Posttranslationale Modifikationen sind chemische Veränderungen, die ein Protein nach der Translation durchläuft. Sie sind wichtig für die Regulierung der Funktion, Struktur und Interaktion von Proteinen. Die Einführung von Modifikationen in Biomoleküle ist zudem ein Hilfsmittel in der Chemischen Biologie, um neue Informationen über ihr Verhalten zu erlangen und ihre Aktivität zu verändern. Die Fehlregulierung von posttranslationalen Modifikationen steht häufig in direkter Verbindung zum Ausbruch von Krankheiten. Ein Beispiel ist das Tau Protein welches eine Schlüsselrolle in der Alzheimer Erkrankung hat. Im Laufe der Krankheit wird Tau hyperphosphoryliert, was zu einem Funktionsverlust des Proteins und zur Bildung von nicht-löslichen Aggregaten führt. Die Mechanismen hinter dieser Fehlregulierung zu eluieren gehört zu einer der großen Herausforderungen der Alzheimerforschung. Diese Doktorarbeit hat sich mit der Entwicklung einer neuen semi-synthetischen Ligationsstrategie beschäftigt, die es ermöglichen soll die Rolle einzelner Phosphorylierungen in der Prolin-reichen Region des Tau Proteins zu untersuchen. Hierfür wurden geeignete Ligationsstellen identifiziert, Ligationsmöglichkeiten geprüft und die Synthese der einzelnen Fragmente optimiert. Desweiteren wurde in dieser Dissertation eine neuartige Anwendung der Staudinger-Phosphonit Ligation entwickelt, die es ermöglicht mit Boran-geschützten P(III) Verbindungen azidhaltige Moleküle zu lichtspaltbaren Phosphonamidaten zu modifizieren. Die P(III) Bausteine beinhalteten dabei nicht nur zwei lichtspaltbare 2-Nitrobenzyl-Substituenten, sondern erlauben zudem über eine Alkingruppe eine vielfältige Funktionalisierung. Die Bestrahlung durch UV Licht induziert die Spaltung der P-N Bindung der Phosphonamidate und setzte das Ursprungsmolekül mit einer zusätzlichen Aminfunktion frei. Dahingehend wurden erste Schritte unternommen, damit die Lichtspaltung keine Modifikation mehr am Ursprungsmolekül hinterlässt. / Post-translational modifications are essential in the regulation of the function, folding and interaction of proteins. Similarly, the modification of biomolecules is a main tool in chemical biology to gain new insights into their molecular mechanisms and to alter and fine-tune their activity. The dysregulation of post-translational modifications is often associated with disease. An example are the abnormally hyperphosphorylated tau proteins that are the main component of neurofibrillary tangles, one of the pathological hallmarks of the neurodegenerative disease Alzheimer‘s disease. The origin of these hyperphosphorylations, which render a soluble and mostly unstructured protein into insoluble aggregates, is a key question in Alzheimer research. First steps towards a tau semi-synthesis that allow for the site-specific introduction of phosphorylations in the proline-rich domain were taken by identifying suitable ligation sites, finding the ideal sequential ligation strategy, providing reliable protein expression protocols and optimizing the synthesis of the synthetic peptides equipped with phosphorylated residues. Furthermore, this thesis explored the use of the Staudinger-phosphonite reaction in the synthesis of photo-cleavable phosphonamidates to modify biomolecules in a reversible manner. This conjugation method allowed for the chemoselective modification of an azido-containing target molecule with a borane-protected P(III) reagent that was equipped with photo-cleavable 2-nitrobenzyl substituents and one alkyne for functionalization. UV irradiation induced the phosphonamidate P-N bond cleavage and resulted in the release of the target molecule with an additional amine functionality. In this regard, first steps were undertaken to develop a traceless variant of this cleavage. The application of the photo-cleavable phosphonamidates was demonstrated in streptavidin-mediated immobilization assays, which is just one example for the use of this valuable methodology.

Reversible Phosphorylierung ist die bekannteste posttranslationale Modifikation (PTM) und die O-Phosphomonoester von Serin, Threonin und Tyrosin galten lange als die einzigen relevanten Vertreter. Vor kurzem wurden erste Erkenntnisse über die biologische Relevanz von labilen Phosphorylierungen veröffentlicht, z.B. die Phosphorylierung von Histidin, Arginin und Cystein sowie die Pyrophosphorylierung von Serin und Threonin. Auch die Aufklärung von Phospho-Lysin (pLys) wurde mit der Etablierung einer chemoselektiven Synthese zur Darstellung ortsselektiv phosphorylierter Lysinpeptide und der Entwicklung massenspektrometrischer Protokolle zur eindeutigen pLys-Identifizierung in Angriff genommen. Dennoch wurde bisher kein endogenes pLys beschrieben oder eingehende Untersuchungen mit interagierenden Enzymen durchgeführt. In dieser Arbeit werden mehrere Ansätze zur Erweiterung des Wissens über pLys vorgestellt. Dazu gehören das Design einer alternativen Syntheseroute zu pLys-Peptiden und die Entwicklung sowie Evaluierung von zwei stabilen Analoga als Bausteine für die Peptidsynthese. Weiterhin wurde die Protonierung des Phosphoramidatstickstoffs untersucht. In systematischen Enzymaktivitätsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) und verschiedenen Phospho-Substraten untersucht. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Selektivität für pLys, eine hohe Sequenzabhängigkeit der LHPP-Aktivität und ein klares Bindungsmotiv. Darüber hinaus wurden proteomische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für pLys-Peptide evaluiert. Im Laufe dieser Untersuchung wurden mehrere pLys-Immunogene für die Generierung von monoklonalen anti-pLys-Antikörpern und ein Workflow für die Histontrennung und -analyse entwickelt. Des Weiteren wurde die chelationsverstärkte Fluoreszenz von markierten Phospho-Peptiden als Werkzeug zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades in Enzymaktivitäts- oder Stabilitätsassays untersucht. / Reversible phosphorylation is the most prominent post-translational modification (PTM) and the O-phosphomonoesters of serine, threonine and tyrosine have been considered as the only notable forms for long time. Recent developments have paved the way to insights into the biological relevance of labile phosphorylations, e.g. phosphorylation of histidine, arginine and cysteine as well as pyrophosphorylation of serine and threonine. Also, the elucidation of phospho-lysine (pLys) was tackled with the establishment of a chemoselective synthesis to obtain site-selectively phosphorylated lysine peptides and the development of mass spectrometric protocols to unambiguously identify modification sites. Nonetheless, no endogenous pLys site has been described or in-depth investigations of interacting enzymes have been conducted. In this thesis, several approaches to enhance the knowledge about pLys are introduced. These include the design of an alternative synthesis route to pLys peptides and the development as well as evaluation of two stable analogues as building blocks for peptide synthesis. Furthermore, the protonation of the phosphoramidate-nitrogen was investigated. In systematic phosphoramidate hydrolase and phosphatase activity assays, the interactions between phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and various phospho-substrates were examined. Thereby, distinct selectivity for pLys, high sequence dependence of LHPP activity and a distinct binding motif were revealed. In addition to that, proteomic methods were evaluated regarding their suitability for pLys peptides. Over the course of this investigation, several pLys immunogens for the generation of monoclonal anti-pLys antibodies and a workflow for histone separation and analysis were developed. Furthermore, chelation-enhanced fluorescence of labeled phospho-peptides was studied as a tool for determining the degree of phosphorylation in enzyme activity or stability assays.

La recherche sur le cancer se tourne vers le développement de la nanomédecine, c’est-à-dire l’utilisation de nanoparticules pour augmenter l'efficacité thérapeutique et réduire la toxicité du traitement. Dans ce contexte, ces travaux ont été consacrés à la conception de nano objets pour des applications en thérapie anticancéreuse. Ces systèmes ont été élaborés à partir d'un châssis moléculaire cyclodécapeptidique présentant plusieurs ligands peptidiques RGD ciblant l’intégrine αvβ3, récepteur transmembranaire jouant un rôle clé dans l’angiogenèse. Dans un premier temps, nous avons synthétisé plusieurs composés en faisant varier la structure du châssis peptidique afin de moduler la présentation des ligands RGD lors de leur interaction avec l’intégrine αvβ3. L’évaluation biologique in vitro des différents composés synthétisés suivi d’une étape de simulation de dynamique nous a permis de déterminer une présentation optimale des ligands RGD. Nous avons ensuite développé une nouvelle voie de synthèse combinant deux réactions orthogonales catalysées au cuivre permettant l’accès à ces vecteurs peptidiques avec de meilleurs rendements et avec un temps de synthèse réduit par rapport à la voie classique. Finalement, nous avons greffé les clusters de RGD sur des nanoparticules lipidiques, puis polymériques, afin d’apporter un élément de ciblage. Ces deux projets ont été réalisés à travers des collaborations, respectivement avec le laboratoire du Prof. Patrick Couvreur (nanoparticules de squalène) et avec le laboratoire du Dr Marie-Thérèse Charreyre (nanoparticules de copolymères NAM/NAS). Ces systèmes ont ensuite été étudiés in vitro pour des applications en thérapie et en imagerie / Cancer research is now taking advantage of nanomedicine that is to say the use of nanoparticles to increase treatment efficiency and reduce toxicity. In this context, this work has been devoted to the design and synthesis of nano objects for applications in cancer therapy. These systems are based on a cyclodecapeptidic molecular scaffold presenting several RGD peptidic ligands targeting the αvβ3 integrin, a transmembrane receptor playing a key role in angiogenesis. We first synthesized several compounds by modifying the structure of the peptidic scaffold in order to alter the presentation of the RGD ligands during their interaction with the αvβ3 integrin. Biological in vitro evaluation of the different synthesized compounds followed by dynamics simulation allowed us to identify an optimal presentation of the RGD ligands. We then developed a new synthesis combining two orthogonal copper-catalyzed reactions yielding those peptidic vectors with lower reaction times and better yields compared to the classic synthesis. We finally grafted the RGD clusters on lipidic, then polymeric nanoparticles to add targeting moieties. Both projects were realized through collaborations, respectively with Prof. Patrick Couvreur’s lab (squalene nanoparticles) and Dr. Marie-Thérèse Charreyre’s lab (NAM/NAS copolymers). Those systems were then evaluated in vitro for applications in therapy and imaging.

La recherche sur le cancer se tourne vers le développement de la nanomédecine, c’est-à-dire l’utilisation de nanoparticules pour augmenter l'efficacité thérapeutique et réduire la toxicité du traitement. Dans ce contexte, ces travaux ont été consacrés à la conception de nano objets pour des applications en thérapie anticancéreuse. Ces systèmes ont été élaborés à partir d'un châssis moléculaire cyclodécapeptidique présentant plusieurs ligands peptidiques RGD ciblant l’intégrine αvβ3, récepteur transmembranaire jouant un rôle clé dans l’angiogenèse. Dans un premier temps, nous avons synthétisé plusieurs composés en faisant varier la structure du châssis peptidique afin de moduler la présentation des ligands RGD lors de leur interaction avec l’intégrine αvβ3. L’évaluation biologique in vitro des différents composés synthétisés suivi d’une étape de simulation de dynamique nous a permis de déterminer une présentation optimale des ligands RGD. Nous avons ensuite développé une nouvelle voie de synthèse combinant deux réactions orthogonales catalysées au cuivre permettant l’accès à ces vecteurs peptidiques avec de meilleurs rendements et avec un temps de synthèse réduit par rapport à la voie classique. Finalement, nous avons greffé les clusters de RGD sur des nanoparticules lipidiques, puis polymériques, afin d’apporter un élément de ciblage. Ces deux projets ont été réalisés à travers des collaborations, respectivement avec le laboratoire du Prof. Patrick Couvreur (nanoparticules de squalène) et avec le laboratoire du Dr Marie-Thérèse Charreyre (nanoparticules de copolymères NAM/NAS). Ces systèmes ont ensuite été étudiés in vitro pour des applications en thérapie et en imagerie / Cancer research is now taking advantage of nanomedicine that is to say the use of nanoparticles to increase treatment efficiency and reduce toxicity. In this context, this work has been devoted to the design and synthesis of nano objects for applications in cancer therapy. These systems are based on a cyclodecapeptidic molecular scaffold presenting several RGD peptidic ligands targeting the αvβ3 integrin, a transmembrane receptor playing a key role in angiogenesis. We first synthesized several compounds by modifying the structure of the peptidic scaffold in order to alter the presentation of the RGD ligands during their interaction with the αvβ3 integrin. Biological in vitro evaluation of the different synthesized compounds followed by dynamics simulation allowed us to identify an optimal presentation of the RGD ligands. We then developed a new synthesis combining two orthogonal copper-catalyzed reactions yielding those peptidic vectors with lower reaction times and better yields compared to the classic synthesis. We finally grafted the RGD clusters on lipidic, then polymeric nanoparticles to add targeting moieties. Both projects were realized through collaborations, respectively with Prof. Patrick Couvreur’s lab (squalene nanoparticles) and Dr. Marie-Thérèse Charreyre’s lab (NAM/NAS copolymers). Those systems were then evaluated in vitro for applications in therapy and imaging.

In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.