Chez S.cerevisiae, NuA4 est un complexe Histone acetyltransferase (HAT) de 1,3 MDa contenant 13 sous unités. Esal, seule HAT essentielle chez la levure, est la sous-unité catalytique qui acétyle les histones H4 et H2A et une des six protéines essentielles du complexe. De plus, six protéines sont présentes dans d'autres complexes de modification (SAGA, Sin3/Rpd3) et de remodelage ATP- dépendant de la chromatine (Ino80 et Swrl) et deux sous-groupes ont été identifiés comme ayant une activité cellulaire indépendante et distincte de NuA4 (PiccoloNuA4 et le trimère Eaf5/7/3). Cette organisation modulaire de NuA4 correspond aux multiples besoins de recrutements et de régulation d'Esal par la cellule lors des événements de réparation, de transcription et de replication de la chromatine. Chez l'humain, le complexe Tip60 est l'orthologue de NuA4 et regroupe les activités de modification de la chromatine de NuA4 et de Swrl. L'organisation spatiale de NuA4 présente donc beaucoup d'intérêt. Au sein du laboratoire du professeur Jacques Côté, je concentre mon travail sur la production et la purification du complexe NuA4. Avec nos échantillons hautement purifiés, les techniques d'analyse par microscopie électronique (EM) et de reconstitution informatique, réalisées par nos collaborateurs Johnathan Chittuluru et Francisco Asturias, permettent, avec une forte résolution, de visualiser le complexe en 3D. Les atouts majeurs associés à cette technique sont aussi de visualiser les interactions du complexe avec un nucléosome et de localiser les sous-unités dans le complexe (par deletion ou étiquetage). Dès lors, ces résultats apportent des indications pertinentes sur NuA4 et ces différents modules qui par recrutement ou interaction directe avec les histones participent à la régulation dynamique de la chromatine.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 août 2023) / Les changements dans la forme et la déformation du noyau qui déterminent la plasticité nucléaire influencent le potentiel métastatique des cellules tumorales. Entre autres, la migration cellulaire dans un environnement confiné repose sur de grandes déformations nucléaires qui sont limitées par la rigidité nucléaire. L'enveloppe nucléaire (NE) est souvent fragilisée, entraînant une rupture de la NE durant l'interphase. En outre, les cellules cancéreuses sont sujettes aux ruptures spontanées de la NE et subissent des ruptures de la NE lors de la migration confinée. Bien que les cellules cancéreuses survivent à des événements répétés de ruptures nucléaires en réparant leur enveloppe nucléaire, une perte transitoire et répétée de l'intégrité de celle-ci est associée à l'accumulation de dommages à l'ADN, à l'instabilité génomique et à la promotion d'un phénotype tumoral invasif. Ainsi, l'étude des mécanismes impliqués pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Récemment, nous avons décrit la protéine adénovirale E4orf4 comme un nouvel outil pour déchiffrer ces mécanismes. E4orf4 induit une destruction sélective des cellules tumorales en provoquant une forte incidence de ruptures de la NE. Nous avons identifié Ash2L, un régulateur épigénétique, comme un nouveau substrat de la tyrosine kinase Src qui est dérégulée par E4orf4. La déplétion d'Ash2L, ou sa phosphorylation site-spécifique, interfèrent avec les ruptures de la NE induites par E4orf4 ou par une carence en lamine A. Notre hypothèse est qu'Ash2L et sa phosphorylation modulent la résilience mécanique de la NE, en partie, en régulant l'organisation de la chromatine. Le but de ce projet de maîtrise était d'étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la résilience nucléaire au stress mécanique par Ash2L, en poursuivant deux objectifs spécifiques : 1) Analyser la contribution de l'organisation de la chromatine à l'effet régulateur d'Ash2L sur les ruptures de l'enveloppe nucléaire ; 2) Analyser l'impact d'Ash2L et de sa phosphorylation sur l'organisation de la chromatine. Afin d'analyser la contribution de l'organisation de la chromatine à l'effet régulateur de Ash2L, nous avons utilisé des inhibiteurs des histones méthyltransférases affectant la compaction de la chromatine. Par microscopie en temps réel, nous montrons que de courts traitements avec ces inhibiteurs dans les cellules déplétées en Ash2L rétablissent partiellement les phénotypes de rupture de la NE induits par E4orf4 ou par une carence an lamines A. De plus, la déplétion d'Ash2L ou sa phosphorylation site-spécifique réduit la triméthylation de l'histone H3 sur la lysine 4 et semble modifier l'organisation des foyers d'hétérochromatine enrichis en histone H3 triméthylée sur la lysine 27. Enfin, nous avons découvert que la déplétion d'Ash2L réduit le potentiel migratoire des cellules métastatiques de carcinomes rénaux RCC4 dans un microenvironnement dense. Les résultats obtenus suggèrent qu'Ash2L et sa phosphorylation régulent la résilience nucléaire au stress mécanique en modifiant l'état de compaction de la chromatine. Ash2L pourrait donc contribuer à la réponse adaptative des cellules cancéreuses aux changements du microenvironnement qui favorisent l'invasion tumorale. / Changes in the shape and deformability of the nucleus, that determines nuclear plasticity, influence the metastatic potential of tumor cells. Among other events, cell migration in a confined environment relies on large nuclear deformations which are limited by nuclear rigidity. The nuclear envelope (NE) is often weakened, leading to NE rupture during interphase. In addition, cancer cells are prone to spontaneous NE ruptures and undergo NE ruptures during confined migration. Although cancer cells survive repeated events of nuclear rupture by repairing the NE, transient and repeated NE integrity loss is associated with DNA damage accumulation, genomic instability, and the promotion of an invasive tumor phenotype. Therefore, the study of the mechanisms involved could identify new therapeutic targets. Recently, we described the adenoviral protein, E4orf4, as a new tool to decipher these mechanisms. E4orf4 induces selective destruction of tumor cells causing a high incidence of NE ruptures. We have identified Ash2L, an epigenetic regulator, as a novel substrate for the Src tyrosine kinase which is deregulated by E4orf4. Ash2L depletion, or its site-specific phosphorylation, interferes with NE ruptures induced by E4orf4 or by lamin A deficiency. We hypothesize that Ash2L and its phosphorylation modulate the mechanical resilience of NE, in part, by regulating chromatin organization. This master's project aimed to study the mechanisms involved in the regulation of nuclear resilience to mechanical stress by Ash2L and pursued two specific objectives: 1) To analyze the contribution of chromatin organization to the regulatory effect of Ash2L on nuclear envelope ruptures; 2) To analyze the impact of Ash2L and its phosphorylation on the organization of chromatin. To analyze the contribution of chromatin organization to the regulatory effect of Ash2L, we used histone methyltransferase inhibitors affecting chromatin compaction. By real-time microscopy, we show that short treatments with these inhibitors in cells depleted of Ash2L partially restore the NE disruption phenotypes induced by E4orf4 or by lamin A deficiency. In addition, Ash2L depletion or its site-specific phosphorylation reduces the trimethylation of histone H3 on lysine 4 and appears to modify the organization of heterochromatin foci enriched in trimethylated histone H3 on lysine 27. Finally, we discovered that the depletion of Ash2L reduces the migratory potential of metastatic RCC4 renal carcinoma cells in a dense microenvironment. The results obtained suggest that Ash2L and its phosphorylation regulate nuclear resilience to mechanical stress by modifying the state of chromatin compaction. Ash2L may therefore contribute to the adaptive response of cancer cells to changes in the microenvironment that promote tumor invasion.

Bien que l’ADN contenu dans les cellules eucaryotes permette le stockage de l’information génétique, c’est l’empaquetage de l’ADN en chromatine qui permet d’organiser finement cette information au cours du développement des organismes. Cependant cette structure constitue une barrière pour l’accessibilité de séquences d’ADN régulatrices. Ainsi, il existe différents mécanismes qui permettent de moduler la structure de la chromatine afin de définir le programme transcriptionnel spécifique de chaque cellule durant le développement des organismes. Dans cette étude nous avons montré que BAF60, une sous unité des complexes de remodelage de la chromatine de type SWI/SNF, favorise la transition florale en réprimant l’expression du gène FLC, répresseur de la floraison, et en contrôlant la formation d’une boucle intra-génique sur ce gène via la modulation de la condensation de la chromatine, la composition en histone et la régulation de marques épigénétiques au niveau de ce locus. De plus, nous avons mis en évidence que BAF60 agit sur la croissance des racines en régulant négativement la production de cytokinines et en favorisant la progression du cycle cellulaire grâce à son rôle sur l’architecture chromatinienne. Nous avons également montré que BAF60 se fixe préférentiellement sur les G-box des gènes actifs au niveau des régions sans nucléosome. BAF60 est exprimé durant le jour et favorise la répression de gènes impliqués dans l’élongation de l’hypocotyle. L’ensemble des résultats obtenus dans cette étude a montré que BAF60 régule des étapes clés du développement d’Arabidopsis thaliana en modulant l’architecture chromatinienne afin de réguler l’expression de nombreux gènes indispensables à différentes voies développementales de la plante. Comprendre comment BAF60 peut réguler l’organisation chromatinienne au sein de tissus spécifiques constituera le prochain défi. / Although DNA in eukaryotic cells allows storage of genetic information, it is its packaging into chromatin which allows to finely organize this information throughout the development of organisms. Chromatin constitutes a barrier to regulatory DNA sequences accessibility. Different mechanisms modulate chromatin structure in order to set the specific transcriptional program for each cell type during development. In this study, we have shown that BAF60, a subunit of SWI/SNF complexes, promotes flowering, by repressing the expression of FLC, a key flowering repressor. BAF60 regulates FLC by controlling gene loop formation via modulation of chromatin condensation, histone composition and post-translational modifications. Furthermore, we have demonstrated that BAF60 acts on root growth by negatively regulating cytokinin production and by promoting cell cycle progression through its role in chromatin architecture. We have also shown that BAF60 binds preferentially G-box of active genes at nucleosome-free region. BAF60 is expressed during the day to promote repression of genes involved in hypocotyl elongation. All together these results have shown that BAF60 regulates key steps of Arabidopsis thaliana development. BAF60 can thus modulate chromatin architecture to regulate the expression of many genes required for different plant developmental pathways. Understanding how BAF60 can regulate chromatin organization in specific cell types is the next challenge.

La régulation de l’expression des gènes est critique pour l’adaptation des cellules à leur environnement et pour leur homéostasie. La transcription, qui représente une étape essentielle de l’expression des gènes, est contrôlée par plusieurs facteurs et cofacteurs. L’un de ces cofacteurs, TRRAP, correspond à la plus grosse sous-unité de deux complexes de remodelage de la chromatine, SAGA et TIP60. TRRAP interagit avec divers facteurs de transcription, tels que c-MYC et E2Fs et permet ainsi le recrutement de SAGA et TIP60 aux promoteurs des gènes. TRRAP est un membre d’une famille de kinases atypiques, les PIKKs. Des études antérieures ont défini la co-chaperonne TTT comme régulateur essentiel de la stabilité et l’activité des PIKKs. Contrairement aux autres PIKKs, TRRAP ne possède pas les résidus requis à son activité catalytique et représente donc la seule pseudo-kinase parmi les PIKKs. Bien que TTT interagit et stabilise TRRAP, son rôle sur l’activité de ce dernier reste inconnu. En utilisant un système de dégron inductible qui permet la dégradation rapide de protéines endogènes, nous avons démontré que TTT est requis pour l’assemblage de TRRAP dans ses complexes fonctionnels précédent son import nucléaire. De plus, à travers des analyses transcriptomiques, nous avons pu déterminer que TTT régule la transcription de plusieurs gènes TRRAP-dépendants dans des cellules de cancer colorectal. L’analyse du profile de fixation de TRRAP à l’échelle du génome grâce à la technique du CUT&RUN suivie d’un séquençage à haut débit (CUT&RUN-seq), a permis d’identifier les cibles directes de TRRAP, parmi lesquelles seule une fraction restreinte correspond à des cibles directes de MYC. Nous avons également découvert que TRRAP possède un rôle de répresseur direct sur la transcription d’une partie des gènes stimulés par l’interféron (ISGs) qui interviennent dans la réponse à l’interféron du système immunitaire innée. En outre, nos résultats suggèrent que TRRAP et sa co-chaperonne TTT participent à la tumorigenèse notamment en maintenant et régulant un programme transcriptionnel spécifique. / Gene expression regulation is critical for cells to adapt to external changes and maintain their homeostasis. Transcription is an essential step in gene expression and is controlled by numerous factors and cofactors. One such cofactor is TRRAP, the largest subunit of two distinct chromatin-modifying complexes, SAGA and TIP60. TRRAP interacts with a diverse range of transcription factors including c-MYC and E2Fs, and mediates the recruitment of SAGA and TIP60 to gene promoters. TRRAP is a member of the PIKK family of atypical kinases. Prior studies defined the TTT co-chaperone as an essential regulator of PIKK stability and activity. In contrast to its cognate kinases, TRRAP lacks catalytic residues and is the sole pseudokinase among PIKKs. Although TTT has been shown to stabilize and interact with TRRAP, the role of TTT on TRRAP function remains unknown. Using an inducible degron system that allows the rapid and acute depletion of endogenous proteins, we demonstrated that TTT is required to assemble TRRAP within its functional complexes prior its nuclear import. Additionally, through transcriptomic analyses we determined that TTT regulates a large number of TRRAP-dependent genes in colorectal cancer cells. Profiling of the genome-wide binding of TRRAP via CUT&RUN-seq identified the direct targets of TRRAP, of which only a small fraction overlaps with MYC targets. We also uncovered a direct inhibitory role of TRRAP on a subset of the interferon-stimulated genes, which mediate the interferon response in the innate immune system. Altogether, our data suggest that TRRAP and its chaperone TTT are involved in tumorigenesis through the maintenance of a specific transcriptional program.

Dans les cellules eucaryotes l'ADN nucléaire est organisé sous la forme de chromatine, dont l'unité de répétition est le nucleosome. En règle générale, la chromatine est considérée comme répressive pour les processus nécessitant un accès à l'ADN tels que la transcription, la réplication ou la réparation. Le nucléosome représente une forte barrière pour des protéines nécessitant l'accès à l'ADN. Pour surmonter cette barrière, la cellule a développé des méthodes variées, dont la plus importante semble être le remodelage des nucléosomes dépendant de l'ATP. Une propriété commune à tous ces facteurs de remodelage est leur capacité de repositionner les nucléosomes le long de l'ADN.<br /><br />Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme de déplacement des nucléosomes par RSC et SWI/SNF, deux facteurs de remodelage de levure bien caractérisés. Nous avons combiné des approches basées sur la visualisation à haute résolution, notamment la microscopie à force atomique (AFM) et la cryo-microscopie électronique, avec des approches nouvelles à pointe de la biochimie et de la biologie moléculaire. <br /><br />Nous avons montré que la mobilisation des nucléosomes par RSC ou SWI/SNF implique des espèces réactionnelles intermédiaires métastables dont l'existence et la structure étaient jusqu'alors inconnues. Ces particules nucléosomales, que nous avons nommé ‘remosomes', possèdent certaines propriétés structurales distinctes des nucléosomes canoniques. En particulier, les ‘remosomes' contiennent ~180 pb d'ADN associées à l'octamère d'histones au lieu de 147 pb pour les nucléosomes canoniques. En utilisant, l'empreinte à la DNase I nous avons montré que le ‘remosome' représente un ensemble de structures multiples caractérisées par un enroulement fortement perturbé de l'ADN sur l'octamère d'histones. Pour caractériser ces ‘remosomes' avec une grande précision, nous avons mis au point une nouvelle technique « one pot in gel assay » qui consiste à cartographier toutes les 10 pb l'accessibilité d'une enzyme de restriction au ‘remosome' fractionné. L'application de cette technique a révélé que le profil de l'accessibilité du ‘remosome' est très différent de celui du nucléosome. Alors que celui du nucléosome peut être extrapolé par une fonction de type hyperbolique, le profil du ‘remosome' est ajusté par une fonction parabolique. <br /><br />Nous avons voulu répondre à la question du mécanisme de l'inhibition de la mobilisation du nucléosome variant H2A.Bbd par SWI/SNF. En utilisant les techniques décrites plus haut sur des nucléosomes variants ou chimériques (contenant des délétions ou translocations de domaines d'histones) nous avons montré que le domaine d'accrochage (‘docking domain') de l'histone H2A est essentiel pour la mobilisation des nucléosomes. Nous avons aussi montré que l'incapacité du nucléosome à glisser est due à la génération d'états intermédiaires ‘remosomes erronés', distincts de ceux apparaissant dans le cas du nucléosome conventionnel.

La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours des processus nucléaires utilisant l’ADN comme matrice tels que la réplication, la transcription ou la réparation des cassures et autres types de lésions à l’ADN. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés. Ils regroupent les complexes de remodelage ATP-dépendants et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Nous nous intéressons au laboratoire à la voie de méthylation de la lysine 20 située sur la queue aminoterminale de l’histone H4. Le premier niveau de méthylation est induit par la monométhyltransférase PR-Set7 tandis que la di et tri méthylation sont déposées par le couple d’enzymes SUV4-20H1/2. Pour mieux caractériser le rôle joué par PR-Set7 au cours du développement, j’ai étudié la fonction de l'orthologue de PR-Set7 chez la Drosophile (dPR-Set7). La première partie de ma thèse a consisté à caractériser le rôle de dPR-Set7 dans la transcription. De manière intéressante, nous avons montré que la régulation transcriptionnelle médiée par PR-Set7 nécessite son domaine SET enzymatique mais pas H4K20me, suggérant l'existence d’autres substrats non-histones. Nous avons mis en évidence une interaction fonctionnelle de PR-Set7 et ISWI qui est la sous unité catalytique des complexes de remodelage de la chromatine (CRC). Fait intéressant, ISWI contient un patch basique identique à la queue N-terminale de H4 suggérant qu’il pourrait être un substrat pour dPR-Set7. La deuxième partie de ma thèse a consisté à combiner l’effet des radiations à ceux induits par les inhibiteurs des méthyltransférases responsables de la méthylation H4K20 et les radiations dans les lignées de cellules cancéreuses du pancréas et de l’ovaire. Par l'utilisation de différents inhibiteurs ciblant soit PR-Set7 ou les enzymes SUV4-20H, j’ai voulu savoir si la baisse des niveaux de H4K20me pourrait contribuer à une meilleure efficacité des traitements aux rayons X. Nos résultats montrent que la diminution globale des marques H4K20me2/3 suite à l’inhibition des enzymes SUV4-20H n’impacte que faiblement sur la survie des cellules et la combinaison des deux traitements les rendraient plus radiosensibles. / Chromatin is a dynamic nucleoprotein structure that requires remodeling for all nuclear processes such as replication, transcription and DNA damage. Several factors have been characterized to modulate chromatin structure and include ATP-dependent remodeling complexes and histone-modifying enzymes. We are interested in the laboratory in the methylation pathway of lysine 20 on histone H4 tail. The first level of methylation is induced by the monomethyltransferase PR-Set7 and the di/tri methylation are deposited by the SUV4-20H enzymes. To better characterize the role of dPR-Set7 during development, I wanted to study the function of Drosophila PR-Set7 (dPR-Set7). The first part of my thesis aimed to unravel the role of dPR-Set7 in transcription. Interestingly, transcriptional regulation mediated by PR-Set7 requires its enzymatic SET domain but not H4K20me, suggesting the existence of other non-histone substrates. We demonstrated a functional interaction between PR-Set7 and ISWI, the catalytic subunit of chromatin remodeling complexes (CRC). Interestingly, ISWI contains a basic patch identical to the histone H4 tail suggesting that it could be a substrate for dPR-Set7. The second part of my thesis consisted in combining inhibitors of H4K20 methyltransferase and radiation in ovarian and pancreatic cancer cell lines. I wanted to know if the decrease of H4K20me levels by inhibiting either PR-Set7 or SUV4-20H enzymes, contribute to better X-ray treatments. Our results show that the overall decrease of H4K20me2/3 marks following the inhibition of SUV4-20H enzymes has a low impact on cell survival and the combining effects of both treatments sensitize cancer cells.

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire. / Chromatin is more than just the eucaryotic DNA packaging system; it is the substrate of all reactions involving DNA in eukaryotic cells and actively regulates RNA Polymerase II (RNAPolII) access to DNA. Responsible for all mRNA transcription in eucaryotes, the RNAPolII must, following its recruitment to the pre-initiation complex, overcome the chromatin barrier in order to transcribe genes. The RNAPolII CTD allows for the co-transcriptional coordination of mRNA maturation and chromatin modifications. The work covered in this thesis addresses two aspects of transcription: the chromatin substrate, with the localization of H2A variant, H2A.Z, and the transcription complex with the phosphorylation cycle of the RNAPolII CTD. Following the introduction, chapter 2 constitutes a detailed and annotated Saccharomyces cerevisiae ChIP-chip protocol, from the culture to the hybridization of the array, with an emphasis on the proper controls required for chromatin study. This technique, extremely powerful for the in vivo study of all DNA transactions, leads to a better understanding of chromatin function in nuclear phenomena, thanks to the localization of histone variants and modifications. The third chapter maps the H2A.Z variant across the yeast genome at ~300 base pairs resolution using ChIP-chip. Our data shows that H2A.Z is incorporated into one or two promoter-bound nucleosomes at the majority of genes. H2A.Z enrichment is anticorrelated with transcription, and the results suggest that it configures chromatin structure to poise genes for transcriptional activation. Furthermore, we have shown that H2A.Z can regulate nucleosome positioning. The next chapter focuses on the transcription machinery and, more precisely, on the phosphorylation cycle of RNAPolII. The CTD contains repetitions of a heptapeptide (YSPTSPS) on which all serines are differentially phosphorylated along genes in a prescribed pattern during the transcription cycle. Here, we systematically profiled the location of the RNAPII phospho-isoforms in wild-type cells and mutants for most CTD modifying enzymes. The results provide evidence for a uniform CTD cycle across genes. Together with results from in vitro assays, these data reveal a complex interplay between the modifying enzymes, identify Ssu72 as the Ser7 phosphatase and show that proline isomerization is a key regulator of CTD dephosphorylation at the end of genes. Moreover, it reinforces the notion of variants of the phosphorylation marks, even though the exact nature of the variant is still difficult to identify. The discussion introduces the studies that followed this work, including new projects conceived in our lab.

Dans ce travail, nous avons étudié en détails l'interaction de l'histone H1 avec l'ADN nucléosomal afin de comprendre comment cette interaction conduit à l'organisation en fibre nucléosomale. Nous avons pu résoudre ce problème ancien par l'utilisation de : (i) l'incorporation de H1 par une chaperonne d'histone physiologique, NAP-1, (ii) la reconstitution de nucléosomes parfaitement homogènes sur une matrice d'ADN contenant la séquence 601 fortement positionnante, (iii) une combinaison de cryo-microscopie électronique (EC-M) et de technique d'empreinte aux radicaux OH°, (iv) une modélisation mécanique du polymère ADN de type « coarse-grain ». Notre « cartographie » par empreinte OH° de résolution d'un nucléotide montre que le domaine globulaire de H1 (GH1) interagit à travers le petit sillon avec des « patch » d'ADN de 10 pb de part et d'autre de la dyade du nucléosome. De plus, GH1 organise environ un tour d'hélice d'ADN de chaque ADN de liaison du nucléosome. En même temps, une suite de 7 acides aminés (120-127) de la partie COOH-terminale est requise pour la formation de la structure en tige de l'ADN de liaison.

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire. / Chromatin is more than just the eucaryotic DNA packaging system; it is the substrate of all reactions involving DNA in eukaryotic cells and actively regulates RNA Polymerase II (RNAPolII) access to DNA. Responsible for all mRNA transcription in eucaryotes, the RNAPolII must, following its recruitment to the pre-initiation complex, overcome the chromatin barrier in order to transcribe genes. The RNAPolII CTD allows for the co-transcriptional coordination of mRNA maturation and chromatin modifications. The work covered in this thesis addresses two aspects of transcription: the chromatin substrate, with the localization of H2A variant, H2A.Z, and the transcription complex with the phosphorylation cycle of the RNAPolII CTD. Following the introduction, chapter 2 constitutes a detailed and annotated Saccharomyces cerevisiae ChIP-chip protocol, from the culture to the hybridization of the array, with an emphasis on the proper controls required for chromatin study. This technique, extremely powerful for the in vivo study of all DNA transactions, leads to a better understanding of chromatin function in nuclear phenomena, thanks to the localization of histone variants and modifications. The third chapter maps the H2A.Z variant across the yeast genome at ~300 base pairs resolution using ChIP-chip. Our data shows that H2A.Z is incorporated into one or two promoter-bound nucleosomes at the majority of genes. H2A.Z enrichment is anticorrelated with transcription, and the results suggest that it configures chromatin structure to poise genes for transcriptional activation. Furthermore, we have shown that H2A.Z can regulate nucleosome positioning. The next chapter focuses on the transcription machinery and, more precisely, on the phosphorylation cycle of RNAPolII. The CTD contains repetitions of a heptapeptide (YSPTSPS) on which all serines are differentially phosphorylated along genes in a prescribed pattern during the transcription cycle. Here, we systematically profiled the location of the RNAPII phospho-isoforms in wild-type cells and mutants for most CTD modifying enzymes. The results provide evidence for a uniform CTD cycle across genes. Together with results from in vitro assays, these data reveal a complex interplay between the modifying enzymes, identify Ssu72 as the Ser7 phosphatase and show that proline isomerization is a key regulator of CTD dephosphorylation at the end of genes. Moreover, it reinforces the notion of variants of the phosphorylation marks, even though the exact nature of the variant is still difficult to identify. The discussion introduces the studies that followed this work, including new projects conceived in our lab.

T. gondii interfère avec l'activation des voies de signalisation de NF-kB des cellules hôtes. Ainsi, lors de l’infection par T. gondii, 85% des gènes dépendant de NF-kB sont up-régulés. Un autre facteur de transcription dont l’expression est modulée par le parasite est UHRF1 (Ubiquitin-like,containing PHD and RING finger domains, 1). UHRF1, en se fixant sur le promoteur du gène de la cycline b, induit une répression épigénétique de ce dernier conduisant à un arrêt du cycle cellulaire des cellules infectées en phase G2 et à un arrêt de la prolifération parasitaire. L’analyse in silico du promoteur du gène uhrf1 a montré qu’il possédait 9 sites de fixation de NF-kB. Effectivement nous avons démontré que NF-kB interagit avec le promoteur du gène uhrf1 lors d’une infection par T. gondii. L’expression d’UHRF1 serait donc modulée par NF-kB dans les cellules infectées par T. gondii. Or NF-kB a une régulation différentielle en fonction de la nature de la souche infectante. Là encore, nous avons pu observer une régulation différentielle d’UHRF1 selon la nature de la souche infectante, pouvant être dues à la régulation souche dépendante de NF-kB. La détermination du rôle précis de l’activation d’UHRF1 dans les cellules infectées et l’identification du ou des facteurs parasitaires responsables pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de persistance intracellulaire du parasite et de découvrir de nouveaux points d’impact thérapeutiques. / T.gondii interferes with the activation of NF-kB signaling pathways. Thus, upon infection by T.gondii, 85% of genes NF-kB-dependent are up-regulated. Another transcription factor whose expression is modulated by the parasite is UHRF1 (Ubiquitin-like, Containing PHD and RINGfinger domains, 1). UHRF1, bind to the gene promoter of cyclin b and induces epigenetic repression of this gene leading to cell cycle arrest in G2 phase of infected cells and stop the proliferation in both infected cells and parasite. In silico analysis of the uhrf1 gene promoter has been shown to possess 9 binding sites of NF-kB. Our study showed that NF-kB actually interacts with the promoter of gene uhrf1 during infection with T. gondii. This suggests that the expression of UHRF1 is modulated by NF-kB in T. gondii-infected cells. In addition we observed differential regulation of UHRF1 depending on the nature of the infecting strain. These variations may also be due to already well-known differential regulation of NF-kB by different strains of T.gondii. Determining the precise role of UHRF1 activation in infected cells and the identification of the parasitic factor responsible of this activation would allow to a better understanding of the mechanisms of intracellular persistence of the parasite and allow to unravel new therapeutic trails.