Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / La cellule dispose de plusieurs mécanismes de réparation, nécessitant tous l'accès à l'ADN, afin de prévenir les perturbations occasionnées par l'instabilité génomique. La structure des chromosomes eucaryotes (chromatine) forme une barrière physique empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la transcription, réplication, recombinaison et réparation des dommages de l'ADN. Dans ce dernier processus clé, certaines activités reconfigurant la chromatine pourraient donc s'avérer essentiels en facilitant l'accès à la machinerie de réparation. / Nous avons démontré le recrutement spécifique du complexe histone acétyltransférase NuA4 par immunoprécipitation de chromatine à une cassure double brin de l'ADN, le type de dommage le plus dangereux pour la cellule. Des cinétiques ont permis de déterminer à quel moment NuA4 apparaît au site de cassure en relation avec les modifications de la chromatine environnante et de vérifier l'apparition subséquente de complexes de remodelage ATP dépendant. En parallèle, de nouveaux sites de phosphorylation d'histones qui pourraient être impliqués dans la réparation de dommages sur l'ADN ont été investigués. En conclusion, nos travaux permettent de lier fonctionnellement des complexes de modification/reconfiguration de la chromatine avec le processus de réparation de dommages à l'ADN.

La protéine Rttl06 (Regulator of Ty Transposition) est un chaperon d'histones découvert récemment chez la levure. Ce facteur interagit avec les histones H3 et H4 et possède la faculté de déposer des nucléosome sur des molécules d'ADN. Dans notre laboratoire, le gène RTT106 fut identifié dans un crible de gènes synthétiques létaux utilisant une mutation dans le gène SPT2. De plus, des résultats obtenus dans notre laboratoire suggèrent que Rttl 06 est impliqué, tout comme SPT2 et SPT6, dans les modulations de la chromatine associée à l'élongation de la transcription. Des défauts dans cette fonction se manifeste par plusieurs phénotypes différents incluant une initiation de la transcription à partir de TATA cryptiques. Rttl06 est un chaperon d'histones suggérée de jouer un rôle dans la répression génique (± silencing ¿) par l'hétérochromatine chez S. cerevisiae. Elle interagit physiquement et fonctionnellement avec le Chromatin Assembly Factor-1 (CAF-1) qui est associé avec la déposition d'histones couplée à la replication. Nous avons utilisé diverses approches pour étudier Rtt106 de façon détaillée et lui avons identifié une fonction auparavant inconnue. Nous avons trouvé des interactions génétiques entre rtt106[delta] et des mutations dans des gènes codants pour des facteurs d'élongations, incluant Spt6, TFIIS et des membres des complexes PAF et DSIF. De plus, des analyses par immunoprecipitation de la chromatine indiquent que Rtt106 est associé spécifiquement aux régions transcrites de gènes actifs. Nos résultats ont aussi montré que Rtt106 est requis pour la répression de la transcription à partir de promoteurs cryptiques à l'intérieur d'une région codante. Cette observation suggère fortement que Rtt106 joue un rôle dans la régulation du niveau de déposition d'histone H3 couplée à la transcription. Pour finir, des résultats préliminaires suggèrent un lien entre Rtt106 et la régulation du niveau d'acétylation de la lysine 9 de l'histone H3. En somme, nos résultats indiquent un lien direct pour Rtt106 dans l'élongation de la transcription et les dynamiques de la chromatine associée avec le passage de l'ARN polymerase II.

La chromatine est une structure essentielle qui régit l'homéostasie cellulaire à travers diverses voies dépendantes de la molécule d'ADN telles que l'expression des gènes, la stabilité du génome, l'apoptose, etc. Ainsi, étudier ses mécanismes de régulation est un enjeu crucial pour comprendre le fonctionnement cellulaire. Un des facteurs clés de la modulation de la structure de la chromatine est le complexe acétyltransférase NuA4/TIP60. En effet, ce complexe multi-protéiques très conservé permet l'acétylation des histones, dont H4, et l'incorporation du variant H2A.Z. Il agit alors sur plusieurs mécanismes cellulaires tels que la réparation des cassures doubles brins d'ADN en favorisant la recombinaison homologue ou encore l'activation de la transcription. C'est pourquoi, il est primordial de comprendre en détails les fonctions de ce complexe. Mon projet de doctorat se découpe en deux parties selon les sous-unités du complexe NuA4/TIP60 étudiées. La première partie concerne la sous-unité MRG15, associée à de nombreux complexes, et donc impliquée dans plusieurs fonctions telles que la régulation de l'épissage ou encore la réparation de l'ADN. Combinant des méthodes d'édition du génome avec des purifications de complexes natif et de spectrométrie de masse, nous avons pu identifier un nouveau complexe, composé des sous-unités BRD8, MRGBP, MRG15/X ainsi qu'une nouvelle sous-unité, EP400NL, initialement décrite comme un pseudogène. Puis, par une technique de séquençage d'ARNs, nous montrons que ce complexe est important pour moduler l'expression de gènes spécifiques. De plus, nous avons étudié le mutant W78A/F105A de MRGBP qui perd l'interaction avec MRG15, et le mutant W172A/Y235A de MRG15 qui n'interagit plus avec les facteurs de réparations PALB2/BRCA2. De ce fait, ces mutants aideraient à la compréhension de la fonction de MRG15 lors de la réparation de l'ADN. La seconde partie de mon doctorat concerne la sous-unité MBTD1. En effet, nous nous sommes intéressés à la fusion entre MBTD1 et le facteur d'épissage ZMYND11. Elle est retrouvée dans des cas de leucémies myéloïdes aigües (LMA). Nous avons montré que les mécanismes oncogéniques de cette fusion sont dépendants de la délocalisation sur les corps des gènes du complexes NuA4/TIP60 induisant une augmentation d'acétylation de H4. Ceci génère alors un défaut transcriptionnel dont une surexpression de l'oncogène Myc et des dérégulations d'épissage alternatif de transcrits spécifiques. De plus, nous avons mis en évidence les résidus essentiels pour l'interaction entre MBTD1 et la sous-unité EPC1, associant alors MBTD1 avec le reste du complexe NuA4/TIP60. Ensemble, ces résultats permettraient le développement de nouveaux outils thérapeutiques pouvant cibler MBTD1 afin de traiter les cas de LMA spécifiques. L'ensemble de ces travaux offre une meilleure compréhension des fonctions du complexe NuA4/TIP60 liées à ses différentes sous-unités, à la fois au niveau transcriptionnel mais également au niveau de la réparation de l'ADN. De plus, ils établissent les mécanismes oncogéniques associées à ce complexe. Ainsi, de futures stratégies thérapeutiques pourraient être développées. / Chromatin is an essential structure that governs cell homeostasis through various DNA molecule-dependent pathways such as gene expression, genome stability, apoptosis, etc. Thus, studying its regulatory mechanisms is a crucial issue in understanding cell functioning. One of the key factors in the modulation of chromatin structure is the acetyltransferase complex NuA4/TIP60. Indeed, this highly conserved multi-protein complex allows the acetylation of histones, including H4, and the incorporation of the H2A.Z variant. It then acts on several cellular mechanisms such as the repair of DNA double strand breaks by promoting homologous recombination or even the activation of transcription. This is why it is essential to understand in detail the functions of this complex. My doctoral project is divided into two parts according to the subunits of the NuA4/TIP60 complex studied. The first part concerns the MRG15 subunit, associated with many complexes and therefore involved in several functions such as the regulation of splicing or DNA repair. Combining genome editing methods with native complex purifications and mass spectrometry analysis, we were able to identify a new complex, composed of the BRD8, MRGBP, MRG15/X subunits as well as a new subunit, EP400NL, initially described as a pseudogene. Then, by an RNA sequencing technique, we show that this complex is important for modulating the expression of specific genes. In addition, we studied the W78A/F105A mutant of MRGBP which loses interaction with MRG15 and the W172A/Y235A mutant of MRG15 which loses its interaction with repair factors PALB2/BRCA2. Thus, these mutants would help to understand the function of MRG15 during DNA repair. The second part of my doctorate concerns the MBTD1 subunit. Indeed, we were interested in the fusion between MBTD1 and the splicing factor ZMYND11 found in cases of acute myeloid leukemia (AML). We then showed that the oncogenic mechanisms of this fusion are dependent on the delocalization of the NuA4/TIP60 complex on the bodies of the genes, leading to an increase of H4 acetylation. This generates a transcriptional alteration including overexpression of the Myc oncogene and deregulation of alternative splicing of specific transcripts. In addition, we have characterized the residues required for the interaction between MBTD1 and the EPC1 subunit, essential for the association of MBTD1 with the rest of the NuA4/TIP60 complex. Together, these results would allow the development of new therapeutic tools that can target MBTD1 to treat specific AML cases. All of this work provides a better understanding of the functions of the NuA4/TIP60 complex linked to its various subunits both at the transcriptional level but also in DNA repair. In addition, they establish the oncogenic mechanisms associated with this complex. Thus, future therapeutic strategies could be developed.

Une régulation stricte des marques d'histones est critique durant le développement et l'activité aberrante des enzymes modifiant les histones joue un rôle important dans la tumorigénèse. La lysine-spécifique déméthylase 1 (LSD1) a émergé comme régulateur clef de l'expression des gènes. De nombreuses études ont impliqué LSD1 dans le contrôle de la prolifération, de la différentiation et de la mort cellulaire. LSD1 est également exprimé de manière aberrante dans une grande variété de tumeurs. Cependant, les mécanismes par lesquels LSD1 contrôle l'homéostasie cellulaire et tissulaire in vivo restent à déterminer. Durant ma thèse, j'ai utilisé le modèle de l'aile chez la Drosophile afin d'explorer la manière dont dLSD1 contrôle la croissance cellulaire et tissulaire. Spécifiquement, j'ai découvert que (1) la déplétion de dLSD1 conduit à une réduction significative de la taille de l'aile chez la Drosophile. J'ai montré que cette réduction de taille est due à une réduction du nombre de cellules mais pas de leurs tailles. J'ai démontré que (2) la déplétion de dLSD1 dans le disque imaginal de l'aile - tissu larvaire précurseur de l'aile adulte - affecte la prolifération à travers un nombre réduit de cellules en mitoses et un nombre plus élevé de cellules en phase S. Mes études montrent également que (3) la déplétion de dLSD1 induit des dommages à l'ADN affectant la stabilité du génome et causant une augmentation aberrante de l'apoptose. De manière intéressante, j'ai pu montrer que dLSD1 et le facteur de transcription P53 contrôlent la taille de l'aile de manière synergique, suggèrent que P53, facteur de réponse au stress, puisse être impliqué dans la détection et la réponse aux dommages induits par la déplétion de dLSD1. Afin de mieux comprendre le rôle de dLSD1 dans la croissance de l'aile, j'ai comparé les transcriptomes de disques d'aile mutants pour dLSD1 versus disques d'aile sauvages par RNA-Seq. J'ai montré que (4) dLSD1 contrôle l'expression de multiples réseaux de gènes importants pour la croissance des organes et réprime les transposons. De plus, mes résultats montrent que (5) la déplétion des composants de la voie PIWI-interaction ARNs, régulateurs négatifs de l'expression des transposons, affecte également la taille de l'aile. Finalement, (6) j'ai réalisé un crible génétique afin d'identifier des modulateurs du phénotype de réduction de la taille de l'aile dépendant de dLSD1 et j'ai trouvé que WARTS, un composant de la voie Hippo, restreignant la taille des organes, interagit génétiquement avec dLSD1. En conclusion, ma thèse a démontré l'importance du rôle de dLSD1 dans le contrôle de la taille des organes et que sa déplétion cause l'arrêt du cycle cellulaire, une augmentation de l'apoptose. Ces effets phénotypiques sont probablement dus à une dérégulation de l'expression de réseaux géniques spécifiques et à l'instabilité génomique causée par la dé-répression des transposons. J'ai également identifié de nouvelles interactions génétiques entre dLSD1 et P53 ainsi qu'entre dLSD1 et WARTS. / A strict regulation of histone marks is critical for normal development and aberrant activity of histones modifying enzymes plays a role in tumorigenesis. The lysine-specific-demethylase 1 (LSD1) has emerged as a key regulator of gene expression. Multiple studies have implicated LSD1 in the control of cell proliferation, cell differentiation and cell death. Accordingly, LSD1 is aberrantly expressed in a wide variety of tumors. However, the underlying mechanisms by which LSD1 controls cell and tissue homeostasis in vivo remain to be fully elucidated. During my thesis, I used the Drosophila wing model system to explore how dLSD1 controls cell and tissue growth. Specifically, I found that (1) dLSD1 depletion results in a significant reduction of Drosophila wing size. I show that the size reduction is due to decreased cell number but not cell size. I demonstrated that (2) dLSD1 depletion in wing discs - larval precursor tissue of the wing - affects proliferation through a decreased mitotic cell number and increased S-phase cell number. My studies also show that (3) dLSD1 depletion induces DNA damage thus affecting genome stability and causing aberrant apoptosis. Interestingly, I show that dLSD1 and the transcription factor P53 synergistically control wing size, suggesting that P53, a stress-response factor, might be involved in sensing the damage induced by dLSD1 depletion. To better understand dLSD1 role in wing growth, I compared the transcriptome of dLSD1-depleted wing discs to wild-type discs by RNA-Seq. I found that (4) dLSD1 controls the expression of multiple gene networks important for organ growth and represses transposons. Additionally, my results show that (5) depletion of PIWI-interacting RNAs pathway components, negative regulators of transposons expression, also affects wing size. Finally, (6) I performed a genetic screen to identify modulators of the dLSD1 wing size phenotype and I found that WARTS, a component of the Hippo pathway, which restricts organ size, genetically interacts with dLSD1. Overall, my work shows that dLSD1 plays an important role in organ size control and that its depletion causes cell cycle arrest and increased apoptosis. These phenotypic effects probably reflect the misregulation of the expression of specific gene networks and the genomic instability caused by de-repression of transposons. I also identified new interplay between dLSD1 and P53 as well as between dLSD1 and WARTS.

Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 24 p.

La spermatogenèse est un processus complexe permettant la génération de gamètes mâles ultra spécialisés, les spermatozoïdes. Plusieurs réorganisations successives de l'ADN sont essentielles pour la génération de gamètes mâles haploïdes, dont l'enjambement durant la méiose. La dernière étape de la spermatogenèse, la spermiogenèse, comporte une importante réorganisation nucléaire accompagnée de nombreuses cassures bicaténaires d'ADN, ce qui pourrait mener à une instabilité génétique, surtout dans ce contexte haploïde vulnérable. Le premier objectif de mes recherches était de mieux caractériser cette étape de remodelage chromatinien. Par une approche d'immunofluorescence, nous avons démontré la présence de l'enzyme topoisomérase IIß (TOP2B) lors du remodelage de la chromatine, ainsi qu'une réponse aux dommages à l'ADN coïncidant avec le remodelage chromatinien par l'apparition de la phosphorylation du variant d'histone H2AFX, une biomarqueur de cassures bicaténaires. II est donc fort probable que les spermatides utilisent un système de réparation propice à l'erreur, tel que la jonction terminale non-homologue (NHEJ) pour réparer les nombreuses cassures observées à ces étapes, menant possiblement à une instabilité génomique importante. Afin de mieux comprendre l'impact d'une réparation inadéquate ou d'une absence de réparation de ces cassures, nous avons voulu déterminer leur distribution sur le génome murin. Or, il n'existait aucune approche méthodologique permettant de cartographier ces cassures à l'échelle génomique. Utilisant plusieurs modèles in vitro et in vivo, nous avons mis au point une approche unique, appelée damaged DNA immunoprecipitation ou dDIP, pouvant enrichir les régions endommagée sans compromettre la résolution nucléotidique. Par la suite, nous avons mis au point une méthodologie de dDIP pour les cellules d'eucaryotes supérieurs en immobilisant les cellules dans une matrice d'agarose pour limiter l'introduction de dommages non-spécifiques. Le remodelage de la chromatine des spermatides représente une étape d'instabilité génomique encore peu explorée et pourrait s'avérer une source insoupçonnée de diversité génétique. Grâce à la création de la nouvelle méthodologie dDIP, il sera maintenant possible d'explorer l'importance des cassures transitoires observées durant ce drastique changement nucléaire pour les générations futures. De plus, cet outil peut être appliqué à différents types de dommages, tels que les dommages causés par le rayonnement ultraviolet et les dommages oxydatifs, et donc être utilisé dans l'étude de l'instabilité génomique et de la réparation de l'ADN dans de nombreux domaines scientifiques comme le cancer, la sénescence et la toxicologie.

L'entrée en sénescence, considérée comme un arrêt irréversible du cycle, se caractérise par une modification de l'organisation de la chromatine formant de véritables foyers d' hétérochromatine spécifiques (SAHF) coordonnée à une modification d'expression génique et à un déclin progressif de la compétence à répliquer le génome. Ainsi, au cours de ma thèse, j'ai voulu comprendre en quoi ces changements d'organisation du génome pouvaient influer sur la distribution et l'activation des origines d e réplication lors de l'entrée en sénescence réplicative ou déclenchée de façon prématurée par l'inhibition d'un modulateur de chromatine, la protéine à activité Histone AcétylTransférase p300. Pour étudier ces régulations, j'ai utilisé le peignage moléculaire d'ADN réplicatif qui permet de suivre les fourches de réplication et d'évaluer la distribution moyenne des origines. De plus, à l'aide de la purification de brins naissants aux origines de réplication couplée à un séquençage haut débit, nous avons cartographié la position de ces origines sur l'ensemble du génome humain et étudier un ensemble de facteurs pouvant intervenir dans ce déterminisme. Grâce à cette étude, nous avons pu suivre finement les modifications d'activité des origines associées à l'entrée en sénescence. De plus, afin de mieux comprendre les mécanismes d'activation des origines de réplication, nous avons étudié en collaboration avec l'équipe du Dr Fisher, le rôle de Cdk1 et de Cdk2 dans l'activation des origines dans le modèle Xénope. / Senescence entry, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by modifications of chromatin organization forming specific heterochromatin foci (SAHF) coordinated to modification of gene expression and the progressive loss of capacity to replicate the genome. During my PhD, we investigated whether these changes in genome organization might induce modifications in the distribution and the activity of replication origins during replicative senescence entry and in prematurely induced senescence by inhibition of a chromatin modulator, the Histone AcetylTransferase p300. To study these regulations, we used the replicating DNA combing allowing to follow the progression of replication forks and to evaluate the mean distribution of origins. By using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing, we mapped the position of replication origins in the whole human genome and studied some factors which could be involve d with this determinism. Thanks to this study, we followed finely the modifications of activity of replication origins associated to senescence entry. Moreover, in order to better understand the mechanisms of activation of origins, we studied in collaboration with Dr Fisher's team, the role of Cdk1 and Cdk2, in the activity of replication origins in the Xenopus model.

Le dérèglement de l'activité des facteurs épigénétiques est une caractéristique commune à plusieurs cancers humains. En effet, les complexes de remodelage de la chromatine de la famille SWItch/Sucrose Non-Fermentable chez les mammifères (mSWI/SNF) sont parmi les complexes protéiques les plus mutés dans les cancers humains avec environ 20% des patients cancéreux possédant au moins une sous-unité affectée. Chez l'homme, trois types de complexes mSWI/SNF ont été définis, à savoir les complexes BAF, PBAF et ncBAF. Ces complexes de remodelage de la chromatine dépendant de l'ATP remodèlent les nucléosomes et modulent la transcription. Pour ce faire, ils possèdent de nombreuses sous-unités avec des domaines de liaison à l'ADN et aux protéines tels que le bromodomaine (BRD). Les BRDs sont les principaux lecteurs de la modification post-traductionnelle qu'est l'acétylation de la lysine (Kac) et sont récemment apparus comme des cibles thérapeutiques prometteuses pour les inhibiteurs de petites molécules. Une caractéristique distinctive clé des complexes mSWI/SNF est leur capacité à inclure ou à exclure des sous-unités contenant le BRD. En tant que tel, nous avons cherché à découvrir les rôles fonctionnels des cinq sous-unités mSWI/SNF possédant un ou plusieurs BRDs. Ainsi, j'ai dans une première étude, cartographié l'interactome des sous-unités à BRDs des complexes mSWI/SNF en utilisant la biotinylation de proximité (BioID) couplée à la spectrométrie de masse (MS). Par la suite, en utilisant l'outil d'édition génomique, le CRISPR/Cas9, j'ai exploré comment l'ablation génétique d'une sous-unité à BRD réorganise les complexes mSWI/SNF à l'aide de l'approche de BioID couplée à la MS. Les résultats révèlent que la perte de la sous-unité BRD7 induit la formation d'un complexe PBAF résiduel sans l'inclusion de la sous-unité PBRM1 mais que cette perte a aussi des impacts sur le bien être des cellules et sur leurs sensibilités à certaines molécules anti-cancéreuses. La perte de BRD7 par translocation chromosomique étant souvent observée dans les cancers invasifs, j'ai dans une deuxième étude, montré que les outils de biotinylation de proximité pouvaient être utilisés dans les lignées cancéreuses afin d'investiguer un interactome protéique et ceci sans que ces outils n'impactent la composition de l'interactome obtenu. Cette étude a également montré que l'approche utilisée respecte la variabilité de l'interactome des récepteurs hormonaux en fonction du de la lignée cellulaire étudiée. La suite de cette étude permettrait de déterminer en utilisant des lignées de cancers invasifs du sein ayant une perte de BRD7 (par translocation chromosomique de BRD7 ou par CRISPR/Cas9) si les impacts observés dans les lignées HEK293 sont reproductibles. Mon document de thèse laisse entrevoir la possibilité que le protocole utilisé puisse permettre de révéler l'impact de la perte de BRD7 dans les cancers lobulaires infiltrants (CLIs) du sein et ainsi caractériser si les conséquences de cette perte peuvent être exploité dans le but de déterminer des thérapies ciblées pour les CLIs résistants aux traitements actuels. / The disruption of epigenetic factor activity is a common feature of many human cancers. Indeed, the mammalian SWItch/Sucrose Non-Fermentable family of chromatin remodeling complexes (mSWI/SNF) are among the most mutated protein complexes in human cancers with approximately 20% of cancer patients having at least one affected subunit. In humans, three types of mSWI/SNF complexes have been defined, namely BAF, PBAF and ncBAF. These ATP-dependent chromatin remodeling complexes remodel nucleosomes and modulate transcription. To do so, they have numerous subunits with DNA and protein binding domains such as the bromodomain (BRD). BRDs are key readers of the post-translational modification lysine acetylation (Kac) and have recently emerged as promising therapeutic targets for small molecule inhibitors. A key distinguishing feature of mSWI/SNF complexes is their ability to include or exclude BRD-containing subunits. As such, we sought to discover the functional roles of the five mSWI/SNF subunits possessing one or more BRDs. Thus, in a first study, I mapped the interactome of the BRDs-containing subunits of the mSWI/SNF complexes using proximity biotinylation (BioID) coupled to mass spectrometry (MS). Subsequently, using the genomic editing tool, CRISPR/Cas9, I explored how genetic ablation of a BRD subunit reorganizes mSWI/SNF complexes using the MS-coupled BioID approach. The results reveal that the loss of the BRD7 subunit induces the formation of a residual PBAF complex without the inclusion of the PBRM1 subunit, but that this loss also impacts on the cells' well-being and their sensitivities to certain anti-cancer molecules. As the loss of BRD7 by chromosomal translocation is often observed in invasive cancers, I showed in a second study that proximity biotinylation tools could be used in cancer lines to investigate a protein interactome without impacting the composition of the resulting interactome. This study also showed that the approach used respects the variability of the hormone receptor interactome depending on the cell line studied. The next step in this study would be to determine whether the impacts observed in the HEK293 lines are reproducible using invasive breast cancer lines with loss of BRD7 (by chromosomal translocation of BRD7 or by CRISPR/Cas9). My thesis paper suggests that the protocol used may reveal the impact of BRD7 loss in infiltrating lobular breast cancer (ILBC) and thus characterize whether the consequences of this loss can be exploited to determine targeted therapies for ILBC resistant to current treatments.

L'hétérochromatine péricentromérique semble jouer un rôle dans la régulation de l'expression génique et par conséquent dans le potentiel de développement des embryons. Nous avons fait l'hypothèse qu'une marque épigénétique, H3S10P, pourrait être un nouveau marqueur permettant le suivi des régions péricentromériques dans l'embryon préimplantatoire de souris. Par des techniques d'immunofluorescence et d'immuno-FISH couplées à de la microscopie en haute résolution, nous avons montré que la distribution de H3S10P dans les embryons de souris est différente de celle observée dans les cellules somatiques. Durant les stades 1 à 4-cellules, H3S10P est détectée en interphase autour des précurseurs des nucléoles (NPB), où elle colocalise avec les sondes ADN reconnaissant l'hétérochromatine péricentromérique, puis marque les bras chromosomiques sur toute la durée des phases de mitose. Après le stade 4-cellules, la distribution de H3S10P redevient similaire à ce qui est connu dans les cellules somatiques, avec un marquage au niveau des chromocentres seulement en fin d'interphase et sur les chromosomes mitotiques seulement jusqu'à la télophase. Cette cinétique particulière observée semble liée à l'absence de la kinase Aurora B aux stades les plus précoces. Nous avons également comparé la localisation de H3S10P avec celle d'autres marqueurs associés à l'hétérochromatine péricentromérique comme H3K9me3, HP1 β et la double modification H3K9me3S10P et en avons conclu que H3S10P est un meilleur marqueur pour l'hétérochromatine péricentromérique des deux génomes parentaux. Enfin, comme les embryons clonés obtenus par transfert nucléaire à partir de cellules somatiques (SCNT) montrent une redistribution anormale de l'hétérochromatine péricentromérique ainsi qu'un développement altéré, nous avons utilisé H3S10P pour détecter les remaniements de l'hétérochromatine après SCNT. Nos résultats montrent que, contrairement aux autres marqueurs, H3S10P n'est présente que sur la portion de l'hétérochromatine qui est correctement remaniée, tandis que l'hétérochromatine incorrectement reprogrammée conserve la signature épigénétique de la cellule donneuse. / Pericentromeric heterochromatin appears to be involved with gene regulation and therefore with the developmental potential of embryos. We hypothesized that an epigenetic modification, H3S10P, could be a new marker to follow pericentromeric heterochromatin in preimplantation mouse embryos. Using immunofluorescence, immunoFISH and high resolution microscopy, we observed that H3S10P shows a different distribution pattern in mouse embryos than in somatic cells. It is detected early in interphase around the Nucleolar-Precursor Bodies from 1- to 4-cell, in co-localization with the DNA probes for pericentromeric heterochromatin, and is seen in the chromosome arms throughout mitosis. In fact, H3S10P shows a similar kinetic as seen in somatic cells only after the 4-cell stage: being solely observed in the chromocenters during late interphase and on the mitotic chromosomes until telophase. This distribution seems related to the absence of Aurora B kinase in the earlier stages. We have also compared H3S10P to other related pericentromeric heterochromatin markers such as H3K9me3, HP1β and the double modification, H3K9me3S10P, and concluded that H3S10P is a better marker for pericentromeric heterochromatin of both parental origins. Finally, as cloned embryos often show abnormal pericentromeric heterochromatin remodelling and impaired development after Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT), H3S10P was used to track down heterochromatin reprogramming after SCNT. Our results show that H3S10P underlines only the portion of heterochromatin which is remodelled when compared with the other related markers and that the unremodelled portion maintains the epigenetic signature of the donor cell.

Chez les eucaryotes, l'ADN s'associe à des octamères d'histones pour former une structure nucléoprotéique dense appelée chromatine. Sous cette forme compacte, la chromatine agit comme une barrière topologique empêchant des facteurs de transcription par exemple, d'interagir avec l'ADN. Il va donc être essentiel de moduler la structure de la chromatine pour réguler l'accès à l'ADN et donc l'expression des gènes. L'une des stratégies adoptées, implique l'intervention de complexes multi-protéiques, appelés facteurs de remodelage de la chromatine, qui utilisent l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP pour perturber le positionnement des octamères d'histones par rapport à l'ADN. Les mécanismes sous-jacents, éventuellement variés, sont encore méconnus.<br />Nous utilisons ici un dispositif de pinces magnétiques pour sonder l'action de différents facteurs de remodelage (RSC, yISW1a et CHD1) sur une molécule d'ADN nue. Nous montrons que ces complexes ont des comportements différents vis-à-vis de ce substrat : en l'absence d'ATP, yISW1a et CHD1 s'accrochent à l'ADN de manière coopérative et réduisent son extension bout-à-bout. En présence d'ATP, RSC est capable de former de larges boucles d'ADN, sous-enroulées, dont la taille dépend de la force et de la concentration en ATP. Nous souhaitons maintenant sonder l'action de ces facteurs sur un substrat nucléosomal. Dans ce but, nous avons mis au point un protocole efficace pour préparer un substrat mono-nucléosomal, manipulable en pinces magnétiques, et nous avons défini une procédure pour s'assurer de la présence du nucléosome. Ce substrat de choix va nous servir de base pour l'étude de l'action des facteurs de remodelage de la chromatine.