Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:14:57Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / O agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se principalmente ao nível pós-transcricional o que dificulta a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e torna atrativa a abordagem proteômica. Estudos teóricos anteriores predisseram uma distribuição bimodal entre as faixas ácidas e básicas de géis bidimensionais virtuais de tripanossomatídeos. Contudo, trabalhos experimentais com T. cruzi tem gerado perfis 2-DE com uma distribuição assimétrica e poucos spots protéicos na região alcalina. Com o objetivo de verificar se as diferenças entre os perfis reais e virtuais eram resultado de limitações técnicas das metodologias atuais de 2-DE em faixas básicas de pH, foram feitas análises proteômicas das formas de vida do T. cruzi utilizando-se condições otimizadas para a faixa de pH 6-11. Assim, os subproteomas alcalinos das formas tripomastigota e epimastigota foram comparados usando-se a metodologia de “gel dois-em-um” (“two-in one gel”) a qual, por minimizar as variações inerentes a 2-DE, facilitou a análise computacional de imagens. Um segundo estudo, concentrou-se na comparação das formas tripomastigota e amastigota, também utilizando uma estratégia de 2-DE-MS. Os resultados revelaram diferenças na expressão de proteínas entre as formas adaptativas do parasito, de acordo com suas características biológicas e corroboraram estudos proteômicos anteriores. Por exemplo, as enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e desidrogenases foram mais abundantes na forma epimastigota, enquanto que trans-sialidases e proteínas paraflagelares foram encontradas especificamente na forma tripomastigota Sabendo-se que o fenômeno de fosforilação/desfosforilação de proteínas está implicado na diferenciação do T. cruzi, procedeu-se o estudo da variação do fosfoproteoma do parasito durante a amastigogênese pela detecção direta das proteínas fosforiladas em géis 2-DE. Assim, verificou-se que várias proteínas apresentaram variação de fosforilação ao longo da amastigogênese, principalmente aquelas associadas ao citoesqueleto, envolvidas no enovelamento protéico e com funções metabólicas. / The etiological agent of Chagas disease is the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The fact that T. cruzi gene expression regulation occurs mainly at post transcriptional level prevents the direct correlation between mRNA and protein levels, and makes the proteomic approach very attractive. Previous theoretical studies predicted a bimodal distribution among acid and alkaline pH ranges in virtual 2-DE gels of trypanosomatides. On the other hand, 2-DE experiments on T. cruzi have generated assimetric profiles with very few spots on the alkaline region of the gel. Aiming at verifying whether the differences between real and virtual profiles were due to the technical imitations of current 2-DE methodologies in the basic pH range, we carried out proteome analysis of T. cruzi life stages using conditions optimized for the 6-11 pH range. Therefore, trypomastigote and epimastigote alkaline subproteomes were compared using the “two-inone gel” methodology which, by minimizing inherent 2-DE limitations, facilitated computational image analysis. A separate study focused on the comparison between trypomastigote and amastigote life stages also using a 2-DE-MS approach. Overall, the results revealed differences in protein expression between the adaptative forms of the parasite, in agreement with their biological traits, as well as corroborated previous proteomic studies. For instance, enzymes related with aminoacid metabolism and dehydrogenases were more abundant in the epimastigote stages while trans-sialidases and paraflagellar proteins were specifically found in trypomastigote 2-DE profiles. Since phosphorylation/dephosphorylation is implicated in T. cruzi differentiation, we followed variations of T. cruzi phosphoproteome during amastigogenesis through direct phosphoprotein detection in 2-DE gels. Thus, we verified that several proteins presented variation in phosphorylation profiles during amastigogenesis, specially those proteins associated wih cytoskeleton, involved in protein folding and those with metabolic functions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2014-05-20T12:37:28Z No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma parasitose de grande relevância na América Latina. A divisão celular do T. cruzi possui características incomuns à maioria dos eucariotos, dado que durante o processo não ocorre o desaparecimento da membrana nuclear e condensação de seus cromossomos. O objetivo deste trabalho foi o estudo do conjunto de proteínas (proteoma) presentes no núcleo da forma epimastigota do T. cruzi. Para tanto, lisados celulares do parasito foram submetidos a um fracionamento celular por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. O enriquecimento nuclear foi validado por microscopia de fluorescência com marcação para DNA e as imagens comparadas com a microscopia de campo claro, mostrando que a fração nuclear foi obtida com alto grau de pureza. A análise por SDS-PAGE mostrou diferenças evidentes de perfil proteico entre o extrato nuclear e extratos das demais frações obtidas durante o fracionamento. As proteínas do subproteoma nuclear foram posteriormente analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e por digestão tríptica seguida de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Usando esta última abordagem foi identificadas mais de 800 proteínas sendo quase 30% hipotéticas. Dentre os principais processos biológicos encontrados para as proteínas identificadas estão processos catabólicos, biossintéticos, geração de metabólitos e energia, processo metabólicos nucleares e tradução. As proteínas encontradas poderão ser alvos de futuros estudos para a elucidação de processos como divisão celular, transcrição gênica e formação de cromossomos, que hoje ainda não são bem elucidados. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas´ disease, a disease of great relevance in Latin America. The replication process of the T. cruzi possesses unusual features, when compared to other eukaryotes; given that during this process, the nuclear membrane does not disappear and there is not chromosome condensation. The goal of this project was to study the set of proteins (proteome) that are present in the nucleus of the T. cruzi epimastigote life form. To this end, the parasite cell lysates were subjected to cell fractionation by sucrose gradient ultracentrifugation. As a way to validate these purity of the isolated cell fractions, we used optical microscopy methods including bright field analysis and fluorescence microscopy after DNA labeling. The images demonstrated that the nuclear fractions were obtained with high purity. Furthermore, SDS-PAGE analysis showed differences in protein profiles between the nuclear extracts and extracts of other fractions obtained during the fractionation. The proteins of the nuclear subproteome were subsequently analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Using the latter approach, we identified more than 800 proteins with almost 30 % being hypothetical. Among these proteins many are involved in important biological processes such as catabolic and biosynthetic pathway, metabolites and energy generation, nuclear metabolites and translation. Hence, the proteins describe in this work may be use in future studies to elucidate processes such as cell division, transcription and chromosomes packaging, which are not fully well understood.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T15:15:05Z No. of bitstreams: 2 Tese Michele France da Cruz.pdf: 1121927 bytes, checksum: 696b33f26da7188597ec86f1c9d0e0ff (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T15:15:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Michele France da Cruz.pdf: 1121927 bytes, checksum: 696b33f26da7188597ec86f1c9d0e0ff (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-20 / FACEPE / Passados mais de 100 anos da descoberta da doença de Chagas pelo médico sanitarista Carlos Chagas, cujo agente etiológico é Trypanosoma cruzi (T. cruzi), essa doença ainda vêm afetando milhões de pessoas em todo o Mundo, principalmente no continente americano. Apesar da disponibilidade de dois fármacos no mercado para o tratamento da doença de Chagas, o nifurtimox e o benzonidazol, eles apresentam uma limitada eficácia na fase crônica e efeitos tóxicos indesejáveis ao ser humano. Com isso, outras substâncias vêm sendo estudadas, dentre elas temos os derivados imidazolidínicos por possuírem diferentes atividades farmacológicas dentre elas esquistossomicida, antimicrobiana, anticonvulsivante, antitumoral e tripanocida. Por isto, o presente trabalho tem como objetivo sintetizar novos derivados imidazolidínicos a partir de novas moléculas 3-benzil-5-benzilideno-imidazolidina-2,4-diona (LPSF/PT) visando contribuir na introdução de novos agentes com potencial tripanocida. Os novos derivados foram obtidos em duas etapas. Primeiramente, a imidazolidina-2,4-diona reagiu com os haletos de benzila e hidróxido de sódio como catalisador, formando o 3-benzil-imidazolidina-2,4-diona (LPSF/PT), por meio de uma reação de N-alquilação. Em seguida, os derivados imidazolidínicos 3,5-dissubstituídos (LPSF/PT) foram obtidos através de uma reação de condensação da 3-benzil-imidazolidina-2,4-diona com benzaldeídos substituídos em presença de morfolina. As estruturas químicas dos compostos sintetizados foram caracterizadas através de técnicas espectroscópicas: ressonância magnética de hidrogênio e carbono (RMN 1H e 13C) e espectroscopias na região do infravermelho (IV). A atividade tripanocida dos novos derivados imidazolidínicos (LPSF/PT-139, LPSF/PT-145, LPSF/PT-151, LPSF/PT-152, LPSF/PT-167, LPSF/PT-214) foram avaliadas sobre as formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) em diferentes concentrações e assim foi calculado o valor da IC50. Dentre os compostos testados, o composto LPSF/PT-152 apresentou melhor resultado para a forma tripomastigota, por apresentar IC50 de 1,26 μg/mL. Enquanto os compostos LPSF/PT-145 e LPSF/PT-214 para a forma epimastigota, por apresentarem, respectivamente, IC50 de 2,11 μg/mL e 2,89 μg/mL. De acordo com os resultados obtidos, podemos sugerir a eficácia destes novos compostos imidazolidínicos e o potencial fármaco tripanocida.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2018-02-26T14:19:29Z No. of bitstreams: 1 Igor Ramon Lomba Barreto.pdf: 3736181 bytes, checksum: ecfcbc6577d554a095f221827960499b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-26T14:19:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Igor Ramon Lomba Barreto.pdf: 3736181 bytes, checksum: ecfcbc6577d554a095f221827960499b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, é uma infecção que possui maior impacto na América Latina, onde a doença é endêmica em vários países. No Brasil, há um grande número de casos, que representam aproximadamente 23% da população mundial infectada. O desenvolvimento de novas substâncias para o tratamento desta doença é de grande relevância, especialmente por apenas o benznidazol ser disponibilizado no Brasil. A enzima cruzaína, uma cisteíno protease essencial para a sobrevivência do parasita, é considerada um alvo terapêutico para a pesquisa e desenvolvimento de novos agentes antichagásicos e a determinação dos grupos ligantes e modos de interação contribui com a busca de novos fármacos com ação nesse alvo terapêutico. Este trabalho teve como objetivo o planejamento de novos compostos pirazolo[1,5-a]pirimidinas com potencial atividade antichagásica, visando a cruzaína como alvo terapêutico. No planejamento dos compostos, foram utilizadas, como ponto de partida, moléculas sintéticas com atividade inibitória reversível sobre a enzima cruzaína e/ou antiparasitária e o conceito de bioisosterismo. Na simulação de possíveis interações entre ligantes e enzima, foram utilizadas as técnicas computacionais de "docking" e dinâmica molecular. Foi realizado o mapeamento dos pontos de interação entre a cruzaína e uma série de cinco inibidores descritos na literatura para validação do protocolo de simulação. Na investigação computacional dos compostos planejados, foram encontradas interações semelhantes às descritas para os inibidores utilizados no protocolo de validação. Os resultados apontam o composto planejado 5-amino-2,7-dimetil-N-(pirimidin-2-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina como o mais promissor para a inibição da cruzaína do T. cruzi e com viabilidade sintética para a sua obtenção / Chagas' disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi is an infection with a greater impact in Latin America, where the disease is endemic in several countries. In Brazil, there are many cases, representing approximately 23% of the people worldwide infected. Accordingly, the development of new substances for the treatment of this disease is of great relevance, especially since there is only benznidazol available in Brazil. The cruzain enzyme, a cysteine protease essential for the survival of the parasite, has been considered as a therapeutic target in the research of new antichagasic agents, and the determination of the binding groups and modes of interaction contributes to the to the search for new drugs with action in this therapeutic target. The present work aimed the design of new pyrazolo[1,5-a]pyrimidines with potential antichagasic activity, hinting at cruzain as therapeutic target. Synthetic compounds with reversible inhibitory activity on the cruzain and / or antiparasitic activity, in addition to the concept of bioisosterism, were used as a starting point for new compounds design. The computational techniques of "docking" and molecular dynamics were used in the simulations of possible interactions between binders and enzyme. Validation of the simulation protocol was carried out by mapping of interaction between the cruzain and a series of five inhibitors described in the literature. The computational investigation of the designed compounds showed interactions with the enzyme in a similar way to those described for the inhibitors used in the validation protocol. The results point to the 2,7-dimethyl-N-(pyrimidin-2-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-amine as the most promising inhibition activity against cruzain and synthetic viability for its preparation

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:26:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2151_1.pdf: 10414643 bytes, checksum: 6f935e65fc371d3afec0d8b9219be771 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A melhoria da solubilidade de compostos fracamente solúveis é um objetivo perseguido para os pesquisadores da química medicinal, porém mesmo havendo tal preocupação, a grande maioria dos compostos que demonstram atividade biológica possuem um entrave biofarmacêutico importante, a baixa solubilidade aquosa. A tecnologia farmacêutica por meio de sistemas como dispersões sólidas e a obtenção de complexos de inclusão utilizando ciclodextrinas surge como ferramenta útil no aumento de solubilidade de fármacos de baixa lipofílicos. Diante do exposto o objetivo deste trabalho foi a obtenção e caracterização do benznidazol, dispersões sólidas, de complexos de inclusão e multicomponentes no estado sólido visando o incremento da velocidade de dissolução do fármaco. Foram utilizados polímeros hidrofílicos, ciclodextrinas naturais (alfa, beta e gama) além de derivados da beta ciclodextrina tais como metilada e éter sulfobutílico. Malaxagem, rotaevaporação e liofilização foram os métodos utilizados na obtenção dos sistemas. Na caracterização foram utilizadas as ferramentas de IV, Raman, DSC, MEV, Raios-X e perfil de dissolução. Os sistemas obtidos (dispersões sólidas, complexos de inclusão e multicomponentes) no estado sólido apresentaram, via de regra, bom incremento de velocidade de dissolução frente ao BNZ isolado, fato confirmado nos cálculos da eficiência de dissolução, com destaque para os compostos obtidos pelos processos de rotaevaporação e liofilização. Pode-se concluir que a utilização da tecnologia farmacêutica para a obtenção desses sistemas com o BNZ é uma alternativa promissora para uma forma farmacêutica mais segura e eficaz para o combate a doença de Chagas

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-09T20:04:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Lívia Bandeira Costa.pdf: 7587037 bytes, checksum: 5852f9ada72b6f79f15f213c3df29a36 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-09T20:04:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Lívia Bandeira Costa.pdf: 7587037 bytes, checksum: 5852f9ada72b6f79f15f213c3df29a36 (MD5) Previous issue date: 2015-08-21 / CAPES / As diversas formas de Leishmanioses e a doença de Chagas apresentam grande impacto na qualidade de vida dos indivíduos acometidos. Não existem vacinas para humanos disponíveis para essas enfermidades e as drogas utilizadas no tratamento apresentam efeitos adversos e eficácia limitada. Neste contexto, compostos orgânicos vêm sendo testados como alternativa terapêutica. Dentre esses, destacam-se as hidrazonas, moléculas que possuem ação antiparasitária entre outras atividades farmacológicas. A triagem de compostos, utilizando a metodologia atual de ensaios de alto rendimento (High-throughput screening-HTS), possibilita avaliar uma grande quantidade de moléculas candidatas com eficiência, baixo custo e confiabilidade. No presente trabalho, foram avaliadas as atividades leishmanicida, tripanocida e citotóxica de 50 hidrazonas (tiossemicarbazonas, tiazolinonas e tiazóis), através do método HTS. Os resultados demonstraram que 43 compostos não apresentaram citotoxicidade frente às células HepG2 (células de hepatoma humano). Entre esses, sete compostos apresentaram atividade leishmanicida no ensaio de infecção, além de serem inativos no teste de citotoxicidade em células THP-1 (linhagem celular da leucemia humana aguda monocítica). De acordo com os critérios de seletividade, o composto LpQM-15 foi o mais ativo contra Leishmania sp. sendo, por essa razão utilizado para estudos posteriores sobre os seus possíveis mecanismos de ação no parasito. A análise ultraestrutural da atividade desse composto em promastigotas de Leishmania chagasi foi realizada por microscopia eletrônica de transmissão. Com objetivo de analisar alterações morfofisiológicas causadas pelo LpQM-15, parasitos tratados e controles foram submetidos a marcação com Anexina V, Iodeto de Propídio e Rodamina 123, e analisados por microscopia confocal e citometria de fluxo. A análise ultraestrutural relevou aumento do volume da mitocôndria, perfis de membrana mitocondrial concêntricos, inchaço das cisternas do complexo de Golgi e do retículo endoplasmático, ruptura da membrana celular, desorganização das organelas e a forte presença de inclusões lipídicas. O LpQM-15 foi capaz de induzir alterações no potencial de membrana mitocondrial. Além disso, os dados mostraram que este composto, nas concentrações testadas, induziu um mecanismo de morte celular sugestivo de apoptose nos parasitos. Das 43 moléculas não tóxicas frente às linhagens HepG2 e NIH-3T3 (fibroblastos), 12 apresentaram atividade tripanocida. Entretanto, três moléculas exibiram melhores resultados (LpQM-19, LpQM-28 e LpQM-31), corroborados através do modelo de relação quantitativa entre estrutura e atividade (QSAR). Adicionalmente, os compostos selecionados com atividade tripanocida não afetaram a viabilidade de células THP-1. Esses resultados sugerem que as moléculas bioativas frente à Leishmania sp. (LpQM-15) e ao T. cruzi (LpQM-19) são promissoras, apontando-as como candidatas a fármacos contra leishmaniose e doença de Chagas. / The several forms of Leishmaniasis and the Chagas disease are illness that cause a great health impact to the life quality of infected individuals. No human vaccines are available for these diseases and the currently used therapy shows serious adverse effects and limited efficacy. Therefore, the development of new therapeutic strategies is needed. In this regard, several organic compounds have been tested as an alternative therapy. Among these compounds, the hydrazones have been recognized for having a potential antiparasitic activity. The screening of compounds using HTS (high-throughput screening) allows to evaluate a big set of molecules with efficiency, quickness, low costs, and reliability, in a standardized way. In the present work the leishmanicidal, trypanocidal and cytotoxic activities of 50 hydrazones (thiosemicarbazones, thiazolinones and thiazoles) were evaluated using HTS assay. Of the 50 compounds analyzed, 43 did not show cytotoxicity against HepG2 (human hepatocellular liver carcinoma cell line). Among these compounds, seven showed positive activity on the intramacrophage assay besides not presenting cytotoxicity against THP-1 (human monocytic leukemia cell line). According to the selectivity criteria, the LpQM-15 compound was the most effective against Leishmania sp., and in this regard, it was used for further studies on its putative action mechanisms on this parasite. The ultrastructural analysis of Leishmania chagasi promastigotes treated with LpQM-15 revealed an increase in the mitochondrial volume, presence of concentric membranous profiles inside the mitochondrion, the swelling of the Golgi apparatus cisternae and endoplasmic reticulum, disruption of plasma membrane, cellular disorganization and the presence of a number of lipid inclusions. Aiming to evaluate the effects of LpQM-15 on the cell viability and mitochondrial membrane potential treated and untreated cells were submitted to annexin-V/propidium iodide and Rhodamin 123 labelling, respectively and analyzed by confocal microscopy and flow cytometry. LpQM-15 caused alterations in the mitochondrial membrane potential. Furthermore, our results suggest that LpQM-15, at tested concentrations, induced an apoptosis-like death in parasites. In Chapter 2, the trypanocidal and cytotoxic activities of compounds were evaluated. Of the 43 non-toxic compounds against HepG2 and NIH-3T3 (fibroblasts), 12 showed trypanocidal activity. The LpQM-19 LpQM-28 and LpQM-31 compounds showed to be the most effective against T. cruzi, being their trypanocidal activities corroborated by the quantitative structure-activity relationship model (QSAR). The most effective selected compounds against Leishmania sp. and T. cruzi showed no effect on the viability of THP-1. Taken together, our results point the LpQM-15 and LpQM-19 as drug candidates against leishmaniasis and Chagas disease, respectively.

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T05:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verinaud_LianaMariaCardoso_D.pdf: 10390596 bytes, checksum: 66a15d762e79aa27cddaf2c35dcd05d1 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A manutenção de formas sanguícolas do Trypanosoma cruzi nos laboratórios que desenvolvem pesquisas com o parasita é realizada através de repiques de sangue do hospedeiro previamente infectado. Entretanto, até recentemente estes animais eram criados de modo convencional, ou seja, em condições favoráveis à infecção com diferentes patógenos naturais, inclusive vírus de difícil detecção e controle. Com a implantação do CEMIB-UNICAMP, capaz de fornecer animais controlados do ponto de vista genético e sanitário, resolvemos investigar se algum destes patógenos murinos, estaria sendo transmitido junto com o parasita e se algumas características da Doença de Chagas experimental estariam sendo alteradas por este(s) contaminante(s). MAP testes realizados com soro de animais infectados com Trypanosoma cruzi indicaram a presença de coronavírus em estoques do parasita mantidos exclusivamente por passagem de animal para animal. Estoques previamente mantidos em meios de cultura de células ou em meios axênicos não indicaram a presença de contaminantes. Os resultados obtidos mostraram que camundongos infectados com o estoque contaminado apresentavam níveis de parasitemia e taxa de mortalidade mais elevados que os animais infectados os estoques não contaminados. Além disso, o plasma filtrado de animais infectados com o estoque contaminado foi capaz de elevar os níveis de parasitemia e de mortalidade de animais infectados com os estoques não contaminados. O fator, presente no plasma dos animais infectados com o estoque contaminado era sem dúvida um vírus, denominado vírus X, uma vez que podia ser seriadamente transferido de animal para animal, era completamente inativado quando aquecido a 56° C por 45 minutos e tinha sua virulência aumentada provocando a morte de animais de quatro semanas de idade após a transferência seriada. Anticorpos anti-X, preparados com a décima passagem seriada do vírus, ou anticorpos anti-MHV3 (Murine Virus Hepatitis-3) foram capazes de proteger os animais jovens da morte, quando estes eram desafiados com o vírus X, e de diminuir a parasitemia quando os animais eram infectados com o estoque contaminado. Estes dados indicavam que cepas de Trypanosoma cruzi, mantidas apenas por transferência de animal para animal, poderiam estar contaminadas com um vírus capaz de aumentar a patogenicidade do parasita ou de alterar a resposta imune do hospedeiro. Animais infectados com o estoque contaminado ou com o vírus isolado, apresentaram uma marcada linfopenia, no segundo dia após a infecção, enquanto que nenhuma alteração foi observada nos animais infectados com os outros estoques do parasita. Experimentos de neutralização, utilizando anticorpos anti-X, mostraram que esta linfopenia podia ser completamente abolida. Alterações do peso e da celularidade de diferentes órgãos linfóides também foram observadas, sendo evidenciada perda da arquitetura tímica e alterações no processo de maturação de células da medula óssea quando os animais eram infectados com o estoque de parasitas contaminado ou com o vírus isolado. As populações de células, apresentando marcadores específicos para linfócitos B e T, mostraram alterações em diferentes tecidos linfóides. Observou-se uma profunda queda na porcentagem de células T e B, quando os animais eram infectados com o vírus isolado ou com o estoque do parasita contendo este contaminante. Estes resultados confirmam e estendem, também para a Doença de Chagas experimental, os dados obtidos na literatura de que este vírus é capaz de alterar as respostas do hospedeiro, através da imunomodulação, e indicam que alguns dados obtidos com a infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi devem ser interpretados com cautela / Doutorado / Imunologia / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Claudio Lucio Rossi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T01:18:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Partel_ClaudiaDambroski_M.pdf: 1594290 bytes, checksum: e86f411daa6a16b26e173461e10bb358 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A Doença de Chagas, infecção causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, em pessoas imunocompetentes é, geralmente, assintomática ou se apresenta associada com manifestações clínicas leves e não específicas. Os pacientes com infecção crônica podem apresentar anormalidades cardíacas e/ou digestivas severas, mas estas manifestações clínicas são, usualmente, precedidas por muitos anos de infecção assintomática. Deste modo, a suspeita clínica da infecção, além de levar em consideração aspectos epidemiológicos, deve ser confirmada por dados laboratoriais. O diagnóstico da fase crônica da infecção chagásica é, geralmente, baseado na presença de níveis significativos de anticorpos específicos, desde que a detecção de parasitas circulantes é, frequentemente, dificil, em consequência dos baixos níveis de parasitemia. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma técnica imunoenzimática (ELISA) rápida e quantitativa para o imunodiagnóstico da Doença de Chagas. Considerando que o desempenho de uma técnica imunológica depende, em grande parte, da preparação antigênica utilizada, o extrato bruto de T.cruzi foi fracionado por cromatografias de afinidade (Sepharose 4B-Ientil-Iectina) e de troca iônica (DEAESephacel), na tentativa de se encontrar frações com alta atividade antigênica específica e baixa reatividade cruzada. Uma fração do parasita obtida por cromatografia em DEAESephacel foi selecionada com base na reatividade apresentada com soros de pacientes com Doença de Chagas e leishmaniose. A técnica ELISA foi padronizada utilizando um sistema comercial para reações imunoenzimáticas - "falcon assay screening test" (FAST -ELISA). Este sistema é constituído por placas apropriadas para todos os pàssos da reação, incluindo uma placa que possui uma tampa de plástico onde estão fixadas 96 esferas de poliestireno que se encaixam nos orificios de placas de microtitulação. Na realização do teste, a tampa com esferas revestidas com a preparação antigênica de T.cruzi foi transferi da., sucessivamente, após as lavagens necessárias, para as placas contendo as amostras de soros sendo testadas, o conjugado (anti-IgG humana marcada' com peroxidase) e o sistema substrato (tetrametilbenzidina/peróxido de hidrogênio). Nas incubações com os soros, conjugado e substrato (5 minutos cada, à temperatura ambiente) as placas foram colocadas sobre um aparelho com movimentos orbitais e agitadas continuamente. As absorbâncias das reações foram medidas a 630 nm na placa contendo o substrato. Em todos os ensaios, foram inclui dos soros padrões contendo concentrações conhecidas de anticorpos anti-T.crozi, em termos de unidades de atividade por ml (V/ml). Cada soro foi testado em triplicata e a absorbância média foi transformada em U/ml utilizando a curva padrão. Em um estudo comparativo, anticorpos IgG anti-T.crozi foram pesquisados com as técnicas de ELISA e IFI em 50 pacientes chagásicos crônicos, 58 pacientes com infecções heterólogas e em 20 pessoas sadias. A técnica ELISA apresentou sensibilidade de 98% e especificidade de 99%, enquanto que a sensibilidade e a especificidade obtidas com a reação de IFI foram, respectivamente, 92% e 96%. O bom desempenho, em termos de sensibilidade e especificidade, mais a simplicidade e rapidez, evidenciam que a técnica de ELISA, por nós desenvolvida, pode ser de grande utilidade para o imunodiagnóstico da Doença de Chagas / Abstract: Chagas' disease, an infection caused by the parasite Trypanosoma crnzi, is generally asymptomatic or is associated with mild, non-specific clinical manifestations in immunocompetent subjects. Severe cardiac and/or digestive system abnorrnalities may develop in chronically infected patients, but these clinical manifestations are usually preceded by many years of asymptomatic infection. For this reason, the clinical diagnosis should always be considered in an epidemiological context and confirrned by laboratory data. The diagnosis of chronic Chagas' disease is generally based on detecting specific antibodies, since the detection of circulating parasites is often difficult in view of the low levels of parasitemia. The purpose of this study was to develop a rapid and quantitative enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of Chagas' disease. Considering that the perforrnance of an immunological technique is highly dependent on the antigen used, a T.crnzi crude extract was fractionated by affinity chromatography (Sepharose 4B-lentil lectin) and ionic exchange chromatography (DEAE-Sephacel) in an attempt to identify fractions with both a high specific antigenic activity and a low cross reactivity. One fraction of the parasite extract obtained by chromatography on DEAE Sephacel was selected for further study based.on its reactivity with sera from patients with Chagas' disease and leishmaniasis. The ELISA procedure was standardized using the Falcon assay screening test (FAST-ELISA / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:17:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_AnnaMariaAlvesdePiloto_M.pdf: 1840150 bytes, checksum: 0aff6011fffecb965f2404ee6d9ed22a (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiavegatto_CamilaWhonrathMorisco_M.pdf: 6305800 bytes, checksum: d06eeff5b5078e4a1fd37a8c2c30a3b3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Em resposta a invasão pelo Trypanosoma cruzi (T.cruzi) a célula libera uma série de espécies reativas de oxigênio e ao mesmo tempo ocorre um aumento de concentração de cálcio no citosol indispensável para a penetração do parasita. O T.cruzi apresenta uma capacidade limitada em lidar com o estresse oxidativo, levando esta área a ser de grande interesse para a terapêutica. A triparedoxina peroxidase (TXNPx) é uma enzima antioxidante que participa de uma cascata enzimática para a detoxificação de hidroperóxidos descrita em T.cruzi que oferece novas opções para o desenvolvimento de agentes tripanossomicidas mais específicos. Duas cepas com diferentes resistências ao estresse oxidativo gerado pelo peróxido de hidrogênio foram utilizadas nesse trabalho. A cepa Tulahuen 2 apresenta menor tempo de geração e uma maior resistência ao estresse oxidativo, além de um maior índice de crescimento e concentração de TXNPx em relação a cepa Y. Correlacionando o número de células com o conteúdo protéico total, a cepa Tulahuen 2 apresenta uma relação maior do que a outra cepa estudada. Durante a fase lag, em ambas as cepas, ocorre um aumento da expressão da TXNPx. Nas condições testadas, as duas cepas metabolizaram o H2O2 na mesma velocidade. Baixas concentrações de H2O2, levaram a um estímulo da proliferação celular (cepa Y) dando suporte a idéia que este agente pode agir como segundo mensageiro. Essas células são capazes de se adaptar ao estresse oxidativo quando tratadas inicialmente com uma concentração citotóxica e depois desafiadas com uma dose citostática. Esta adaptação é temporária, induzindo a resistência até l h 30min após o pré- tratamento. A triparedoxina peroxidase está envolvida na adaptação ao estresse oxidativo de células epimastigotas de T. cruzi uma vez que tratando-se as células com baixas e altas concentrações de H2O2 observa-se um aumento da expressão desta proteína / Abstract: In response to invasion by T. cruzi, cells generate reactive oxygen species (ROS), occurring at the same time an increase in cytosolic calcium concentration that is essential for invasion. T. cruzi has a limited capacity to deal with oxidative stress, being this area of great interest for therapeutics. Typaredoxin peroxidase (TXNPx) is an antioxidant protein that participates in an enzymatic cascade for hydroperoxide detoxyfication in T. cruzi offering new options for the development of more specific drugs. Two T. cruzi strains with different resistance to the oxidative stress generated by H2O2, were used in this study. Tulahuen 2 strain has a smaller doubling time and a higher growth index, tryparedoxin peroxidase expression and resistance to oxidative stress. The correlation between cell number and total protein content was also higher in this strain. During the lag phase, for both strains, there is a higher expression of TXNPx. In the conditions used, both strains metabolized H2O2 at the same rate. Low concentrations of H2O2 were able to stimulate cell growth in T. cruzi (Y strain) giving support to the idea that it can act as a second messenger. These cells were also able to adapt to oxidative stress when treated with atoxic H2O2 concentrations and then challenged with citostatic concentrations. This adaptation is transient inducing resistance to challenging for a maximum of 1 h 30 min. Tryparedoxin peroxidase is involved in the adaptation of T. cruzi (Y strain) to oxidative stress since treatment with lower and higher H2O2 doses induced an increase in its expression / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular