Orientadora : Profa. Dra. Jovanir Inês Müller Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa: Palotina, 24/02/2017 / Inclui referências / Resumo: Esse trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito da adição de queratinase em dietas contendo inibidores de tripsina sobre o desempenho produtivo, peso do pâncreas, rendimento e composição de carcaça e integridade intestinal de frangos de corte submetidos ou não a um modelo de desafio sanitário. Foram realizados dois experimentos. No experimento 1 foram alojados 1280 pintos em esquema fatorial 2 x 2 (com e sem a presença de soja x com e sem queratinase). A inclusão da queratinase foi de 250 g/tonelada. O desempenho das aves foi avaliado semanalmente até os 42 dias. Aos 21 e 42 dias de idade, o peso do pâncreas foi obtido para cálculo do peso relativo. Aos 42 dias foi determinado o rendimento de carcaça, avaliação da ocorrência de White Striping, resistência de pele e composição de carcaça. Aos 21 e 42 dias foram coletados segmentos intestinais para histomorfometria, contagem de caliciformes e Índice de Saúde intestinal (ISI). No experimento 2; 640 pintos foram alojados em gaiolas experimentais e distribuídos em esquema fatorial 2 x 2 (com e sem queratinase e com e sem desafio). As rações foram formuladas com farelo de soja subprocessado. O desafio foi promovido por meio da utilização de cama descartada. Aos 21 dias foi realizado o desempenho zootécnico das aves. Aos 14 e 21 dias foram coletados segmentos intestinais para histomorfometria, contagem de caliciformes e avaliação da saúde intestinal. No experimento 1, a suplementação da queratinase resultou em maior ganho de peso e a inclusão de soja crua em pior conversão alimentar aos 7 dias. Aos 21 dias, a associação entre a queratinase e a soja crua reduziu o peso do pâncreas. Aves suplementadas com a queratinase apresentaram maior rendimento de carcaça. A inclusão de soja crua resultou em maior elasticidade de pele. Aos 21 dias, aves que consumiram dieta com soja crua apresentaram menor relação V:C e maior número de criptas por vilo. A utilização da queratinase reduziu os escores de ISI aos 21 dias. No entanto, aos 42 dias a queratinase resultou em maior inflamação intestinal. No experimento 2, o desafio resultou em maior largura de cripta e menor relação vilo:cripta, aos 14 dias. Aves que sofreram o desafio e receberam a suplementação de queratinase apresentaram maior área de absorção do jejuno. Aos 21 dias, aves suplementadas com a queratinase apresentaram maior largura de vilo e as desafiadas, em maior número de caliciformes no jejuno. Aves que receberam dietas sem a inclusão da queratinase e foram desafiadas apresentaram maior número de caliciformes no duodeno. Resultado semelhante foi observado nas aves não desafiadas e que receberam a suplementação de queratinase. Aves desafiadas apresentaram maior escore de ISI aos 14 dias. Aos 21 dias, aves suplementadas com queratinase e desafiadas apresentaram maior inflamação intestinal. Portanto, a suplementação de queratinase resultou em melhora no desempenho e integridade intestinal na fase inicial de criação. Além disso, a associação da queratinase e soja crua resultou em redução no peso do pâncreas e da inflamação intestinal no íleo. Palavras-chave: desafio sanitário, globulinas, inflamação intestinal / Abstract: The aim was to evaluate the effect of queratinase addition on diets containing trypsin inhibitors on the productive performance and intestinal health of broilers and under sanitary challenge. There were two trials; in the first one there were 1280 chicks housed in a completely randomized design in a 2 x 2 factorial scheme (with and without raw soybean replacing deactivated soybean x with and without queratinase). The queratinase was added in the diets at a dose of 250 g/ton. The performance of the birds was weekly assessed. At 21 and 42 days of age, the weight of the pancreas was obtained in order to calculate the relative weight. At 42 days, the carcass yield was performed, assessment of White Striping, skin resistance and carcass composition. At 21 and 42 days, intestine fragments were collected for histomorphometry, goblet cell counting and intestinal health evaluation, applying the morphometric index "I See Inside" (ISI). In the second trial, there were 640 chicks housed in experimental cages and placed in a completely randomized design following a 2 x 2 factorial scheme (with and without queratinase and with and without challenge). The diets were calculated with subprocessed soybean meal. The challenge was promoted through the use of discarded bedding. At 21 days, the performance of the animals was obtained. At 14 and 21 days intestine fragments were collected for histomopho metry, goblet cell counting and intestinal health evaluation. The results were submitted to analysis of variance at the 5% level of significance using SAS. In the first trial, the queratinase supplementation showed higher weight gain and raw soybean worst feed conversion ratio at 7 days of age. At 21 days, the association of queratinase and raw soybean resulted in a reduction of pancreatic weight. Birds supplemented with queratinase showed higher carcass yield. The addition of raw soybean caused higher skin elasticity. At 21 days, birds that received the diet with raw saybean showed lower V:C and higher number of crypts per villi. The use of queratinase provided a decrease of the ISI scores at 21 days. However, at 42 days, the queratinase showed higher intestinal inflammation. In the second trial, the challenge resulted in larger crypts and lower V:C at 14 days. The birds that underwent the challenge and received the queratinase supplementation had higher absorption area of jejunum. At 21 days, birds supplemented with queratinase showed higher larger villi; and the ones that were challenged higher number of goblet cells in the jejunum. Animals that received diets without queratinase and underwent the challenge had higher number of goblet cells. A similar result was noticed in birds that were not challenged and received queratinase supplementation. Challenged birds presented higher score of ISI at 14 days. At 21 days, challenged birds supplemented with queratinase had higher intestinal inflammation. The results obtained in this study indicate that the benefits of exogenous queratinase are better in the initial phase of broilers. Key-words: globulins, intestinal inflammation, sanitary challenge

Orientadora : Profª. Drª. Aline de Marco Viott / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa: Palotina, 18/12/2017 / Inclui referências : f. 22-25 / Resumo: Bactérias do gênero Brachyspira podem ocasionar enfermidades entéricas em aves e a correta identificação se faz necessário tendo em vista que algumas espécies não são patogênicas. Devido à característica fastidiosa de crescimento e a sua importância na agroindústria comercial, técnicas de identificação rápidas e eficazes se fazem necessárias. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) para o diagnóstico de Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae e Brachyspira intermedia utilizando amostras de ceco de aves de postura comercial e matrizes comerciais fixadas em formol. Foram coletadas amostras de 112 aves com idade entre 35 e 82 semanas, sendo 42 oriundas de granjas de galinhas de postura comercial e 70 de granjas de matrizes de corte. Para avaliação primeiramente procedeu-se ao isolamento bacteriano a partir das fezes, técnica ouro para identificação do agente. As amostras positivas foram submetidas a qPCR para identificação de espécies patogênicas. Posteriormente, segmentos formolizados de ceco, dessas mesmas aves, foram processados pela técnica de FISH utilizando sondas marcadas de Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae e Brachyspira intermedia. A comparação dos dados encontrados foi realizada através do teste não paramétrico de qui-quadrado. Das 112 amostras foram obtidos 40 isolamentos característicos de Brachyspira e destes, no qPCR, 14 identificadas como B. hyodysenteriae e 7 como Brachyspira intermedia, 2 foram positivas para ambas e 21 não foram caracterizadas. Na FISH 52 amostras foram positivas para Brachyspira sp, 22 para B. hyodysenteriae, 28 para B. intermedia, 7 para B. pilosicoli e 8 amostras foram positivas para duas espécies. A avaliação estatística revelou que a técnica de FISH foi capaz de indicar maior número de aves positivos quando comparada ao isolamento bacteriano e a qPCR, inclusive revelando aves positivos para B. pilosicoli que não tinham sido identificados anteriormente. Dessa forma conclui-se que a FISH apresentou-se eficaz na identificação das Brachyspiras avaliadas servindo assim como uma ferramenta rápida e eficiente para o diagnóstico. Palavras-chave: Espiroquetose intestinal aviária. Hibridização fluorescente in situ. Brachyspira. / Abstract: Bacteria of the genus Brachyspira can cause enteric diseases in birds and its correct identification is necessary because some species are nonpathogenic. Due to the fastidious growth characteristic and importance of these bacteria in agroindustry, fast and effective identification techniques are required. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of the Fluorescent in situ Hybridization technique (FISH) for diagnosis of the Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae, and Brachyspira intermedia, using formalin-fixed samples from the cecum of laying hens and commercial matrices. Samples were collected from 112 animals with age from 35 to 82 weeks, being 42 from commercial farm laying hens and 70 from broiler matrices farm. Firstly, the bacterial isolation was made from feces, which is a gold technique for microorganism identification. The samples were submitted to qPCR for identification of pathogenic species. Subsequently, the cecal fragments fixed with formalin, from the same birds, were processed through FISH technique, using marked probes of Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae, and Brachyspira intermedia. A comparison of the obtained data was performed through chi-square non-parametric test. From the 112 samples, it was obtained 40 bacterial isolates characteristic of Brachyspira. From that, qPCR identified 14 as B. hyodysenteriae and seven as Brachyspira intermedia, two samples were positive for both and 21 were no characterized. In FISH, 52 samples were positive for Brachyspira sp., 22 for B. hyodysenteriae, 28 for B. intermedia, 7 for B. pilosicoli and eight samples were positive for two bacterial species. The statistical evaluation showed that using the FISH technique it was possible to identify a greater number of positive animals in comparison with bacterial isolation and qPCR, inclusive identifying positive animals for B. pilosicoli, which were not identified before. Therefore, it is concluded that the FISH technique is efficient for identification of the Brachyspira species evaluated in this study as well as is a fast and efficient tool for the diagnosis. Key-words: Fluorescent in situ hybridization. Avian intestinal spirochaetosis. Brachyspira.

Orientadora : Profª. Drª. Elisabete Takiuchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa: Palotina, 17/10/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Saúde animal / Resumo: Picobirnavírus (PBV) pertencem à família Picobirnaviridae, tendo como espécies tipo o Human picobirnavirus e Rabbit picobirnavirus. São pequenos vírus não envelopados, cujo genoma é constituído por dois segmentos genômicos de RNA dupla fita. diarreicasA patogenia e os mecanismos da infecção por PBV e sua associação a gastroenterites ainda não estão elucidados, atualmente são tidos como agentes emergentes e oportunistas e seu potencial zoonótico foi sugerido. As técnicas utilizadas para a identificação desses vírus são: eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e RT-PCR. A primeira permite diferenciar os PBV pelas diferenças de migração dos seus segmentos genômicos. Já na RT-PCR permitem sua diferenciação em genogrupo I ou II. Este estudo objetivou a detecção e a caracterização molecular de PBV em bovinos naturalmente infectados. Foram analisadas 289 amostras de fezes de bezerros com idade inferior a 60 dias de idade para a presença de PBV utilizando a técnica EGPA, após realizou a confirmação por RT-PCR para genogrupo I e sequenciamento. Foi detectada uma incidência de 8,3% (24/284) de PBV pela técnica EGPA, sendo que o perfil curto de migração foi o mais detectado (79,2%), o perfil longo foi encontrado em 20,8% das amostras, sendo o primeiro deste eletroferótipo descrito em bovinos. Das amostras positivas para PBV identificadas, 75% (18/24) eram representativas de animais com quadro clínico de diarreia, além de sete amostras (29,17%) apresentaram co-infecção por oocistos de Cryptosporidium spp. Pela técnica de RT-PCR, 15 amostras (62,5%) resultaram em amplificados de 201 pares de bases (bp), referente ao gene RdRp (segmento 2) e realizou-se o sequenciamento da primeira amostra de PBV bovino brasileira. A análise da matriz de identidade de nucleotídeos demonstrou que a amostra Bovine PBV18, denominada neste estudo, apresentou maior identidade (81%) com PBV detectado em peru (MD-2010/HM803965) e menor identidade (62,3%) com o protótipo PBV bovino RUBV-P detectado na Índia. Este trabalho apresenta a primeira obtenção de sequências de nucleotídeos de PBV de bovinos no continente americano e a primeira detecção de PBV perfil longo em bovinos. Palavras chaves: Picobirnavírus, Bovino, EGPA, RT-PCR / Abstract: Picobirnavirus (PBV) belongs to the Picobirnaviridae family, with Human picobirnavirus and Rabbit picobirnavirus as the type species. PBV are small non-enveloped viruses, whose genomes comprise two genomic segments of double-stranded RNA. The pathogenesis and infection mechanisms PBV and its association with gastroenteritis have not been elucidated. Currently, are considered emerging and opportunistic agents and their zoonotic potential was suggested. The techniques used for the identification of these viruses are: polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and RT-PCR. The first technique allows differentiating PBV by differences in migration of its genome segments. The RT-PCR allows their differentiation into genogroup I or II. This study aimed to detection and molecular characterization of PBV in naturally infected cattle. Two hundred eighty-nine (289) stool samples from calves under 60 days old were analyzed, looking for the presence of PBV using the PAGE technique. After this, the confirmation by RT-PCR for genogroup I and sequencing was performed. An incidence of 8.3% (24/284) of PBV was detected by PAGE technique, wherein the short migration profile was more detected (79.2%). The long profile was found in 20.8% of samples, being the first one electropherotyping was described in cattle, of which 75% (18/24) were representative of animals with clinical diarrhea. In addition, seven samples (29.17%) had co-infection with Cryptosporidium spp. By RT-PCR technique, 15 samples (62.5%) resulted in amplified 201 base pairs (bp), for the RdRp gene (segment 2) and carried out the sequencing of the first sample of Brazilian bovine PBV. The analysis of nucleotide identity matrix showed that the sample Bovine PBV18, named in this study, had higher identity (81%) with PBV detected in turkey (MD-2010 / HM803965) and less identity (62.3%) with the prototype bovine RUBV PBV-P detected in India. This work presents the first obtaining nucleotide sequencing of bovine PBV in the Americas and the first detection of long profile PBV in cattle. Key words: Picobirnavirus, bovine, PAGE, RT-PCR

Orientadora: Profª Drª Silvia Cristina Osaki / C-orientadora: Profª Drª Sheila Rezler Wosiacki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa: Palotina, 02/09/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Saúde animal / Resumo: A resistência antimicrobiana, condição ao qual um micro-organismo é capaz de sobreviver à exposição a um agente antimicrobiano, é um problema complexo que envolve várias espécies de bactérias, mecanismos de resistências, mecanismos de transferência e reservatórios. Em animais de companhia, os antimicrobianos são usados na prevenção e no tratamento de doenças infecciosas. O grande uso destes agentes, e muitas vezes de forma incorreta, na rotina veterinária tornam os cães e gatos uma potencial fonte de difusão de resistência antimicrobiana devido ao contato muito próximo desses animais com o homem, podendo levar à transmissão de bactérias multirresistentes e zoonóticas, além da transferência indireta de genes de resistência entre bactérias presentes na microbiota humana e animal. O objetivo deste estudo foi isolar e identificar estirpes bacterianas em amostras obtidas de infecções clínicas e cirúrgicas de cães e gatos na medicina veterinária, investigando a presença de características fenotípicas e genotípicas de resistência a drogas antimicrobianas. Foram realizados três estudos distintos. No primeiro, patógenos bacterianos de 77 infecções caninas foram isolados, identificados e avaliados fenotipicamente para resistência antibacteriana. Foi possível identificar 100 isolados bacterianos sendo 61 Gram positivoss, com 55 Staphylococcus spp., e 39 Gram negativos (36 fermentadores e três não fermentadores). 73 isolados foram considerados multirresistentes pela avaliação individual das drogas e 74 pela avaliação das classes. Apenas cinco isolados mostraram-se sensíveis a todas as drogas. Dois isolados foram resistentes a todas as classes, sendo isoladamente, sensíveis a alguns antimicrobianos. Das 55 amostras de Staphylococcus spp., 36 (65,45%) foram identificadas como MRS, fenotipicamente, 80,56% (29/36) indicam a presença do gene mecA, 5,56% (2/36) do gene mecC e 13,89% (5/36) como hiperprodutoras de beta-lactamase. Dois isolados de Enterococcus spp. foram considerados resistentes a vancomicina (VRE). 61,54% (24/39) das amostras foram positivas no teste presuntivo para detecção de ESBL. No segundo estudo foram avaliados 26 isolados bacterianos provenientes de 18 afecções oftálmicas de animais de companhia. Foram caracterizados 18 Staphylococcus spp., um Enterococcus spp., e sete Gram negativos (seis fermentadores e dois não fermentadores). Um total de 738 avaliações de drogas antimicrobianas foram realizadas, onde o percentual de drogas consideradas resistentes ou com resistência intermediária in vitro foi de 42,82% (n=316). Considerando as drogas antimicrobianas isoladas, 18 isolados mostraram-se multirresistentes, enquanto que pela avaliação da resistência às classes, 20 isolados foram considerados multirresistentes. A detecção fenotípica de MRS mostrou 61,11% (11/18) dos isolados de Staphylococcus spp. resistentes a meticilina, enquanto que a detecção genotípica, 38,89% (7/18) foram carreadores do gene mecA. Foram detectados isolados multirresistentes de MRS, MRS-MLSb e ESBL. No terceiro estudo, 80 isolados de Staphylococcus spp. coagulase positivos, identificados como S. pseudointermedius, foram avaliados pela disco-difusão com oxacilina e cefoxitina e amplificação por PCR de um fragmento do gene mecA, para caracterização de estirpes de MRS. 2285 avaliações de drogas antimicrobianas foram realizadas, onde 931 (40,74%) dos teste apresentaram resistência parcial ou total. Na detecção fenotípica de MRS, 58,75% (47/80) dos isolados apresentaram resistência à oxacilina e 53,75% (43/80) à cefoxitina. Na detecção genotípica, o gene mecA foi encontrado em 23 (28,75%) dos isolados. Avaliando-se a os isolados MRS e MSS, amostras mecA positivas e negativas com resistência a oxacilina e/ou cefoxitina, apresentaram tanto o MAR quanto o MCAR superiores aos isolados sensíveis a oxacilina/cefoxitina, sendo a detecção fenotípica mais sensível no quesito resistência múltipla a antimicrobianos ou classes. Os resultados para todos os antimicrobianos testados mostraram-se bastante homogêneo para amostras MRS detectadas de forma fenotípica, porém não para a detecção genotípica, no entanto, apesar da presença do gene, este pode não estar sendo expresso fenotipicamente. Os resultados do presente trabalho demonstram a necessidade do monitoramento constante do perfil de resistência bacteriana, que varia ao longo dos anos e difere de local para local. A realização de testes para identificação bacteriana e sua suscetibilidade podem auxiliar na seleção apropriada do agente antimicrobiano, mostrando-se essencial para a clínica médica e cirúrgica devido a altas taxas de resistência bacteriana verificadas, assim como o monitoramento da resistência local com o uso contínuo de determinadas drogas antimicrobianas. Palavras-chave: antibióticos, micro-organismos, multirresistência, susceptibilidade / Abstract: Antimicrobial resistance, a condition to which a microorganism is able to survive exposure to an antimicrobial agent, is a complex problem involving several species of bacteria, mechanisms of resistance, mechanisms of transfer and reservoirs. In companion animals, the antimicrobial agents are used in the prevention and treatment of infectious diseases. The widespread use of these agents, and often incorrectly, in veterinary routine make dogs and cats a potential source of spread of antimicrobial resistance due to the close contact of these animals with man, can lead to the transmission of multiresistant bacteria and zoonotic, addition to the indirect transfer of resistance genes between bacteria in human and animal microbiota. The aim of this study was to isolate and identify bacterial strains in samples obtained from clinical and surgical infections of dogs and cats in veterinary medicine, investigating the presence of phenotypic and genotypic characteristics of resistance to antimicrobial drugs. Three separate studies were conducted. In the first, 77 bacterial pathogens of canine infections were isolated, identified and evaluated phenotypically for antibacterial resistance. It was possible to identify 100 bacterial isolates whom 61 gram positive, with 55 Staphylococcus spp., and 39 gram negative (36 fermenters and three non-fermenters). 73 multiresistant isolates were considered by individual assessment of drugs and 74 of the evaluation of classes. Only five isolates were susceptible to all drugs. Two isolates were resistant to all classes, being alone, sensitive to some antibiotics. Of the 55 strains of Staphylococcus spp., 36 (65.45%) were identified as MRS, phenotypically, 80.56% (29/36) indicate the presence of the mecA gene, 5.56% (2/36) of the mecC gene and 13.89% (5/36) as a hyper-producing beta-lactamase. Two isolates of Enterococcus spp. were resistant to vancomycin (VRE). 61.54% (24/39) of samples were positive in the presumptive test for ESBL detection. In the second study evaluated 26 bacterial isolates from 18 ophthalmic diseases of pet animals. Were characterized 18 Staphylococcus spp., one Enterococcus spp., and seven gram negative (six fermenters and two non-fermenters). A total of 738 reviews of antimicrobial drugs were conducted where the percentage of drug found resistant or intermediately resistant strains in vitro was 42.82% (n = 316). Considering the isolated antimicrobial drugs, 18 isolates showed multiresistant, while the evaluation of resistance to classes, 20 isolates were considered multiresistant. Phenotypic detection of MRS showed 61.11% (11/18) isolates of Staphylococcus spp. methicillin-resistant, whereas the genotypic detection 38.89% (7/18) were carrying the mecA gene. multiresistant isolates were detected MRS, MRS and ESBL-MLSB. In the third study, 80 Staphylococcus spp. coagulase positive, identified as S. pseudintermedius were evaluated by disk diffusion oxacillin and cefoxitin and PCR amplification of a fragment of the mecA gene, for the characterization of strains MRS. 2285 reviews of antimicrobial drugs were conducted, where 931 (40.74%) of the test showed partial or total resistance. In phenotypic detection of MRS, 58.75% (47/80) of the isolates were resistant to oxacillin and 53.75% (43/80) to cefoxitin. In genotypic detection, the mecA gene was found in 23 (28.75%) isolates. Evaluating the MRS and the MSS isolated, positive and negative samples with resistance to oxacillin and / or cefoxitin mecA showed both the MAR and MCAR higher sensitive to oxacillin / cefoxitin isolated, being the most sensitive phenotypic detection in the question multiple resistance antimicrobials or classes. The results for all antibiotics tested were quite homogeneous samples to MRS detected phenotypic form but not for the genotypic detection, however, despite the presence of the gene, it might not being phenotypically expressed. The results of this study demonstrate the need for constant monitoring of bacterial resistance profile that varies over the years and differs from place to place. The testing for bacterial identification and susceptibility can assist in your selection of the appropriate antimicrobial agent, being essential for the medical and surgical due to high rates of bacterial resistance observed, as well as monitoring of local resistance to the continued use of certain antimicrobials. Keywords: antibiotics, micro-organisms, multidrug resistance, susceptibility

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