Investigou-se a existência de relação entre células normais de triatomíneos, formas evolutivas do T.cruzi e hospedeiros mamíferos. Hemócitos do vetor de espécies hematófagas não infectadas (Triatoma infestans, T. palidipennis, Dipetalogaster maximus, Rhodnius prolixus e Panstrongylus megistus) foram reconhecidos por soros de pacientes e camundongos infectados com Trypanosoma cruzi, por meio da técnica de imunofluorescência, enquanto que os hemócitos de um inseto fitófago, Diactor billineatus (ninfas e adultos) não foram reconhecidos pelos mesmos soros. Uma parcial reação cruzada foi observada entre hemócitos de T. infestans e soros de portadores de leishmaniose , o que não ocorreu com as amostras de portadores de doenças autoimunes, infecção com HIV e indivíduos normais. O tratamento de hemócitos com metaperiodato de sódio aboliu a fluorescência, mostrando que antígenos carboidratos estão envolvidos. O uso de lectinas marcadas revelou que N acetil-d-glicosamina, manose, glicose e βgal fazem parte da estrutura celular. O immunoblotting com extrato de hemócitos foi realizado com soros de pacientes chagásicos crônicos antes e depois do tratamento específico. Estes soros de ambos casos foram absorvidos com tripomastigotas e epimastigotas. Um número considerável de bandas desapareceu nos soros tratados com tripomastigotas, mas não com epimastigotas. Proteínas de 61-70, 41-50, 31-40 e 21-30 kDa foram as envolvidas no processo de absorção. Após a quimioterapia, as bandas de 121-130, 91-100, 81-90 e 61-60 kDa desapareceram nos soros não absorvidos. Um grupo de camundongos fêmeas A/Sn foi imunizado com hemolinfa livre de hemócitos (HL) e outro grupo com hemócitos (Hc) e desafiados com 5x102 tripomastigotas sangüícolas.(cepa Y). Picos de parasitemia dos camundongos HL e Hc foram observados um ou dois dias após o grupo controle. Apesar da parasitemia de ambos os grupos ter sido baixa, o grupo HL apresentou 43% de mortalidade, enquanto que o grupo Hc mostrou apenas 14 % de mortalidade. As citocinas IFNγ e TNFα estão envolvidas no processo de proteção,\' assim como óxido nítrico e anticorpos líticos. Os hemócitos induziram uma redução de IL-10, inibindo a resposta Th2. Desde que os hemócitos e tripomastigotas compartilham epítopos comuns, epítopos de hemócitos devem ser melhor estudados em virtude de seu potencial uso no imunodiagnóstico, imunoproteção e avaliação terapêutica. / Immunological relationship between normal triatomine cells, developmental life-cycle stages of T. cruzi and infected mammal hosts was investigated. Hemocytes from uninfected hematophagous vector species of triatomines (Triatoma infestans, T. palidipennis, Dipetalogaster maximus, Rhodnius prolixus and Panstrongylus megistus) were recognized by sera from patients and mice infected with Trypanosoma cruzi, by means of immunofluorescence assay (IFA), whereas hemocytes from a phytophagous bug, Diactor billineatus (nymphs and adults) were not recognized by the same sera. Hemocytes from T. infestans were partially recognized by leishmaniasis sera, but, not by samples from patients with autoimmune diseases, HIV positive sera. The treatment of hemocytes with sodium metaperiodate practically abolished the fluorescence staining, indicating the presence of carbohydrate antigens. These antigens were revealed be comprised of N acetyl-D-glucosamine, mannose and glucose and βgal, by means of fluorescent labelled lectins. Sera from chronic chagasic patients before and after the chemotherapy were reactive with hemocytes of P. megistus on immunoblotting, and the same sera previously absorbed with formaldehyde fixed cultured epimastigotes as well trypomastigotes. On immunoblotting a substantial number of bands diminished with sera absortion with trypomastigotes, but not with epimastigotes. Proteins of 61-70, 41-50, 31-40 and 21-30 kDa were the major proteins involved in the process of serum absorptions. After chemotherapy, protein bands of 121-130, 91-100, 81-90 and 51-60 kDa disappeared in unabsorbed sera. A group of female A/Sn mice were immunized with hemolymph free of hemocytes (MHL) and other group with hemocytes (MHC). Animais were challenged with 5x102 bloodstream trypomastigotes (Y strain). Parasitemia peaks of MHL and MHC groups were observed one or two days after the control group. In spite of the parasitemia for both groups was about 63% lower than the control group, the mortality for the MHL was 43%, differing from the MHC, which was 14% only. The Cytokines, IFNγ and TNFα, were shown to be involved in the protection of immunized mice, and also the nitric oxide and complement dependent lytic antibodies. Hemocytes showed to play a role in the reduction of the IL-10 production, inhibiting Th2 response. Thus, hemocytes and trypomastigotes share common epitopes, and these epitopes are potentially useful for immunodiagnosis, immunopratection, and evaluation of chemotherapic efficiency in Chagas\' disease control.

Este trabalho descreve um novo modelo murino para o estudo da infecção crônica pelo T. cruzi usando o clone Sylvio X10/4. A infecção crônica de camundongos C3H/HePAS é caracterizada por intensas lesões inflamatórias no coração que podem ser comparáveis às observadas na doença de Chagas humana. Lesões moderadas também estavam presente na musculatura estriada esquelética desses animais. No coração dos animais crônicos foram detectados parasitas viáveis, confirmando a hipótese de que o desenvolvimento da patologia cardíaca na doença de Chagas está diretamente relacionada com a persistência do T. cruzi no tecido inflamado. Em contraste, camundongos A/J cronicamente infectados desenvolvem lesões no fígado e no músculo estriado, enquanto que no coração, não foram observados lesões nem parasitas. A análise fenotípica das gerações F1 e F2 (A/J X C3H/HePAS) sugere que a predisposição genética para desenvolver lesões teciduais na infecção pelo T. cruzi é heterogênea uma vez que a patologia no coração e no fígado é segregada na geração F2. Nossos resultados corroboram a hipótese que a heterogeneidade na patologia observada em pacientes com a doença de Chagas (ausência ou presença de lesões cardíacas ou digestivas) pode ser atribuída a fatores genéticos. / This work describes a novel murine model of the chronic infection by T. cruzi using the clone Sylvio X10/4. The infection in the C3H/HePAS mouse strain is characterized by intense inflammatory lesions in the heart, which can be comparable to the observed in the human Chagas\' disease. Moderate striated muscle lesions are also present in C3H/HePAS mice. In the heart of the chronic animals viable parasites were detected, confirming the hypothesis that the development of the heart pathology in the Chagas\' disease is related to parasite persistence in the inflamed tissue. By contrast, in infected A/J mice, develop lesions in the liver and skeletal muscle, while in the heart, lesions nor parasites were not observed. The phenotypic analysis of the generations F1 and F2 (A/J X C3H/HePAS) mice suggests that the genetic predisposition to develop the inflammatory lesions caused by T. cruzi is heterogeneous because the heart and liver pathology segregate in the F2 generation. These findings raise the hypothesis that the pathology heterogeneity observed in humans with Chagas\' disease (absence and presence of cardiac or digestive chronic lesions) can be attributed to host genetic factors.

0 objetivo deste trabalho foi definir se a carga parasitaria na fase aguda da doenga de Chagas experimental afeta a parasitemia, a patologia e a resposta imune na fase cr6nica. Para obtengelo de diferentes cargas parasitoirias na fase aguda, camundongos A/J foram infectados corn 103 OU 105 formas tripomastigotas de T. cruzi e analisados urn ano depois. Os animais cr6nicos infectados corn 105 formas tripomastigotas apresentaram maior nivel de parasitemia residual, maior intensidade de inflamagclo no coragtio e no moscuio esquel6tico e maior grau de ativa95o do sistema imune do que os animais infectados corn 103 formas. Em reiagclo aos parametros imuno16gicos analisados, observou-se nos animais infectados corn 105 formas: i) expansio das populag6es B220-CD5- e CD8\'; ii) freq0@ncia maior de blastos nas populag6es linfocit@rias B220\', CD8\' e CD4\'; iii) mudanga acentuada nas c61ulas CD4+ para o fen6tipo CD4+CD45RBI-ow, indicando urn aumento das c61ulas efetoras elou de mem6ria; iv) freqGC=ncias elevadas de blastos CD4+CD45RB Hig\' e CD4+CD45RB Low; vi) nomero superior de c61ulas secretoras de lg principaimente IgG2a; v) niveis superiores de anticorpos IgG2a e IgGl especificos e vii) maior produgclo de IFN-Y e de IL-4. Estes resultados indicam que a carga parasitaria na fase aguda da infecggto influencia a ativagclo do sistema imune e o desenvolvimento da patologia na fase cr6nica da doenga de Chagas. / The objective of this project is to evaluate if the parasite load in the acute phase experimental Chagas\' disease affects the parasitemias, the pathology and the immune response in the chronic phase. To obtain low- and high-parasite loads in the acute phase of the disease, AlJ mice were infected with 103 or 105 T. cruzi trypomastigotes of the Y strain, and treated on day 6 with Benzonidazol. One year later, chronic mice were screened for subpatent parasitemias, tissue pathology and immune response. Mice infected with the high parasite inoculum showed higher levels of chronic parasitemias, heart and striated muscle inflammation and activation of the immune system when compared to mice infected with the low¬dose inoculum. Concerning the activation of the immune system, the main findings in high-dose infected mice were: i) increased numbers of splenocytes, with preferential expansion of CD8+ and B220-CDS- cells, many of them bearing a macrophage phenotype; ii) higher frequencies of B (B220+), CD4+ and CD8+ large lymphocytes; iii) a shift of CD4+ cells towards a CD4SRBLow phenotype; iv) increased frequencies of both CD4SRBLow and CD4SRBHigh large CD4+ cells; v) augmented numbers of total Ig-secreting cells, with predominance of IgG2a¬producing cells, and; vi) increased production of IFN-y and IL-4. In addition, these mice presented lower IgM and higher IgG2a and IgG1 parasite-specific serum antibody levels. Our results indicate that the parasite load at the acute phase of T. cruzi infection influences the activation of the immune system and development of Chagas pathology at the late chronic phase of the disease.

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é a parasitose endêmica mais importante na América Latina. O acometimento das glândulas salivares nesta doença é ainda pouco estudado. Há estudo com portadores da doença através de sialografia convencional, o que motivou a realização deste estudo com a utilização da sialorressonância (sialo RM), por ter melhor sensibilidade e especificidade em relação a outros métodos e não ser invasiva, com o intuito de identificar alterações glandulares nos pacientes da forma indeterminada que possibilitem sua reclassificação para a forma digestiva. OBJETIVO: avaliar as alterações encontradas pela sialo RM e correlacionar com dados clínicos e laboratoriais. METODOLOGIA: Estudaram-se 180 glândulas salivares maiores em 45 pacientes pela sialo RM que foram divididos em três grupos: A portadores da doença de Chagas na forma clínica indeterminada; B portadores da doença de Chagas na forma digestiva; C controle. As idades médias encontradas foram: 48; 55 e 50 anos, respectivamente. Quanto ao sexo, 9; 11 e 10 pacientes dos grupos avaliados eram do feminino. Foram utilizadas seqüências anatômicas ponderadas em T1 e T2, e seqüências específicas para sialo RM T2 fast spin eco 2D e 3D. Realizou-se avaliação clínica específica, sialometria, nasofibroscopia, e dosagem sanguínea da amilase. RESULTADOS: Os volumes médios das glândulas parótidas nos grupos foram de: A (31,1cm3); B (27,4cm3); C (32,4cm3) e das submandibulares foram: A (6,1 cm3); B (5,2 cm3) e C (7,0 cm3). Observou-se um caso no grupo A e outro no grupo B, com afilamento e importante substituição gordurosa de uma das glândulas. O calibre médio dos ductos parotídeos principais foi de: A (1,5mm) tortuosidade e dilatação segmentar em um caso; B (1,3mm) um deles não visualizado e C (1,2mm). Os ductos submandibulares principais tiveram calibre médio de: A (1,5mm); B (1,7mm) - um deles não visualizado; C (1,3mm). Os ductos salivares secundários parotídeos não foram identificados em: A (13,3%); B (20,0%); C (6,7%) e submandibulares, apenas um caso no grupo B. Os ductos salivares terciários parotídeos não foram visualizados em: A (43,3%); B (43,3%); C (33,3%) e submandibulares: A (40,0%); B (23,3%); C (20,0%). Observou-se dilatação sacular/cisto em apenas um ducto parotídeo do grupo B. Das queixas clínicas a xerostomia foi a mais prevalente: A (40,0%); B (53,3%); C (13,3%), com p = 0,066. A sialometria após estímulo apresentou-se alterada nos grupos em: A (60%); B (86,67%) e C (53,33%). O diâmetro parotídeo principal dos indivíduos com amilase normal foi menor que nos indivíduos com amilase anormal (p=0,046). CONCLUSÕES: Os volumes médios das glândulas submandibulares foram menores e o calibre dos ductos salivares de Wharton foi maior nos pacientes infectados, com diferença estatística. Em 5 casos houve alteração na morfologia glandular e/ou ductal. Foram visualizados menos ramos ductais de segunda e terceira ordem das glândulas parótidas e submandibulares em relação ao controle. / INTRODUCTION: Chagas disease is the most important endemic parasitosis in Latin America. The salivary glands onsets for this disease have been poorly studied. For MR (magnetic resonance) sialography has a better sensibility and specificity when compared to different methods and for not being invasive, it is used to identify glandular alterations in patients in the undetermined form, which possibility its reclassification to the digestive form. OBJECTIVES: Present work intends to evaluate the alterations found by MR sialography in Chagas disease patient bearers and correlate them with clinical and laboratorial data. CASUISTIC and METHOD: 180 Major salivary glands were studied in 45 patients by MR sialography divided into 3 groups: A Chagas disease bearers in the uncertain clinical form; B Chagas disease bearers in the digestive form; C Control group. Average ages were: 48; 55 and 50 years, respectively. Concerning sex, nine; 11 and 10 of the evaluated groups were feminine. Anatomical sequences were pondered in T1 and T2, as well as specific sequences for MR sialography T2 fast spin eco 2D and 3D. Specific clinical evaluation, sialometry, nasofibroscopy and blood dosages of amilasis were also evaluated. RESULTS: The parotids glands volumes for groups and expressed, varied for as presented: A (31.1 cm3); B (27.4 cm3); C (32.4 cm3) and for submandibular glands were: A (6.1 cm3); B (5.2 cm3) and C (7,0 cm3). A case was observed in group A and another one in group B, presenting gauging and an important fatty substitution for one of the glands. Main parotid ducts caliber or firstrate order, varied from: A (1.5mm) tortuosity and segmental dilation in one case; B (1.3mm) one of them not visualized and C (1.2mm). Submandibular main ducts presented calibers of: A (1.5mm); B (1.7mm) - one of them not visualized; C (1.3mm). Secondary salivary ducts of the parotid were not identified in: A (13.3%); B (20.0%); C (6.7%) and concerning to submandibular glands, only one case in group B was not identified. Tertiary salivary ducts of the parotid gland were not visualized in: A (43.3%); B (43.3%); C (33.3%) and for submandibular glands: The (40.0%); B (23.3%); C (20.0%). Saccular dilatation was observed in only one parotid of the group B. Among the clinical complaints, xerostomy was the most prevailing A (40.0%); B (53.3%); C (13.3%) p = 0,066. The sialometry after stimulus showed to be altered in the groups as follows: A (60.0%); B (86.7%) and C (53.3%) - <0,001. The main parotid duct diameter of individuals with normal amilasis was smaller than those in the ones with abnormal amilasis (p=0,046). CONCLUSION: The salivary gland volumes were smaller and there was enlargement in Wharton ducts caliber in patients infected by the disease, with statistical difference. There was alteration in the glandular and/or ductal morphology in five cases. Ductal branches of second and third order salivary glands in Chagas disease chronic form bearers were not visualized more often than in healthy patients. Xerostomy was the most reported complaint by patients infected by Tripanosoma cruzi, and there was a bigger association with abnormal pharyngeal nasofibroscopy. Sialometry after stimulus showed to be altered in the groups, especially in patients with chronic digestive form.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FLAVIO CESAR GOMES DE OLIVEIRA.pdf: 312182 bytes, checksum: 15ed8223a704aec6c70a1c4e4e0602e3 (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / The objective of this study was to evaluate possible environmental impacts caused by the construction and filling of the Espora hydroelectric power plant s reservoir (localized in Aporé, Serranópolis and Itarumã GO, Brasil) on small mammal fauna and their Hantavirus and Trypanosoma cruzi infection rates. Small mammals were captured in periods pre- and postfilling of the reservoir between 2003 and 2007. The taxonomic identification of rodents and marsupials was performed through morphology and karyotyping. Serological diagnostic of Hantavirus infection was performed through IgG (Andes antigen) Enzime Immunoassay (ELISA), while indirect immunofluorescence (RIFI) and hemoculture were used to diagnose T. cruzi infection. In total, among rodents and marsupials, 358 specimens were captured, resulting in a total species richness of 17 species. Didelphis albiventris, Gracilinanus agilis and Marmosa murina were the most abundant marsupial species, being responsible for 94.5% of the captures. Among rodents, Hylaeamys megacephalus, Calomys tener and Necromys lasiurus were the most abundant, representing 44.04% of the captures. Of all captured specimens, 145 were serologically tested for T. cruzi infection, being 33.8% found positive. Out of 104 hemoculture testing performed for T. cruzi infection 10 were positive. Of the 193 rodents captured, 26.4% were tested for Hantavirus serum prevalence, from which only 2 specimens of Rattus rattus were found positive. In the post-filling period, there was a reduction in the proportion of captured rodents in relation to captured marsupials, and also in male to female ratio of G. agilis, M. murina and N. lasiurus. Species richness did not change with reservoir filling. T. cruzi and Hantavirus infection rates in the post-filling period were not statistically different than in the pre-filling period. The small mammals low infection rates, by either etiological agent, after filling the reservoir indicate a low probability of Hantavirus and Chagas Disease emergence after implementation of the Espora hydroelectric power plant in the area. Also, our results indicate that this undertaking does not cause a great impact on small mammal fauna, considering the relatively high species richness after filling the reservoir. / O objetivo deste estudo foi avaliar os possíveis impactos ambientais sobre a fauna de pequenos mamíferos e suas taxas de infecção por Trypanosoma cruzi e hantavírus, causados pela construção e enchimento do reservatório da Usina Hidrelétrica Espora, localizada nos municípios de Aporé, Serranópolis e Itarumã GO, Brasil. Pequenos mamíferos foram capturados nos períodos pré e pós-enchimento do reservatório entre 2003 e 2007. A identificação taxonômica foi realizada por morfologia e cariotipagem. O diagnóstico sorológico da infecção por hantavírus foi realizado por Imunoensaio Enzimático (ELISA) IgG (antígeno Andes), e para infecção por T. cruzi por Imunofluorescência Indireta (RIFI) e hemocultivos. Um total de 358 espécimes foram capturados entre roedores e marsupiais, resultando em uma riqueza total de 17 espécies. As espécies mais abundantes de marsupiais foram Didelphis albiventris, Gracilinanus agilis e Marmosa murina, representando 94,5% dos espécimes capturados. Entre os roedores Hylaeamys megacephalus, Calomys tener e Necromys lasiurus representaram 44,04% dos espécimes capturados. Do total de espécimes capturados, 145 foram analisados quanto à soro-prevalência para infecção por T. cruzi, sendo que 33,8% apresentaram-se positivos. Dos 104 hemocultivos realizados para pesquisa de T. cruzi, 10 foram positivos. De um total de 193 roedores capturados em todo o estudo, 26,4% foram testados quanto a soro-prevalência para hantavírus, sendo que apenas dois espécimes de Rattus rattus estavam positivos. Considerando os períodos pré e pósenchimento, foi observado uma diminuição na proporção de espécimes de roedores capturados em relação a de marsupiais no período pós enchimento, bem como alterações na proporção sexual de machos e fêmeas das espécies de G. agilis, M. murina e N. lasiurus. A riqueza de espécies de pequenos mamíferos na área de estudo permaneceu a mesma após o enchimento do reservatório. Em relação as taxas de infecção por T. cruzi (soroprevalência e hemocultivos) e por hantavírus (soroprevalência) não foram observadas alterações estatisticamente significativas entre os períodos pré e pós-enchimento. Os resultados obtidos indicam uma baixa probabilidade de emergência de hantavirose e da doença de chagas após a implantação do empreendimento, considerando a manutenção da alta diversidade de pequenos mamíferos e das baixas taxas de infecção pelos agentes etiológicos estudados, no período pós-enchimento do reservatório.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 REGINA MARIA PASQUALI.pdf: 5096069 bytes, checksum: 7b17ccd6bce42fbded25f3c6b24256e7 (MD5) Previous issue date: 2011-12-16 / This research aimed to make a survey of triatomines in Quirinópolis - GO city (2005-2010) to identify the species and evaluate the urbanization of these vectors resulting from environmental changes that occurred after the installation of sugarcane power plants (São Francisco and Boa Vista) that replaced the traditional farming of grain, chiefly corn and soybeans, with sugarcane monoculture. The study are a had four rural regions (Bruacas, Pedra Lisa, Salgado e Sete Lagoas) and 31 districts in urban area. The qualitative / quantitative method was used and the research methodology comprised field work and analysis of the forms of the Program for the Control of Human Chagas Disease (PCHCD), exclusive of FUNASA. The data relating to agriculture and demographic density was obtained from the Company of Technical Assistance and Rural Extension (EMATER) and the Brazilian Institute of Geography and Statistics (IBGE), respectively, since the epidemiological studies on Chagas Disease (CD) were obtained from the Information System of Diseases and Notification (SINAN), the Municipal Health secretary and local medical laboratories. The analysis of the results were through descriptive statistics. Through the entomological survey 2.925 triatomines were identified and divided into seven species, from whict, two are endemic of Cerrado: Triatoma sordida and Rhodnius neglectus and five non endemic species: Panstrongylus diasi, Triatoma brasiliensis, Panstrongylus megistus, Panstrongylus geniculatus and Triatoma williami. The specimens were captured into and peridomestic environment of rural and urban areas. From these 15 specimens of T. sordida and two specimens of R. neglectus were positive to T. cruzi. It was also possible to identify 381 cases of CD and one case of Acute Chagas Desease (ACD) reported by SINAN in the period (2005-2010). / Esta pesquisa teve como objetivo fazer um levantamento de triatomíneos no município de Quirinópolis - GO (2005-2010) para identificar as espécies e avaliar a urbanização desses vetores decorrente das transformações ambientais ocorridas após a implantação das usinas sucroalcooleiras (São Francisco e Boa Vista) que substituíram a agricultura tradicional de grãos, principalmente o milho e a soja, pela monocultura canavieira. A área de estudo compreendeu quatro regiões rurais (Bruacas, Pedra Lisa, Salgado e Sete Lagoas) e 31 bairros na zona urbana. O método utilizado foi quali/quantitativo e a metodologia da pesquisa foi trabalho de campo e análise de formulários do Programa de Controle da Doença de Chagas Humana (PCDCH), de uso exclusivo da FUNASA. Os dados referentes à agricultura e densidade demográfica foram obtidos na Empresa de Assistência Técnica e Extensão Rural (EMATER) e Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), respectivamente, enquanto os epidemiológicos sobre a Doença de Chagas (DC) foram obtidos pelo Sistema de Informação de Agravos e Notificação (SINAN), Secretaria Municipal de Saúde e laboratórios de análises clínicas. As análises dos resultados foram feitas por meio de estatística descritiva. Mediante o levantamento entomológico foram identificados 2.925 triatomíneos distribuídos em sete espécies, dentre essas duas são endêmicas do Cerrado: o Triatoma sordida e Rhodnius neglectus e cinco espécies não endêmicas: Panstrongylus diasi, Triatoma brasiliensis, Panstrongylus megistus, Panstrongylus geniculatus e Triatoma williami. Os espécimes foram capturados nos ambientes intra e peridomiciliares da zona rural e urbana. Destes,15 espécimes de T. sordida e 2 exemplares R. neglectus apresentaram positivos ao T. cruzi. Foi também possível identificar 381 casos da DC e um caso da Doença de Chagas Aguda (DCA) notificado pelo SINAN no período (2005-2010).

A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), &Delta;H,&Delta;G,&Delta;S e &Delta;Cp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( &Delta;G) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de &Delta;Cp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de &Delta;HITC com &Delta;HvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), &Delta;H, &Delta;G, &Delta;S and &Delta;Cp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (&Delta;G) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The &Delta;Cp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its &Delta;HITC relationship with &Delta;HvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.

<p align=\"justify\">A necessidade urgente de descoberta de terapias mais seguras e eficazes para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses tem motivado a pesquisa por novos inibidores das enzimas cruzaína e CPB, as principais cisteíno proteases do T. cruzie e Leishmania spp., respectivamente. Uma série de 52 compostos nitrílicos que atuam como inibidores covalente-reversíveis de cisteíno proteases foi sintetizada no grupo NEQUIMED/IQSC/USP e avaliada quanto a sua atividade inibitória contra as enzimas cruzaína, CPB de Leishmania mexicana e catepsina L de humanos. Utilizando planejamento molecular baseado em hipótese, mapeamos as relações estrutura-atividade (SARs) desses inibidores através de variações nas posições P1, P2, P3 e P1\' do esqueleto dipeptidil nitrílico. A substituição do grupo eletrofílico (warhead) aminonitrila em P1 pelo grupo azanitrila melhorou a afinidade em duas ordens de magnitude para todos os alvos avaliados. Um dos mais potentes inibidores, o análogo azanitrila Neq0690 mostrou uma cinética de ligação lenta com valores de pKi de 8,8, 9,3 e 9,7 para cruzaína, catepsina L e LmCPB, respectivamente. A substituição bioisostérica da ligação amida entre as posições P2-P3 pelo grupo trifluoroetilamina resultou na síntese do Neq0659, um potente inibidor com um perfil de ação seletivo para as proteases de parasitos. A substituição do grupo metileno em P1 pelo ciclopropano aumentou a afinidade para todas as enzimas. Contudo, uma inibição seletiva da cruzaína e LmCPB foi associada à presença do grupo (R)-benzila como substituinte da posição P1 dos derivados CF3 substituídos. Embora os compostos substituídos com leucina, tirosina, triptofano e 3-cloro fenilalanina como substituintes da posição P2 foram relativamente bem tolerados pela cruzaína e catepsina L, uma restrita especificidade foi verificada para LmCPB com pequenos ganhos de afinidade para os inibidores que possuíam os grupos leucina e metil benzoato como substituintes dessa posição. Com relação à posição P3, a inserção do grupo 3-terc-butilpirazol e 3-bromo piridina aumentou a afinidade para todos os alvos avaliados enquanto que um ganho seletivo para a LmCPB foi observado para os compostos que possuíam o grupo bifenila nessa posição. Além disso, duas novas estruturas cristalográficas da LmCPB complexada com o Neq0690 e metil metanotiossulfonato (MMTS) foram determinadas com resoluções de 1,3 Å e 1,5 Å, respectivamente. As estruturas dos co-complexos revelaram os modos de interação (MoB) desses ligantes, bem como as principais características do processo de reconhecimento bimolecular. Isso permitirá o uso de estratégias de planejamento baseado na estrutura do alvo com translação natural para a pesquisa por novos inibidores de cisteíno proteases, com amplo espectro de ação na quimioterapia de doenças a elas relacionadas. / <p align=\"justify\">The urgent need for the discovery of safer and more effective therapies for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis has motivated the search for new inhibitors of the enzymes cruzain and CPB, the major T. cruzi and Leishmania spp. cysteine proteases, respectively. A series of 52 nitrile-containing compounds acting as covalent-reversible inhibitors of cysteine proteases was synthesized at the NEQUIMED/IQSC/USP Medicinal Chemistry Group and evaluated for their inhibitory activity against the enzymes cruzain, Leishmania mexicana CPB and cathepsin L from humans. Using hypothesis-driven molecular design, we mapped the structure-activity relationships (SARs) of these inhibitors through variations in the P1, P2, P3 and P1\' positions of the dipeptidyl nitrile scaffold. The substitution of the aminonitrile by the azanitrile group improved the affinity by two orders of magnitude for all the evaluated targets. One of the most potent inhibitors, the azanitrile analogue dubbed Neq0690 showed a slow-binding kinetics with pKi values of 8.8, 9.3 and 9.7 for cruzain, cathepsin L and LmCPB, respectively. Bioisosteric substitution of the amide moiety between the P2-P3 positions by the trifluoroethylamine group resulted in the synthesis of Neq0659, a potent inhibitor with a selective action profile for parasite proteases. Substitution of the methylene group at P1 by cyclopropane increased the affinity for all enzymes. However, selective inhibition of cruzain and LmCPB was associated with the presence of the (R)-benzyl group as substituent of the P1 position of the substituted CF3 derivatives. Although leucine, tyrosine, tryptophan and 3-chloro phenylalanine substituted compounds as substituents of the P2 position were relatively well tolerated by cruzain and cathepsin L, a restricted specificity was verified for LmCPB with small affinity gains for the inhibitors possessing the leucine and methyl benzoate as substituents of that position. Regarding the P3 position, the insertion of the 3-tert-butylpyrazole and 3-bromo pyridine groups increased the affinity for all evaluated targets whereas a selective gain for LmCPB was observed for the compounds having the biphenyl moiety at that position. In addition, it is noteworthy that two new crystallographic structures of LmCPB complexed with Neq0690 and methyl methanethiosulfonate (MMTS) were determined with resolutions of 1.3 Å and 1.5 Å, respectively. The structures of the co-complexes revealed the modes of binding (MoB) of these ligands, as well as the main characteristics of the bimolecular recognition process. This will allow the natural translational target structure strategies for the search for new inhibitors of cysteine proteases with broad spectrum of action in the chemotherapy of related diseases.

A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e atinge cerca de 12 milhões de pessoas no continente americano, a forma clássica de transmissão ocorre por intermédio do inseto vetor da subfamília Triatominae, popularmente chamado de barbeiro.Em um trabalho anterior, foi realizada uma análise de segregação complexa que indicou a presença de um gene principal, com um componente multifatorial influenciando a predisposição à infecção por Trypanosoma cruzi. A população é composta por 4697 indivíduos pertencentes a 886 famílias vindas do Nordeste do Brasil e tiveram os dados e amostras de sangue e saliva coletados entre 1969 e 1970.No presente estudo foi utilizada uma amostra de 69 indivíduos, sendo 18 positivos para a infecção por Trypanosoma cruzi e 51 negativos, distribuídos em 14 famílias. Os indivíduos tiveram seu DNA extraído e genotipado utilizando microarranjos de DNA de 260 K SNPs (GeneChip Mapping Affymetrix). Testes de associação mostraram significância entre a infecção por T. cruzi e o SNP rs17469997 do cromossomo 10, com P=0,015 após a correção de Bonferroni. Para validar estes inéditos resultados, análises de ligação multi-ponto foi feita com o programa GeneHunter (KRUGLYAK et al., 1996) e ligação dois-pontos com o programa SuperLink (FISHELSON e GEIGER, 2002), mas ambas não apresentaram resultados significativos, devido ao pequeno número de famílias informativas. / Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosssoma cruzi and is usually transmitted by Triatominae bugs and affects about 12 million people in the American continent. In a previous study, segregation analysis showed evidence of a major gene with a small multifactorial component influencing the predisposition to the Trypanosoma cruzi infection in a population composed by 4697 individuals of 886 families from Northeastern Brazil in 1969-1970 at São Paulo, Brazil. In the present work, 69 individuals (18 positives to T. cruzi infection and 51 negative) belonging to 14 families were selected. They had the DNA extracted and genotyped using 250K SNPs DNA microarrays (GeneChip Mapping Affymetrix). 18 SNPs showed evidence of association between infection to T. cruzi with P<10-5, although after Bonferroni\'s correction only the SNP rs17469997 (minor allele frequency = 0.1667, adjusted-Bonferroni P = 0.015) on chromosome 10 was significant. The other 17 SNPs that showed association with T. cruzi infection with P<10-5 can still be informative in linkage analyses. On an effort to validate these findings, a multi point linkage analyses was performed with GeneHunter (KRUGLYAK et al., 1996) program and a two point linkage analyses were performed with SuperLink (FISHELSON e GEIGER, 2002) program, both analyses showed no significant results.

Os avanços tecnológicos ocorridos na última década trouxeram enormes benefícios, no sentido de possibilitar o uso de equipamentos computadorizados, que permitem a aquisição, processamento e armazenamento de um grande número de variáveis respiratórias e metabólicas em exercício físico, em tempo real e a cada ciclo respiratório. Inserido neste novo cenário, o estudo realizado com esta nova geração de equipamentos, nas respectivas áreas de conhecimento, pôde ser direcionado, usando-se métodos matemáticos e estatísticos computadorizados, os quais possibilitam a aplicação de procedimentos automáticos e/ou semi-automáticos na solução de problemas específicos. É dentro deste contexto que se insere o presente estudo, que tem por objetivo estudar, em pacientes portadores de doença de Chagas e em indivíduos sadios, do sexo masculino, o limiar de anaerobiose ventilatório, durante o exercício físico dinâmico, realizado em cicloergômetro, usando-se métodos baseados em modelos matemáticos, automáticos e semi-automáticos, comparativamente com o método visual gráfico. Foram estudados 51 voluntários do sexo masculino, sendo 24 chagásicos e 27 saudáveis, a média de idade dos grupos chagásico e saudável foi de 33,77 ± 7,86 e 35,91 ± 9,84 anos, respectivamente. Todos eles foram submetidos a dois testes de esforço físico dinâmico, com um protocolo contínuo do tipo rampa e um outro protocolo de esforço físico descontínuo, ambos na posição sentada, em cicloergômetro de frenagem eletromagnética, acoplado a um ergoespirômetro (CPX/D MedGraphics), que possibilitou o cálculo e armazenamento de múltiplas variáveis cardiorrespiratórias, como: ventilação pulmonar (VE), produção de CO2 (VCO2), consumo de O2 (VO2), equivalentes ventilatórios de O2 (VE/VO2) e de CO2 (VE/VCO2), frações parciais do O2 (PET O2) e do CO2 (PET CO2) no final da expiração, quociente de trocas respiratórias (RER), freqüências respiratória (RR) e cardíaca (FC), além dos valores de potência aplicada e da velocidade de pedalagem no cicloergômetro. Os valores do LAV, durante o protocolo contínuo, foram calculados por seis diferentes métodos, que usam como critério de medida deste parâmetro, a mudança de inclinação da , em relação ao tempo ou da em relação ao . Estes métodos foram os seguintes: 1- método visual; 2- método automático, usando algoritmo, incorporado ao sistema MedGraphics; 3- modelo bissegmentado linear-linear aplicado à resposta da em função do tempo; 4- modelo bissegmentado linear-quadrático aplicado à resposta da em função do tempo; 5- modelo bissegmentado linear-linear aplicado à resposta da em função do consumo de O2; e 6- modelo bissegmentado linear-quadrático aplicado à resposta da em função do consumo de O2. Os modelos bissegmentados se basearam na aplicação da soma dos quadrados dos resíduos, quando o conjunto de dados é ajustado pelo método dos mínimos quadrados, para uma reta inicial e final ou uma reta inicial e uma curva quadrática final. Foram aplicados, aos dados do protocolo descontínuo, nas várias potências estudadas, um modelo semiparamétrico que ajusta uma reta por meio de uma regressão linear. Após análise qualitativa e quantitativa apropriada aos conjuntos de dados, chegou-se às seguintes conclusões: 1- os modelos matemáticos bissegmentados usados no presente estudo, do tipo linear-linear e linear-quadrático, mostrando a resposta das variáveis VCO2 vs. tempo e VCO2 vs. VO2, com protocolos contínuos em rampa, puderam ser aplicados em 64% dos voluntários estudados (16 chagásicos e 17 saudáveis), e os valores do limiar de anaerobiose ventilatório, expressos em potência e consumo de oxigênio, não diferiram estatisticamente dos obtidos pelo método visual gráfico, nos grupos de pacientes chagásicos e de indivíduos saudáveis; 2- o método automático, incorporado ao ergoespirômetro MedGraphics, possibilitou a determinação limiar de anaerobiose em todos os voluntários estudados nos grupos chagásico (n=24) e saudável (n=27); entretanto, com valores do limiar de anaerobiose ventilatório subestimados comparativamente ao método visual gráfico; 3- não houve diferença estatisticamente significante entre a comparação dos coeficientes (inclinação e intercepto) das retas de regressão, que relacionam a potência com o consumo de oxigênio dos valores do limiar de anaerobiose ventilatório calculados para os seis métodos usados; 4- as análises das retas de regressão dos modelos semiparamétricos, aplicados no protocolo descontínuo, mostraram porcentagem pequena de casos, em que a mudança de inclinação das retas coincidiu com o valor do limiar de anaerobiose ventilatório, o que ainda torna questionável a utilidade desta abordagem, pelo menos nas condições em que os protocolos progressivos do tipo degrau tenham 6 minutos de duração; 5- Os quatro modelos bissegmentados testados e o método automático do equipamento, aplicados às respostas das variáveis ventilatórias, usando-se o protocolo de rampa, se mostraram adequados, como ferramentas úteis para se quantificar o limiar de anaerobiose ventilatório durante o exercício dinâmico; 6- o janelamento dos dados, durante a aplicação da rampa de potência em esforço, se mostrou de fundamental importância para permitir o uso adequado dos modelos matemáticos bissegmentados e do método automático, visando à quantificação do limiar de anaerobiose ventilatório. / With the advance of digital computers it was possible to develop high quality equipments and specific software for the acquisition, processing and storage of a great number of cardio respiratory variables. In this context, exercise physiology has shown a substantial progress, particularly with the use of ergospirometric systems that allow a simultaneous recording of respiratory and metabolic variables during dynamic exercise. The aim of the present study was to evaluate the usefulness of a special kind of mathematical models, the so called bisegmentar models, linear-linear (L-L) and linear-quadratic (L-Q), applied to the ventilatory variables during dynamic exercise for identification of the ventilatory anaerobic threshold (VAT) in chagasic patients. In this study 51 volunteers were included: 24 chagasic patients (mean ± age= 33.77 ± 7.86 years) and 27 healthy men (35.91 ± 9.84 years), paired for sex, age and aerobic capacity. The chagasic patients presented the undetermined and the cardiac form of the disease; in this last condition the patients did not show any increase of heart dimension on echocardiography. All subjects studied were submitted to two different types of exercise protocols, undertaken in cycle ergometer in seated position: 1- a continuous ramp type test; 2- a progressive step type test, interrupted in each exercise level for the return of variables to basal values. An electronic braked cycle ergometer (CORIVAL 400 Quinton) was used in both cases. A computerized ergospirometric system (MedGraphics CPX/D) was used to apply the exercise tests. This system allowed the recording and processing of all ventilatory variables for application of the mathematical models: oxygen uptake (VO2), CO2 production (VCO2), minute respiratory ventilation (VE), respiratory equivalents (VE/VCO2,VE/VO2), power (Watts), rotation speed, and others. The ramp was calculated considering sex, age, weight and aerobic capacity, evaluated on the basis of a questioner of physical activity. The VAT was measured by visual manner (mean values obtained from 3 different observers), and also by the automatic method supplied by the MedGraphics equipment (AuT), based on the VCO2-VO2 inclination changes of the straight lines, and the ones obtained by the bisegmentar methods adjusted to the response of VO2 related to time (L-L VCO2, L-Q VCO2) and of VCO2 in relation to VO2 (L-L VCO2/VO2, L-Q VCO2/VO2). The bisegmentar models were based on the measure of the square sum of residual values related to fitting of two functions, linear-linear and linear-quadratic applying the least square method. After a qualitative and quantitative analysis of data, it was possible to reach to the following conclusions: 1- all four bisegmentar models applied to ramp type tests could be used in 64% of cases (16 chagasics an 17 healthy), and the calculated VAT values were not statistically different from the ones obtained by VM and AuT methods ? also, the VAT values were not different comparing the two groups; 2- the AuT method could be used in all volunteers studied, including the chagasic (n=24) and the control (n=27) groups; 3- the intercepts and inclination coefficients that relate power and of VAT values obtained by all 6 methods were not statistically significant in both groups studied; 4- the inclination changes of linear fitting obtained from step tests were coincident with the VAT values calculated from ramp tests in a small percentage of cases, what makes this method questionable, at least in protocols with 6 minute duration; 4- all bisegmentar models and AuT method using the ramp protocols have shown an adequate tool to quantify the VAT; 6- the use of appropriate windows to analyze the data during ramp exercise protocols is of uppermost importance to achieve a good performance of the mathematical models and the automatic method for quantifying the VAT.