducing the expression, during the postnatal period, of an active dominant of c-Myc in cells expressing Otx2. This approach yielded unexpected results: choroid plexus carcinomas, instead of MB, were obtained.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGlus) sont connus pour moduler la transmission excitatrice dans le système nerveux central. Parmi ces récepteurs, ceux localisés au niveau de la pré-synapse, exercent un rôle d’autorécepteur, entrainant une diminution de la libération de glutamate à la suite de leur activation. L’étude du rôle fonctionnel de tel ou tel sous-type de mGlus est complexe compte-tenu du manque d’outils pharmacologiques sélectifs permettant de cibler spécifiquement un sous-type mGlus donné. Dans un premier temps, nous avons, par des techniques d’électrophysiologie et de fluorométrie calcique, validé de nouveaux outils pharmacologiques spécifiques de mGlu2 (un « nanobody » modulateur allostérique positif, PAM) et mGlu4 (OptoGluNAM4.1, un modulateur allostérique négatif, NAM), respectivement sur tranches d’hippocampe et de cervelet de rongeur. Nous avons ensuite, au sein du cortex cérébelleux, utilisé l’OptoGluNAM4.1 pour démontrer pour la première fois, l’implication de mGlu4 dans un contexte physio-pathologique: l’ischémie cérébelleuse. A l’aide d’outils pharmacologiques plus classiques nous avons également pu mettre en évidence, au sein des synapses qu’établissent les fibres parallèles avec les cellules de Purkinje l’existence d’un “dialogue” entre les récepteurs mGlu4 et les récepteurs A1 (récepteurs à l’adénosine de type 1), conséquence d’intéractions fonctionnelles entres les voies de signalisation de ces récepteurs présynaptiques dimériques et/ou conséquence de l’association physique de ces récepteurs au sein d’hétérodimères, fonctionnels. / Metabotropic glutamate receptors (mGlus) are known to modulate excitatory transmission in the Central Nervous System. Among them, those situated at the pre-synaptic level behave like autoreceptors, their activation leading to a decrease in glutamate release. Functional studies of the different mGlus have been hampered by the lack of selective pharmacological tools specifically targeting a given subgroup of these receptors. As a first step, using electrophysiological and calcium fluorometry techniques, we validated new specific pharmacological tools acting on mGlu2 (a nanobody, positive allosteric modulator, PAM) and mGlu4 (OptoGluNAM4.1, a negative allosteric modulator, NAM) on rodent hippocampal and cerebellar slices, respectively. We then used the OptoGluNAM4.1 in the cerebellar cortex to demonstrate, for the first time, the involvement of mGlu4 in a physiopathological condition: cerebellar ischemia. Using more conventional pharmacological tools, we were also able to show the existence of a dialog between mGlu4 and A1 (Adenosine type 1) receptors at the level of the synapse between parallel fibers and Purkinje cells. Whether this dialog results from functional interactions between the signaling pathways of these pre-synaptic dimeric receptors and/or is a consequence of their physical association in heterodimers is presently under study.

Le syndrome CANVAS (Cerebellar Ataxia with Neuropathy and Vestibular Areflexia Syndrome) est une ataxie cérébelleuse rare qui apparaît à l'âge adulte, et se caractérise par des déséquilibres et une neuropathie sensorielle. Des expansions répétées introniques bialléliques dans l’intron 2 du gène RFC1 ont été identifiées comme cause du CANVAS. Le gène RFC1 code pour la plus grande sous-unité du Facteur de Réplication C, important à la réplication et la réparation de l'ADN. Alors que onze répétitions pentanucléotidiques (AAAAG)11 sont normalement retrouvées, les expansions pathogènes comprennent généralement des centaines de répétitions (AAGGG)exp. Toutefois, les mécanismes selon lesquels ces expansions répétées provoquent ce trouble neurologique sont inconnus. Des articles récents ont identifié des mutations de décalage de cadre dans RFC1, suggérant la perte de fonction comme mécanisme pathogénique. De manière intéressante, nous avons montré que rfc1 est exprimé dans le cervelet en développement chez la souris et le poisson-zèbre, ce qui indique qu'il pourrait jouer un rôle crucial dans son développement et son activité. Étant donné que l'inactivation de RFC1 chez les mammifères entraîne une létalité embryonnaire, nous avons généré un modèle de poissons-zèbres avec une perte de fonction rfc1-KO en utilisant la méthode CRISPR/Cas9. Nous avons constaté que les larves rfc1-/- survivent jusqu'à 10 jours après la fécondation (dpf) et présentent un phénotype morphologique sévère à partir de 2 dpf. Plus important encore, nous avons montré que le développement du cervelet est sévèrement affecté avec une diminution de la prolifération associée à une augmentation de l’apoptose dans le cervelet des mutants rfc1-/-, conduisant à une désorganisation des cellules de Purkinje et une perte des cellules granulaires. Grâce au séquençage de l'ARNm à cellule unique (single cell RNA sequencing, scRNAseq), nous avons démontré l'importance de rfc1 pour la neurogenèse cérébelleuse et que sa perte de fonction conduit à de graves défauts de progéniteurs. Ce travail est le premier à générer un modèle de poissons-zèbres rfc1-KO et à montrer que RFC1 est important pour le développement du cervelet, suggérant que CANVAS pourrait être causé par un mécanisme de perte de fonction de RFC1. / The Cerebellar Ataxia with Neuropathy and Vestibular Areflexia Syndrome (CANVAS) is a rare adult-onset ataxia with a prevalence of less than 1 in a million, characterized mainly by imbalance and sensory neuropathy. Although CANVAS remained only clinically defined, recent findings identified a biallelic intronic repeat expansion (AAGGG)exp in the RFC1 gene as a major cause of CANVAS. RFC1 encodes the largest subunit of the Replication Factor C required for DNA replication and repair. Whereas the reference allele contains eleven pentanucleotide (AAAAG)11 repeats, the pathogenic expansion usually comprises hundreds of AAGGG repeats. However, the mechanisms by which this repeat expansion in the second intron of the RFC1 gene is causing this neurological disorder are unknown. Recent papers also identified frameshift mutations in RFC1, suggesting that a loss of function could drive pathogenicity. Interestingly, we showed that rfc1 is expressed in the mice and zebrafish developing cerebellum, indicating that it might play a crucial role in its development and activity. Since knocking-out (KO) RFC1 in mammals leads to embryonic lethality, we generated a zebrafish loss-of-function model of rfc1 using CRISPR/Cas9 mutagenesis. We found that rfc1-/- larvae survive until 10 days post-fertilization (dpf), thus leaving us a convenient time to study neurodevelopment without rfc1. We showed that rfc1-/- embryos depict a severe morphological phenotype from 2 dpf onwards. More importantly, we showed that the development of the cerebellum is severely affected, with decreased proliferation associated with increased apoptosis in the cerebellum of rfc1-/- mutants, as well as disorganization of Purkinje cells and a severe reduction in the number of granule cells at 5 dpf. Using scRNAseq, we have demonstrated the importance of rfc1 for cerebellar neurogenesis and that its loss of function leads to severe progenitor defects. This work is the first to generate a KO-rfc1 zebrafish model. Altogether, our work is the first to show that RFC1 is important for the development of the cerebellum and suggests that RFC1's loss of function mechanisms partially causes CANVAS.

« - Comment apprécions-nous la complexité du monde qui nous entoure ?- En bougeant nos yeux !- Pourquoi ?- Parce qu’une perception visuelle efficace (avec une acuité maximale !) nécessite de placer l’image des éléments pertinents du champ visuel au niveau d’une petite partie de notre rétine : la fovéa. » Les saccades oculaires sont les mouvements les plus rapides que peut produire notre organisme et sont malgré tout très précises. Le contrôle de ces mouvements représente un défi pour notre cerveau. En effet, ces saccades sont tellement rapides qu’aucune information visuelle ne peut modifier leur trajectoire en cours d’exécution. Mais alors, de quels moyens dispose notre cerveau pour maintenir ces performances tout au long de notre vie? En cas d’imprécision répétée, des mécanismes vont progressivement modifier l’amplitude de nos saccades oculaires afin d’en rétablir la précision. Cette adaptation saccadique repose sur des modifications centrales plastiques. Ce travail de thèse a comme vocation d’élucider les caractéristiques de l’adaptation saccadique chez l’homme. Des approches complémentaires ont permis d’étudier d’une part, l’adaptation des deux grandes catégories de saccades, réactives et volontaires, et d’autre part, l’adaptation en diminution et en augmentation d’amplitude. Nos données permettent de disséquer les mécanismes d’adaptation saccadique dans leur complexité et de mettre en évidence des structures neuronales indispensables à leur mise en place. Notre travail constitue également le support pour le développement de nouvelles procédures de rééducation, basées sur la plasticité oculomotrice. / “- How can we appreciate the complexity of the surrounding word? - By moving our eyes! - Why? - Because an efficient visual perception (with a maximal acuity!) necessitates placing the image of pertinent element from the visual scene at the level of a small part of our retina: the fovea.” Ocular saccades are the fastest movements our organism can produce and they are also highly precise. The control of these movements is a challenge for our brain. Indeed, these saccades are so fast that no visual information can be used during their execution to modify their trajectory. But then, what means does our brain have to maintain these performances all life long? In case of repeated inaccuracies, some mechanisms will progressively modify the amplitude of our ocular saccades in order to restore accuracy. This saccadic adaptation relies on central plastic modifications. The work of this doctorate has the vocation to elucidate the characteristics of saccadic adaptation in Human. Complimentary approaches allowed to study on one side, the adaptation of the two main saccade categories, reactive saccades and voluntary saccades, and on another side, the adaptation decreasing and increasing saccade amplitude. Our data dissects the complexity of mechanisms underlying saccadic adaptation and highlights the neural substrates necessary for these adaptive changes to take place. Our work constitutes also the basis for the development of new rehabilitation procedures, usingoculomotor plasticity.