Le nitrate est une source essentielle d’azote pour les plantes. Les transporteurs racinaires qui prélèvent le nitrate du sol sont soumis à des régulations transcriptionnelles qui modulent les capacités de prélèvement du nitrate. NRT2.1, transporteur de nitrate essentiel et majoritaire au niveau racinaire, est très fortement exprimé en condition limitante en nitrate, et réprimé sous forte nutrition azotée. Cette répression est corrélée avec un enrichissement en marque chromatinienne H3K27me3 qui semble dépendant du régulateur chromatinien HNI9. H3K27me3 est une marque chromatinienne répressive pour l’expression des gènes, catalysée par le complexe PRC2, et est impliquée dans la régulation du développement. Cependant, le rôle de H3K27me3 et de PRC2 dans l’adaptation à des environnements nutritionnels fluctuants reste à étudier. Le projet qui m’a été confié était d’étudier, chez Arabidopsis, la contribution de H3K27me3 dans la régulation du gène NRT2.1 en réponse à l'azote. Nous démontrons que H3K27me3 n’est pas le déterminant majeur de la répression de NRT2.1 par le fort statut azoté, mais que H3K27me3 régule directement NRT2.1, dans un contexte où NRT2.1 est fortement exprimé, afin de tempérer son expression. Nous montrons également que l’absence de limitation de l’hyperactivité du promoteur NRT2.1 peut in fine conduire à un état totalement réprimé par méthylation de l’ADN. Ce travail révèle une fonction insoupçonnée de PRC2 en tant que modulateur et protecteur de l’expression de gènes fortement exprimés. Nous montrons aussi que HNI9 aurait pour fonction d’activer des gènes de réponse à un stress oxydant mis en place lors d’une forte nutrition, et que PRC2 et NRT2.1 ont des rôles indépendants dans la régulation de l’architecture racinaire. L’ensemble de ce travail a permis de mettre en lumière de nouvelles fonctions de la dynamique chromatinienne dans la régulation de gènes majeurs pour la nutrition des plantes. / Nitrate is an essential source of nitrogen for plants. Root nitrate transporters are subjected to transcriptional regulations that allow a fine control of nitrate uptake capacities. NRT2.1, an essential and major nitrate transporter in roots, is strongly expressed under limiting nitrate condition, and repressed under high nitrogen nutrition. This repression is correlated with an enrichment in chromatin mark H3K27me3, which seems to be dependent on the chromatin regulator HNI9. H3K27me3 is a chromatin mark repressive for gene expression, catalysed by the PRC2 complex, and involved in developmental regulation. However, the role of H3K27me3 and PRC2 in the adaptation to fluctuating nitrogen environments remains to be understood. My project was to study, in Arabidopsis, the contribution of H3K27me3 in the regulation of NRT2.1 gene in response to nitrogen provision.We demonstrate that H3K27me3 is not the major determinant of NRT2.1 repression by high nitrogen status, but that H3K27me3 directly regulates NRT2.1, in a context where NRT2.1 is strongly expressed, to temper its expression. We also show that the absence of limitation of NRT2.1 promoter hyperactivity can lead to a switch to full silencing by DNA methylation.This reveals an unexpected function of PRC2 as a safeguard for the expression of highly expressed genes. We also show that HNI9 is involved in the activation of oxidative stress responsive genes, which occurs under N-rich nutrition, and that PRC2 and NRT2.1 play independent roles in the regulation of root architecture. This work has highlighted new functions of chromatin dynamic in the regulation of genes with major significance for plant nutrition.

L’ADN est constamment exposé à des insultes génotoxiques endogènes et exogènes. Plusieurs mécanismes de réparations de l’ADN sont mis en œuvre pour préserver la stabilité du génome et de l’épigénome. La recombinaison homologue (RH) joue un rôle central dans la réparation des cassures double brin de l’ADN (DSBs) et le redémarrage des fourches de réplication en réponse à un stress réplicatif. Ces deux processus sont tous deux couplés à l’assemblage de la chromatine. Le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est un chaperon d’histone conservé au cours de l’évolution qui fonctionne dans le processus d’assemblage des nucléosomes couplé à la réparation de l’ADN et à la réplication, en déposant sur l’ADN les tétramères d’histones (H3-H4)2 nouvellement synthétisés. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, le complexe CAF-1 est constitué de trois sous-unités, Pcf1, Pcf2 et Pcf3. Il a été montré que CAF-1 agit dans l’étape de synthèse de l’ADN durant le processus de réplication dépendante de la recombinaison (RDR) et protège le désassemblage des D-loop par l’hélicase Rqh1, membre de la famille des hélicases RecQ. Dans cette étude, nous avons adressé le rôle de CAF-1 pendant la réparation de l’ADN par recombinaison homologue chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Par l’utilisation d’approches in vivo et in vitro, nous avons validé des interactions protéines-protéines au sein d’un complexe contenant Rqh1, CAF-1, PCNA, et l’Histone H3. Nous avons montré que Rqh1 interagit avec Pcf1 et avec Pcf2 indépendamment l’un de l’autre, et que l’interaction Rqh1-Pcf1 est stimulée par des dommages à l’ADN. Nous avons mis en place une méthode d’analyse de liaison à la chromatine pour suivre l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse aux dommages à l’ADN. Nous avons observé qu’un stress réplicatif, mais pas l’induction de cassures double brin de l’ADN, favorise l’association de CAF-1 à la chromatine. Nous avons identifié plusieurs facteurs de la RH nécessaire pour l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse à un stress réplicatif. De plus, nous avons mis en évidence des interactions physiques entre Pcf1 et des facteurs de la recombinaison homologue, parmi lesquels RPA et Rad51. Nos données suggèrent que CAF-1 pourrait s’associer aux sites de synthèse d’ADN dépendent de la recombinaison via son interaction avec des facteurs de la RH. L’ensemble des données de cette étude contribuent à renforcer le role de CAF-1 couplé à réparation de l’ADN, et révèlent une interconnexion entre les facteurs de la RH et l’assemblage de la chromatine. / DNA is constantly exposed to both endogenous and exogenous genotoxic insults. Multiple DNA repair mechanisms are exploited to guard the genome and epigenome stability. Homologous recombination (HR) plays a major role in repairing DNA double strand breaks (DSBs) and restarting stalled replication forks under replicative stress. These two processes are both coupled to chromatin assembly. Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) is a highly conserved histone chaperone known to function in a network of nucleosome assembly coupled to DNA repair and replication, by depositing newly synthesized histone (H3-H4)2 tetramers onto the DNA. The fission yeast CAF-1 complex consists of three subunits Pcf1, Pcf2 and Pcf3. CAF-1 has been previously reported to act at the DNA synthesis step during the process of recombination-dependent replication (RDR) and protects the D-loop from disassembly by the RecQ helicase family member, Rqh1. In this study, we addressed the role of CAF-1 during homologous-recombination-mediated DNA repair in fission yeast.Using in vivo and in vitro approaches, we validated interactions within a complex containing Rqh1, CAF-1, PCNA, and Histone H3. We showed that Rqh1 interacts with both Pcf1 and Pcf2 independently of each other, and the Pcf1-Rqh1 interaction is stimulated by DNA damage. We developed an in vivo chromatin binding assay to monitor the association of CAF-1 to the chromatin upon DNA damage. We observed that replication stress but not double strand break favors CAF-1 association to the chromatin. We identified that several HR factors are required for CAF-1 association to the chromatin upon replication stress. In support of this, we have identified physical interactions between Pcf1 and HR factors, including RPA and Rad51. Our data suggest that CAF-1 would associate with the site of recombination-dependent DNA synthesis through physical interactions with HR factors. Put together, this work contributes to strengthening the role of CAF-1 coupled to DNA repair, and reveals the crosstalk between HR factors and chromatin assembly.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La transcription par l’ARN polymérase II (ARNP II) est un mécanisme promiscuitaire à l’origine d’évènements transcriptionnels hasardeux, qui génèrent continuellement des transcrits aberrants dans la cellule. L’organisation précise du matériel génétique sous forme de chromatine est cruciale pour améliorer la précision de l’ARNP II en orientant sa fonction pour limiter ses erreurs et empêcher cette transcription cryptique. La structure chromatinienne est très dynamique et plusieurs mécanismes moléculaires coopèrent afin de déstabiliser les nucléosomes en amont de l’ARNP II, pour autoriser la lecture de l’ADN, et de les reconstituer dans son sillage, pour maintenir l’organisation chromatinienne du génome. De façon intéressante, une fonction potentielle de la caséine kinase 2 (CK2) dans la dynamique de la chromatine est suggérée dans la littérature. CK2 est une protéine kinase essentielle, conservée chez les eucaryotes, et impliquée dans des processus cellulaires variés. Dans notre étude, nous explorons le rôle de CK2 dans les modulations de la chromatine associées à la transcription. Nous avons démontré que CK2 phosphoryle le chaperon d’histones Spt6, régulant ainsi sa stabilité et sa fonction d’organisateur chromatinien. L’inactivation de cette voie de régulation conduit à l’accumulation considérable de transcrits cryptiques provenant d’initiations opportunistes intragéniques sens et antisens. La phosphorylation de Spt6 par CK2 favorise le recyclage des histones H3/H4 en 3’ des régions codantes et participe ainsi à la conservation de la structure de la chromatine lors de la transcription et à la suppression de la transcription cryptique. Notre étude suggère en outre que les fonctions de CK2 dans la modulation de la chromatine et la précision transcriptionnelle pourraient s’étendre au-delà de la régulation de Spt6, via la modulation de facteurs tels que les complexes PAF ou FACT. Enfin, nous proposons que la suppression de la transcription cryptique par CK2 contribue à optimiser la transcription afin d’améliorer la réponse transcriptionnelle à des stress extérieurs. L’ensemble de notre étude montre que CK2 stimule la précision transcriptionnelle en régulant directement Spt6 et probablement d’autres facteurs impliqués dans le maintien co-transcriptionnel de la chromatine. Ce mécanisme est crucial pour préserver le programme d’expression du génome et favorise la plasticité et l’efficacité de la réponse transcriptionnelle aux signaux de stress, nécessaires à l’adaptation de la cellule à son environnement. / Transcription by RNA polymerase II (RNAPII) is pervasive and aberrant transcripts are permanently generated within cells. Precise and controlled genomic organization in chromatin structure is essential to improve RNAPII accuracy and prevent cryptic transcripts accumulation. Chromatin structure is highly dynamic during transcription, unfolded to give access to DNA and refolded back in the wake of RNAPII to prevent spurious transcription. Multiple mechanisms act together to make this process highly efficient. Casein Kinase 2 (CK2) is a protein kinase ubiquitously present among eukaryotes and implicated in various important cellular processes. Interestingly, a potential function of this kinase in chromatin dynamics through the regulation of chromatin factors has previously been suggested. In this study, we address the role of CK2 in chromatin modulations associated with transcription. We found that CK2 depletion from yeast cells results in an increase of histone turnover in 3’ of transcribed regions and spurious transcription from cryptic promoters. Interestingly, we demonstrate that CK2 modulates directly Spt6 histone chaperone stability and function. This regulation promotes histone recycling during transcription elongation and maintain chromatin organization within coding regions, thereby inhibiting cryptic intragenic and antisense transcription. Our study also suggests that CK2 suppression of spurious transcription extend beyond Spt6 regulation. Indeed, we describe that additional role of CK2 with respect to spurious transcription could be related to its regulation of RNAP II activity through CTD Ser2 phosphorylation. Chromatin regulators such as PAF complex and FACT could also be involved in this regulation process. Finally, we propose that CK2 suppression of spurious transcription is essential for transcriptional optimal and efficient responses to environmental signals. Altogether, our data highlights CK2 signaling pathway as a regulator of transcription accuracy by affecting the essential histone chaperone Spt6, and probably other factors directly involved in the transcriptional process. This mechanism is important to the suppression of cryptic transcription in steady state conditions but also seems to contribute to the fitness of an optimal cellular response to stress signals.

La transcription est le processus biologique qui permet l'expression des gènes et donc est essentielle à la vie cellulaire. Ce phénomène nécessite une régulation très fine via de nombreux signaux cellulaires menant à un contrôle de la dynamique chromatinienne. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4 participe à cette régulation en acétylant les queues N-terminales des histones H4 et H2A. La chromatine est alors plus relâchée, ce qui facilite l'accès de toute la machinerie transcriptionnelle. Lors de cette étude, nous avons abordé deux aspects distincts de la fonction de NuA4. D'une part, la sous-unité Yng2, homologue de suppresseur de tumeur humain impliqué entre autres dans la régulation de p53, est connue pour interférer dans plusieurs processus cellulaires. In vivo, le mutant Ayng2 entraîne une diminution de l'acétylation de H4 et de la transcription dépendante de NuA4. La création de mutations ponctuelles dans le domaine ± Plant HomeoDomain ¿ (PHD) et la région polybasique de la protéine provoque la perte d'interactions spécifiques avec la modification post-traductionnelle H3K4me3 et les phosphatidylinositol phosphates. L'étude fonctionnelle de ces mutants révèle une répercussion sur l'activité de NuA4 et la transcription. D'autre part, les sous-unités EaO, 5 et 7 existent majoritairement hors de NuA4 sous la forme d'un trimère. Des tests de sensibilité mettent en évidence une corrélation entre ce trimère et la transcription. De plus, le trimère serait présent à la région codante de gènes transcrits suggérant un rôle dans l'élongation transcriptionnelle.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / La chromatine est une structure nucléaire composée des histones, autour desquelles l’ADN s’enroule pour être empaqueté dans le noyau. La dynamique de cette structure permet de réguler plusieurs procédés nucléaires, tels que la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN. Il existe, entre autre, des complexes de modifications de la chromatine qui collaborent à la régulation de ces différentes fonctions nucléaires. Les acétyltransférases de la famille MYST participent à l’acétylation des queues N-term des histones. Très conservées de la levure à l’humain, elles possèdent des rôles importants dans plusieurs processus cellulaires. Deux des complexes MYST ont été au cœur de mes études doctorales, soit le complexe HBO1 et MOZ/MORF. Mon projet de doctorat avait comme premier objectif de disséquer les différents domaines protéiques présents au sein de ces deux complexes et de caractériser leurs interactions soit avec les autres sous-unités, soit avec la chromatine. Par des analyses biochimiques, nous avons déterminé le mode d’assemblage des complexes MYST. Nous avons également caractérisé leurs différents domaines de reconnaissance de modifications post-traductionnelles des histones, afin de déterminer leur mode de recrutement. Des analyses à l’échelle du génome entier nous ont aussi permis de localiser ces protéines à des loci bien précis. De plus, il nous a été possible de constater l’importance de l’association des protéines INGs sur la fonction suppresseur de tumeur du complexe HBO1-JADE. Suite à une purification de la protéine BRPF1, j’ai pu constater l’association de HBO1 avec cette protéine. Comme deuxième objectif de thèse, j’ai donc eu à caractériser le nouveau complexe HBO1-BRPF1 et à démontrer sa spécificité d’acétylation. En utilisant des essais d’acétylation in vitro combinés à des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, j’ai pu établir un nouveau mode de régulation de l’activité acétyltransférase de la protéine HBO1. Ce mécanisme étonnant démontre un changement de spécificité de l’activité catalytique des MYST en fonction de leur association aux protéines d’échafaudage. Tous ces résultats démontrent donc qu’il est important de considérer l’ensemble des sous-unités des complexes MYST, car elles sont toutes aussi importantes que l’enzyme pour la reconnaissance, la spécificité d’acétylation ainsi que les fonctions cellulaires de ces complexes. / Chromatin is a nuclear structure formed by DNA that is wrapped around histone octamers, allowing for its compaction in the nucleus. This structure is dynamic and regulates many nuclear processes, such as transcription, replication and DNA repair. Among other factors, complexes that modify chromatin collaborate for the regulation of these nuclear functions. The MYST acetyltransferase family participate in the acetylation of histone N-term tails. Highly conserved from yeast to human, they play various roles in many cellular pathways. During my PhD, I have focused on two of these MYST acetyltransferases, HBO1 and MOZ/MORF. The first objective of my project was to dissect the different protein domains comprised within these complexes and define their interactions either with other subunits or with chromatin. Using biochemical experiments, we brought to the forefront the assembly mechanism of the MYST complexes. Additionally, we characterized their chromatin recognition domains, which helped us determine their recruitment mechanism. Genome-wide analysis also gave us the precise localisation of these proteins on many loci. Moreover, we could determine that the association with ING subunits is essential for the tumor suppressor function of these complexes. Following purification of the BRPF1 protein, we could detect binding of the HBO1 protein. Thus, the second objective of my PhD project was to characterize the newly identified HBO1-BRPF1 complex and determine its acetylation specificity. Using in vitro acetylation assays combined with chromatin immunoprecipitation experiments, we unravelled a new regulation mechanism of the HBO1 acetyltransferase activity. This surprising mechanism shows a switch of histone tail acetylation specificity depending of the associated scaffold proteins, an activity previously thought to be intrinsic to the catalytic subunit. These data highlight a new role of the associated scaffold subunits within MYST-ING acetyltransferase complexes in directing the acetylation of specific histone tails. Altogether, these results demonstrate that it is important to consider MYST acetyltransferases as complexes, since their different subunits contribute to chromatin recognition, acetylation specificity and cellular functions.

Au centre du ribosome, lui-même centre de synthèse de toutes les protéines, se trouve quatre molécules d’ARN, nommées les ARNs ribosomiques. Ces ARNs sont synthétisés dans le nucléole des cellules eucaryotes à partir des gènes répétés en tandem, les gènes d’ARN ribosomiques. Ces gènes nécessitent une régulation très stricte de la transcription des ARN ribosomiques pour permettre un cycle cellulaire contrôlé et surtout contrôlable. En effet, un débalancement de la transcription des ARN ribosomiques a été observée dans de nombreuses maladies comme par exemple le cancer. En conséquence, l’étude de la régulation de la synthèse des ARN ribosomiques est d’une importance cruciale dans la compréhension et subséquemment le traitement de ces maladies. En raison du nombre de répétitions des gènes d’ARN ribosomiques, souvent évaluées aux alentours de 175 par génome haploïde pour les mammifères, l’étude in vivo de leur régulation est difficile par les techniques de mutagénèse. L’approche que j’ai développée durant cette thèse de doctorat est celle de l’immuno-précipitation de chromatine suivie de séquençage à haut débit (ChIP-Seq) en combinaison avec des lignées cellulaires conditionnelles pour des facteurs essentiels de la transcription ribosomique. Les gènes d’ARN ribosomique possèdent la particularité d’être transcrits grâce à une machinerie entièrement dédiée à sa transcription. Ces facteurs généraux de transcription agissent de concert pour effectuer efficacement leur rôle. Dans l’organisme modèle utilisé ici, à savoir Mus musculus, l’ARN polymérase I transcrit ces gènes avec l’aide, lors de l’initiation, des facteurs UBF, Rrn3/TIF-1A et SL-1/TIF-1B. Le facteur de terminaison TTF-1 permet de terminer la transcription de l’ARN précurseur, et joue plusieurs rôles dans la régulation de l’état des gènes. Dans un premier temps, nous avons été amenés à développer, en complément du séquençage à haut débit, une approche de déconvolution des données pour permettre d’améliorer l’interprétation subséquente. Cette approche a été validée par l’amélioration notamment des profils d’immuno-précipitation de chromatine obtenus avec l’ARN polymérase I qui montrent une distribution homogène le long des gènes d’ARNr comme montrée par la technique de Miller Spread. Cette amélioration des données a également pu mettre en avant un double rôle d’UBF en fonction soit de sa complémentarité avec SL-1 soit de son affinité pour les séquences riches en GC de l’ADN. Par la suite nous avons pu mettre en évidence la localisation des régions régulatrices et, en amont de ces régions, d’une barrière nucléosomique permettant de créer et maintenir une zone sans nucléosomes le long des gènes d’ARN ribosomiques. Cette barrière possède deux particularités. La première est d’être identifiée par les marques épigénétiques associées habituellement à l’activation de la transcription comme H3K4me3, H2A.Z ou encore l’acétylation de H2A.Z. La deuxième particularité est d’être indépendante de la présence d’UBF qui est elle-même indépendante de la transcription. Cependant, ce travail n’a pas détecté la présence des marques épigénétiques de l’activation de la transcription le long des gènes d’ARNr remettant en question certaines hypothèses sur la régulation de la transcription ribosomique. Finalement, les études en parallèle dans les cellules souche embryonnaires (mESC) et fibroblastes embryonnaires (MEF) a permis d’identifier 3 catégories de gènes ribosomiques dans une même cellule. Une première forme nucléosomale ou l’ADN est méthylé et hétérochromatique, une deuxième nucléosomale mais non méthylée et finalement une forme transcrite. Une comparaison quantitative de la synthèse d'ARNr dans les mESCs et les MEFs a montré que le nombre de gènes actifs n'est pas un facteur significatif dans la régulation de la synthèse d’ARNr. Dans des cellules souches embryonnaires, tous les gènes sont transcrits en même temps avec une faible efficacité. Dans des cellules différenciées, une faible portion des gènes est transcrite mais très efficacement, cette efficacité étant relié au nombre de polymérase en cours de transcription. Les différents profils d'interaction de Rrn3 et de PolI près du site d'initiation de la transcription suggèrent que cette différence est due à une régulation de l'initiation / At the heart of the ribosome, itself the center of synthesis of all proteins, are four RNA molecules, called ribosomal RNAs. These RNAs are synthesized in the nucleolus of eukaryotic cells from the tandemly repeated genes, the ribosomal RNA genes. A very strict regulation of the transcription of ribosomal RNA needs to be made to allow a controlled and above all a controllable cell cycle. Indeed, the imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. Due to the number of repeats of ribosomal RNA genes, evaluated at around 175 per haploid genome for mammals, the in vivo study of their regulation by mutagenesis techniques is difficult. The approach I developed during this doctoral thesis is that of chromatin immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (ChIP-Seq) applied to cell lines conditional for the basal transcription factors. The ribosomal RNA genes have the particularity of being transcribed thanks to an entirely dedicated transcriptional machinery. In mice, these general transcription factors act in concert to perform their role effectively. In the model organism used here, namely Mus musculus, RNA polymerase I transcribes the genes with the help, during initiation, of the factors UBF, Rrn3 / TIF-1A and SL-1 / TIF-1B. The TTF-1 termination factor makes it possible to terminate transcription of precursor ribosomal RNA, and also plays roles in gene regulation. In addition to high-throughput sequencing, we have developed a deconvolution approach to improve the interpretation of ChIP-Seq data. This approach has been validated by the improvement in particular of immunoprecipitation profiles obtained for RNA polymerase I that confirm the electron microscopy images of Miller spread type. This improvement of the data could also highlight a dual role of UBF depending on its complementarity with SL-1 and its affinity for GC-rich sequences of DNA. Subsequently we have been able to highlight the upstream localization of the regulatory regions and of a nucleosome barrier allowing to create and maintain a zone without nucleosomes along the rRNA genes. This barrier has two peculiarities, the first is that it contains the epigenetic marks usually associated with the activation of transcription such as H3K4me3, H2A.Z or the acetylation of H2A.Z. The second particularity is that it is independent of the presence of UBF, which is itself independent of transcription. Challenging certain assumptions about the regulation of ribosomal transcription, our work did not detect the presence of epigenetic markers of transcriptional activation throughout the rRNA gene body. Finally, parallel studies in embryonic stem cells (ESC) and embryonic fibroblasts (MEFs) made it possible to identify 3 categories of ribosomal genes in the same cell. First, a heterochromatic DNA methylated and nucleosomal form, a nucleosomal but non-DNA methylated form, and finally a transcribed form. A quantitative comparison of rRNA synthesis in ESCs and MEFs has shown that the number of active genes is not a significant factor in the regulation of rRNA synthesis. In embryonic cells, all genes are transcribed at the same time with low efficiency. In differentiated cells, a small portion of the genes are transcribed but very efficiently, this efficiency being related to the number of polymerase being transcribed. The different interaction profiles of Rrn3 and PolI near the transcription initiation site suggest that this difference is due to the regulation of initiation.

Les nucléosomes, composés d’histones et d’ADN, constituent l’unité de base de la chromatine. Toutes les actions portant sur l’ADN ou nécessitant cette molécule doivent d’abord éliminer la répression physique réalisée par la structure du nucléosome. Il existe pour cela trois mécanismes principaux permettant de rendre plus fluide et plus dynamique cette structure. Les différents éléments mis en jeu dans ces mécanismes sont les chaperons d’histones, les facteurs de remodelage de la chromatine et enfin les facteurs modifiant les extrémités des histones. NuA4, un complexe de 12 sous-unités de la levure Saccharomyces cerevisiae faisant partie de la dernière famille de facteurs pouvant influencer la structure de la chromatine, est capable d’acétyler les histones H4 et H2A sur leur extrémité N-terminale. Sa sous-unité catalytique, Esa1, est la seule histone acétyltransférase essentielle pour la levure. Plusieurs sous-unités du complexe possèdent des domaines particuliers présents dans des protéines ayant un rôle dans la structure de la chromatine. C’est le cas notamment de Esa1 et de Eaf3 qui possèdent un chromodomaine, domaine selon la protéine a été caractérisé comme un module de reconnaissance soit d’ARN soit de lysine méthylées des histones. Le but de mon projet doctoral était de caractériser la régulation de NuA4 et plus particulièrement de comprendre le rôle de ses deux protéines à chromodomaine Esa1 et Eaf3. Dans un premier temps, nous avons cherché à identifier certaines modifications sur les histones capables de moduler l’activité de NuA4. Ce travail nous a permis d’identifier et de caractériser deux nouvelles enzymes, Rmt1 et Dot1, responsables respectivement de la méthylation de l’arginine 3 de H4 et de la lysine 79 sur l’histone H3. Seule la première de ces deux modifications s’est révélée avoir une influence sur l’activité de NuA4 et ce en combinaison avec la phosphorylation de la sérine 1 de l’histone H4. Dans un deuxième temps nous avons essayé de comprendre la fonction de Eaf3, en particulier son rôle potentiel dans la reconnaissance des lysines méthylées. Grâce à des études génétiques et biochimiques nous avons pu établir un lien entre Eaf3 et la lysine 36 méthylée de H3. / Nucleosomes, composed of DNA and histones, are the basal unit of chromatin. All cellular mechanisms involving DNA have to deal with the repressive structure formed by nucleosomes. Histone chaperons, chromatin remodelling enzymes and complexes able to modify the N terminus of histones are major molecular compounds able to affect chromatin structure. NuA4 is a 12-subunit-histone-acetyltransferase-complex from Saccharomyces cerevisiae able to influence chromatin by acetylating N terminus of H4 and H2A. Esa1, its catalytic subunit, is the only essential histone acetyltransferase in yeast. Other subunits of the complex possess domains find in proteins playing a role in chromatin dynamic structure. This is the case for Esa1 and Eaf3, each one has a chromodomaine which is found to be, depending on the protein, a non-coding RNA binding module or a histone methyl lysine binding module. The main aim of this project was to find how NuA4 was regulated and more precisely to understand functions of its 2 chromodomain-containing proteins, Esa1 and Eaf3. First, we looked for histone modifications able to influence NuA4 activity which leads us to characterize two new enzymes, Rmt1 and Dot1, responsible respectively for the methylation of H4 arginine 3 and H3 lysine 79. Of these 2 modifications only the first one was able to influence NuA4 activity in combination with H4 serine 1 phosphorylation. Second, we tried to understand Eaf3’s function and particularly its potential role in histone methyl lysine binding. With genetic and biochemical studies we demonstrated a link between Eaf3 and méthylation of lysine 36 on histone H3.

L'empaquetage du génome eucaryote sous forme de chromatine constitue une barrière physique aux facteurs nécessaires à la transcription des gènes, la replication, la recombinaison et la réparation de l'ADN. Les eucaryotes ont développé différents mécanismes par lesquels la structure de la chromatine et sa composition peuvent être manipulées afin de contrôler l'accès à l'ADN. Il s'agit notamment de modifications covalentes des histones, le remodelage ATP-dépendant des nucléosomes et l'incorporation de variants d'histones. Le but initial de ma thèse était d'étudier les interactions fonctionnelles entre les différents régulateurs de la chromatine. Dotl (Disruptor of telomeric silencing-1) est une histone méthyltransférase qui cible la lysine 79 de l'histone H3 nucléosomale et contribue à l'établissement de la frontière entre l'hétérochromatine et l'euchromatine en bloquant la propagation du complexe SIR. La méthylation par Dotl a été liée à l'élongation de la transcription et est régulée par l'ubiquitination de l'histone H2B. Lors de nos études sur les relations fonctionnelles avec d'autres modifications des histones, nous avons constaté que le domaine N-terminal de l'histone H4, à la différence des autres queues d'histones, est essentiel pour la méthylation de la lysine 79 de H3 par Dotl, tant in vivo que in vitro. La protéine hétérochromatinienne Sir3 lie également la queue de H4 et compétitionne donc avec Dotl pour la même cible moléculaire sur la chromatine, expliquant ainsi le mécanisme d'établissement de frontières chromatiniennes. L'acétylation de l'histone H4 joue également un rôle important dans l'organisation des frontières chromatiniennes et l'incorporation du variant d'histone H2A.Z près des telomeres, un processus catalysé par SWR1, un complexe de remodelage ATP-dépendant. Au niveau de gènes euchromatiniens, l'acétylation de H4 et l'incorporation de H2A.Z se produisent surtout au niveau des promoteurs. Ces deux événements sont importants pour préparer le promoteur du gène PH05 à son activation transacriptionnelle. Nous avons déjà identifié une relation fonctionnelle entre SWR1 et NuA4, un complexe acetyltransferase d'histone essentiel pour la viabilité cellulaire et l'acétylation des histones H4 et H2A. NuA4 et SWR1 montrent de fortes interactions génétiques et nos résultats indiquent qu'ils coopèrent également au niveau des promoteurs des gènes ADE. Fait important, NuA4 affecte l'incorporation de l'histone H2A.Z in vivo et l'acétyle directement à l'intérieur de nucléosomes, in vitro et in vivo. Afin d'analyser la relation fonctionnelle entre NuA4 et SWR1 au niveau moléculaire, nous avons développé un essai d'échange d'histones en utilisant de la chromatine native purifiée et des dimères H2A.Z-H2B recombinants. Nos données indiquent que NuA4 stimule l'échange de dimères d'histones par SWR1, dans une réaction dépandant de l'acétyl-CoA et de l'ATP. En outre, l'acétylation des histones H4 et H2A par NuA4 fonctionnent de façon redondante dans la promotion de l'incorporation de H2A.Z par le complexe SWR1. Pris dans leur ensemble, nos résultats dressent un tableau détaillé de la succession d'événements moléculaires survenant lors de l'établissement des frontières hétérochromatine/euchromatine et mènent à une meilleure compréhension mécanistique de la relation intime et conservée évolutivement entre l'acétylation de la chromatine par le complexe NuA4/TIP60 et l'échange de variants d'histones H2A par le complexe SWRl/p400.

Le génome est organisé sous forme de chromatine afin de contourner la problématique d’espace limité dans le noyau. De plus, cette structure hautement condensé est une barrière physique aux processus cellulaires qui nécessite l’accès à l’information génétique. Les dernières années d'études ont dévoilé des complexes modificateurs de la chromatine comme des acteurs clés dans plusieurs mécanismes de modulation de la chromatine. L'un de ces modificateurs est NuA4, un complexe conservé au cours de l’évolution qui acétyle les histones H2A, H2A.Z et H4. Dans cette thèse, en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle, nous avons identifié l'implication de NuA4 dans l'incorporation de H2A.Z et la biosynthèse des voies purines. Dans une seconde partie, nous étudions la participation de NuA4 dans la réponse aux dommages de l'ADN. Plus précisément, nous avons caractérisé la phosphorylation des sous-unités NuA4 dépendante de Mec1/Tel1. L’ensemble de ces travaux, comment NuA4 coordonne différentes activités cellulaires. / Cell genome is packaged into chromatin in order to compensate the limited space within the nucleus. However, this highly condensed structure also presents strong physical barriers for cellular processes using DNA as templates. Recent years of studies have unveiled chromatin modifying complexes as key players in several mechanisms of chromatin modulation. One of these modifiers is NuA4, an evolutionary conserved large multi-subunit histone acetyltransferase complex that acetylates histone H2A, H2A.Z and H4. In this thesis, using Saccharomyces cerevisiae as model system, we identified the implication of NuA4 in global histone variant H2A.Z incorporation and purine biosynthesis pathways. Moreover, we also show previously uncharacterized involvement of NuA4 in DNA damage response pathways through Mec1/ Tel1-dependent phosphorylation events on NuA4 subunits. Further analysis will shed light on detailed mechanisms about how NuA4, as a multifunctional complex, coordinates various cellular activities.