As cianobactérias são procariotos fotossintetizantes capazes de sobreviver em ambientes com condições adversas, inclusive na presença de metais pesados tal como o cádmio (Cd). Alguns mecanismos celulares de tolerância a metais pesados são o efluxo de íons e destoxificação intracelular. A proteína metalotioneína, a qual foi purificada e seqüenciada na cianobactéria Synechococcus sp. PCC7942, possui a capacidade de quelar alguns metais. A análise do produto gênico (RNAm e/ou proteínas) têm trazido informações interessantes sobre o metabolismo de células submetidas a situações estresse. Esse estudo teve como objetivo analisar as respostas das células da cianobactéria Synechococcus leopoliensis PCC7942 ao Cd. Para isto, foi analisado o padrão de crescimento das culturas, o acúmulo de Cd e a expressão de proteínas da cianobactéria na presença do metal. A concentração máxima de Cd tolerável pela cianobactéria de 3 µM foi determinada através do monitoramento do crescimento de culturas submetidas a diferentes concentrações do metal através da análise de DO750nm. As culturas crescidas nessa concentração do Cd apresentaram um prolongamento na fase de adaptação e maior tempo de duplicação comparando-se as culturas controles (sem metal). O cádmio acumulado pelas células analisado usando GFAAS apresentou valores variando entre 1,0 e 95 µg Cd•g-1 massa fresca, dependendo da fase de crescimento. A análise da especiação do Cd no meio de cultura BG-11 mostrou que havia disponível para as células 0,69 µM de Cd+2 quanto se utilizava a quantidade máxima tolerável (3 µM). A análise de expressão diferencial de proteínas foi feita em culturas expostas a duas concentrações do metal, 3 µM (tolerável) e 100 µM (letal), durante 1 hora, as quais mostraram acúmulo de 15 e 30 µg Cd•g-1 massa fresca, respectivamente. A maioria das proteínas da cianobactéria separadas por eletroforese bidimensional (pH 3-10 e 4,5-5,5) mostrou pontos isoelétricos ácidos, entre a faixa de pH 4 e 6, e a presença de várias isoformas. Trinta proteínas foram expressas diferencialmente, sendo que no tratamento com 3 µM de Cd, duas proteínas foram induzidas e 11 reprimidas, e no tratamento com 100 µM, duas proteínas foram induzidas e 20 reprimidas. Entre as proteínas reprimidas, duas foram comuns em ambos os tratamentos, enquanto que as duas proteínas induzidas em cada tratamento foram diferentes. Algumas dessas proteínas identificadas através de MALDI-TOF foram a rubisco, a qual foi reprimida em 3 µM de Cd; uma proteína da capa do carboxissoma, a qual foi induzida na presença de 100 µM de Cd; a proteína ligadora a DNA (Dpsa) e a isoleucil t-RNA sintetase, ambas induzidas em 3 µM de Cd e reprimidas em 100 µM de Cd. Dessa forma, esses dados mostraram que duas das proteínas afetadas pelo Cd são componentes do sistema fotossintetizante (rubisco e capa protéica do carboxissoma), uma é expressa em condições de estresse oxidativo (Dpsa) e a outra está relacionada com a síntese de proteínas contendo isoleucina (isoleucil-tRNA sintetase). / Cyanobacteria are photosynthetic prokaryotes capable of surviving in adverse environmental conditions, including the presence of heavy metals such as cadmium (Cd). Some cellular mechanisms of heavy metal tolerance are ion efflux and intracellular detoxification. The metallothionein protein, which was purified and sequenced in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942, possesses the ability to bind some metals. The analysis of gene products (mRNA and/or proteins) has provided interesting information about cell metabolism under stress conditions. The aim of this study was to analyze the Cd response of the cyanobacterium S. leooliensis PCC7942 cells. For this purpose, the pattern of culture growth, cadmium accumulation, and cyanobacterial protein expression in the presence of the metal was analyzed. The maximum tolerable Cd concentration of 3 µM by the cyanobacterium was determined by monitoring culture growth submitted to different concentrations of the metal using OD750nm analysis. The cultures grown in this Cd concentration had an extended lag phase and a higher doubling time compared to the control cultures (without metal). Cadmium accumulated by the cells analyzed using GFAAS showed values varying between 1.0 and 95 µg Cd•g-1 fresh matter, depending on the growth phase. Speciation analysis of Cd in the growth medium BG-11 showed that 0.69 µM of Cd2+ was available to the cells when the maximum tolerable amount was used (3 µM). Analysis of the proteins with differential expression was done using cultures exposed for 1 hour to two metal concentrations, 3 µM (non-lethal) and 100 µM (lethal), which showed accumulation of 15 and 30 µg Cd•g-1 fresh matter, respectively. The majority of the cyanobacterial proteins separated by two-dimensional electrophoresis (pH 3-10 and 4,5-5,5) showed pI between pH 4 and 6, and the presence of several isoforms. Thirty proteins were differentially expressed, where two proteins were up-regulated and 11 down-regulated in the treatment with 3 µM of Cd and two proteins were up-regulated and 20 down-regulated in the treatment with100 µM of Cd. Among the down-regulated proteins, two were common in both treatments while the two up-regulated proteins from each treatment were different. Some of the proteins identified by MALDI-TOF were rubisco, which was down-regulated in 3 µM of Cd; a carboxysome shell protein, which was up-regulated in100 µM of Cd; the DNA-binding protein, Dpsa, and a isoleucyl-tRNA sinthetase, both up-regulated in 3 µM of Cd and down-regulated in100 µM of Cd. Thus, these data showed that the two proteins affected by Cd are components of the photosynthetic system (rubisco and carboxysome shell protein), one is expressed under oxidative stress condition (Dpsa) and the other one is related to protein synthesis containing isoleucine (isoleucyl-tRNA sinthetase).

O uso intensificado de combustíveis fósseis como fonte de energia, vê-se a necessidade do desenvolvimento de novas tecnologias, principalmente as renováveis, como o hidrogênio, que possui vantagens por ser elemento abundante no universo, ser renovável e não poluente. A utilização de microalgas e cianobactérias é uma alternativa para a produção de biohidrogênio a partir da quebra da água e de compostos orgânicos. De acordo com isso, nesta pesquisa foram testados diversos fatores físico-químicos e nutricionais nas condições de cultivo de cepas de Chlamydomonas spp. e Anabaena spp. Para tanto, cepas selecionadas foram cultivadas em duas fases experimentais, a primeira aeróbia e a segunda anaeróbia, para proporcionar produção de hidrogênio por biofotólise direta anaeróbia, via hidrogenase, sob privação de enxofre para a clorofícea, e de nitrogênio para a cianobactéria, estimulando para esta também a produção por biofotólise indireta, via nitrogenase. A cepa com melhor produtividade de hidrogênio, de cada gênero, foi selecionada para a etapa de otimização das fases experimentais de cultivo. Durante os ensaios foram realizadas análises de produção máxima, velocidade de produção, volume e produtividade de hidrogênio, além de análises de concentração de biomassa, físico-químicas, bioquímicas e geração de subprodutos. O método utilizado foi eficiente para produção de hidrogênio e ficou comprovada a diferença de produção de hidrogênio entre diferentes cepas. Anabaena sp. obteve produtividade média de hidrogênio quatro vezes maior, aproximadamente de 76,8 µmol.L-1.h-1, comparada a C. reinhardtii, com média de 18,6 µmol.L-1.h-1. / The intensifying use of fossil fuels as energy source, one sees the need to develop new technologies, especially renewable, such as hydrogen. This has advantages because hydrogen is an abundant element in the universe, be renewable and non-polluting. The use of microalgae and cyanobacteria is an alternative for the production of bio-hydrogen of breaking water and organic compounds. Accordingly, in this study were tested several physic-chemical factors and nutrition in growing conditions of Chlamydomonas spp. and Anabaena spp. strains. For this purpose, strains selected were cultured in two experimental phases, first aerobic and second anaerobic, to hydrogen production by direct biofotolise anaerobic, via hydrogenase, under sulfur deprived to chlorofycea, and nitrogen to cyanobacterium, for this also to production by indirect biofotolise, via nitrogenase. The strain with highest productivity of hydrogen, of each gender, was selected for the optimization of the experimental stages of cultivation. During the tests were analyzes of maximum production, velocity, volume and productivity of hydrogen, and analysis of biomass concentration, physic-chemical, biochemical and generation of by-products. The method used was efficient for the production of hydrogen and was different between strains. Anabaena sp. obtained average yield four times highest, approximately 76.8 µmol. L-1.h-1compared to C. reinhardtii, averaging 18.6 µmol. L-1.h-1.

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii vem se destacando na literatura atual devido à sua presença e dominância em lagos e reservatórios em diversas regiões do planeta e a principal preocupação deste cenário é por ela ser potencialmente tóxica. Estudos revelaram que o crescimento e a síntese de toxinas em espécies de microrganismos fitoplanctônicos estão atrelados à limitação ou excesso de micronutrientes, porém, ainda são desconhecidos os efeitos desta variação na produção de saxitoxina (STX) por C. raciborskii. Para contribuir com o esclarecimento desta questão, investigou-se o efeito de diferentes concentrações dos micronutrientes Fe, Zn, Cu, Mn, Co e B no crescimento e na produção de STX de uma linhagem de C. raciborskii. Em salas climatizadas, culturas desta linhagem foram expostas durante 20 dias a 5 concentrações de cada micronutriente, com alteração do meio de cultura ASM-1. As respostas fisiológicas de C. racibosrkii a estas modificações foram verificadas através da velocidade máxima de crescimento (μmáx), rendimento do biovolume, tempo de duplicação (Td), concentração de clorofila a, assimilação de nitrato e ortofosfato e síntese de STX total (intra e extracelular). As maiores concentrações de STX por biovolume (STX/biovolume) foram obtidas nos tratamentos com baixa concentração de Fe (0,4 μM) e elevada concentração de Cu (0,8 μM). Nos micronutrientes Zn, Co e B, houve uma tendência de redução da síntese de STX nas maiores concentrações destes metais. Enquanto as concentrações extremas de Fe e Mn inibiram o crescimento (Fe: 0,4 e 400 μM e Mn: 0,7 e 600 μM), as concentrações centrais favoreceram (Fe: 4 a 60 μM e Mn: 7 a 200 μM). Elevada concentração de Cu (0,8 μM) causou aumento de 2,6 vezes (160%) do volume celular e redução na síntese de clorofila a, sem alterações significativas em μmáx e rendimento. O aumento da concentração dos micronutrientes Fe, Zn, Mn e B no meio de cultura causaram maior assimilação de ortofosfato por biovolume (P/biovolume). Estes principais resultados demonstraram que os micronutrientes afetam a síntese de STX e o crescimento de C. raciborskii, podendo ser associados aos diversos mecanismos de captura e detoxificação de metais que as cianobactérias possuem. Embora as extrapolações dos resultados laboratoriais para o ambiente devam ser realizadas com prudência, estudos relacionados à ecofisiologia de cianobactérias como este, são fundamentais para análise criteriosa de cada variável podendo ser utilizado como ferramenta de diagnóstico e prevenção de florações tóxicas. / Cylindrospermopsis raciborskii has been highlighted in several researches due to the dominance in many lakes and reservoirs around the world, the main concern about it due to the ability to produce toxins. Studies have revealed that growth and toxins production in phytoplankton species are linked to micronutrients limitation or excess. Nevertheless, micronutrient variation effects on saxitoxin (STX) production by C. raciborskii are still unknown. To contribute to clarify this issue, we investigated the effect of different micronutrients concentration, such as Fe, Zn, Cu, Mn, Co and B, on the growth and saxitoxin production of C. raciborskii strain. In climatized growth room, the cultures of C. raciborskii strain were exposed to 5 different concentration of each micronutrient, present in ASM-1 medium, during 20 days. The C. racibosrkii physiological responses was detected through maximum growth rate (μmáx), biovolume yield, doubling time (Td), chlorophyll-a, nitrate and orthophosphate assimilation and the total STX production (intra and extracellular). The higher concentrations of STX per biovolume (STX/biovolume) were observed in treatments with low Fe concentration (0.4 μM) and high Cu concentrations (0.8 μM). Higher concentrations of Zn, Co and B lead to low STX production. While the Fe and Mn extreme concentrations inhibited the growth (Fe: 0.4 and 400 μM and Mn: 0.7 to 600 μM), the central concentrations favored (Fe: 4 to 60 μM, and Mn: 7-200 μM). A high Cu concentration (0,8 μM) leads to 2,6 fold increase (160%) in cellular volume and decrease the chlorophyll-a content, however máx and biovolume yield did not change. Increasing the Fe, Zn, Mn and B concentration in the culture caused higher assimilation of orthophosphate per biovolume (P/biovolume). These results indicated that micronutrients affected C. raciborskii growth and STX production, and may be associated with the diverse cyanobacterial mechanisms of metals capture and detoxification. Cyanobacteria ecophysiology studies, as this research, are fundamental to careful analysis of each variable, which could be used as diagnostic and a tool to prevention of toxic blooms.

Orientador: Marcos Pereira Marinho Aidar / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manarin_EwertonCaltran_M.pdf: 9106258 bytes, checksum: d63841eee1497eafd2cd46024a281569 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Este trabalho avaliou a fixação biológica de nitrogênio (FBN) por leguminosas e cianobactérias de vida livre na Floresta Ombrófila Densa Atlântica. Nódulos radiculares de leguminosas presentes em parcelas de 1 hectare foram amostrados para as fisionomias de Floresta Ombrófila Densa de Terras Baixas (FTB) e na Floresta Ombrófila Densa Montana (FM), localizadas em diferentes altitudes. A atividade da enzima nitrogenase dos nódulos foi avaliada através da atividade de redução de acetileno. FTB apresentaram a maior quantidade de nódulos e maior atividade da enzima nitrogenase em relação à FM. A taxa anual de FBN pelas leguminosas foi estimada em 2,06 kg N ha-1 e 0,230 kg N ha-1 para FTB e FM, respectivamente. A FBN apresentou os maiores valores no outono e os menores no inverno para a FTB. E maiores valores no outono e primavera para a FM. Seis estirpes de rizóbios isolados da floresta estudada tiveram sua capacidade de nodulação testada em experimento de casa de vegetação com a leguminosa Inga sessilis, que apresentou capacidade de se associar formando nódulos com cincos isolados da floresta, e com mais quatro isolados usados como controle, se mostrando uma leguminosa com baixa especificidade com seu simbionte. Cianobactérias de vida livre tiveram a FBN medidas em trechos intactos e trechos antropizados na FM. Estes organismos foram encontrados na superfície de solos e rochas em áreas expostas ao sol e sob a forma de colônias de Nostoc sp e de crostas, associadas com outros organismos. As medidas de FBN foram feitas através do ensaio de redução de acetileno em consórcio com técnicas isotópicas. As formas coloniais apresentaram maior atividade de FBN que as formas crostosas, e em ambas, a atividade foi maior no inverno que no verão. A FBN foi maior para trechos antropizados, 127 e 48 g N m-2 ano-1 para coloniais e crostosas, respectivamente e de 46 e 30 g N m-2 ano-1 para coloniais e crostosas de locais intactos, respectivamente. As FBN por leguminosas e cianobactérias para as áreas intactas de floresta se mostraram baixas, mas estão de acordo com o esperado para florestas maduras. Estes organismos provavelmente aumentam suas as taxas de FBN quando a floresta sofre distúrbio, assim como foi detectado para as cianobactérias em trechos antropizados / Abstract: This study evaluated rates of biological nitrogen fixation (BNF) by legumes and free-living cyanobacteria in Atlantic Rainforest. Legume root nodules found in 1 hectare plots were sampled for the Lowland physiognomy (LP) and Mountain physiognomy (MP), located at different altitudes. The nitrogenase enzyme activity of nodules was assessed by acetylene reduction assay. LP had the highest number of nodules and greater activity of the nitrogenase regarding MP. The annual rate of BNF by legumes was estimated at 2.06 kg N ha-1 and 0.230 kg N ha-1 for LP and MP, respectively. The BNF had the highest values in autumn and lowest in winter for LP. And higher values in autumn and spring for MP. Six strains of rhizobia isolated from the studied forest had their nodulation capacity tested in a greenhouse experiment with the legume Inga sessilis, which showed ability to form nodules with five strains, and with over four isolates used as controls, showing that this legume specie has a low specificity with its symbiote. Free-living cyanobacteria had BNF measured in intact and anthropized sites of the MP. These organisms were found in surface soils and rocks in areas exposed to the sun and in the form of colonies of Nostoc sp and crusts associated with other organisms. The measurements were made using acetylene reduction assay in consortium with isotopic techniques. Colonial forms showed higher activity than crust forms, and for both, the activity was higher in winter in comparison to summer. The BNF was higher for anthropized sites of the forest, 127 and 48 g N m-2 year-1 for colonial and crusted, respectively, and for intact sites, 46 and 30 g N m-2 year-1 for colonial and crusted, respectively. BNF by legumes and cyanobacteria in intact forest were low, but are consistent with expected for mature forests. These organisms probably increase their rates of BNF in disturbed conditions of the forest as well as detected for cyanobacteria in anthropized sites / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

O Reservatório de Itupararanga, no interior do estado de São Paulo, tem como principal finalidade geração de energia elétrica e o abastecimento público, além de área de lazer e pesca. O crescimento urbano e agrícola em torno do corpo hídrico tem alterado a qualidade da água favorecendo a proliferação de cianobactérias. Estudos preliminares da comunidade fitoplanctônica demonstraram a dominância da cianofícea Cylindrospermopsis raciborskii e da clorofícea Monoraphidium contortum. Com o objetivo de investigar o nível trófico do reservatório e sua influência na dominância destas espécies, foram realizados ensaios de interação entre estes microrganismos sob diferentes concentrações de fósforo, simulando o reservatório em três diferentes níveis tróficos: oligotrófico, mesotrófico e supereutrófico. Também foi determinada a produção de saxitoxina pela cianobactéria. No ambiente oligotrófico a C. raciborskii apresentou diminuição do volume celular, aumento da produção de saxitoxina e senescência em interação com o M. contortum. Nos ambientes mesotrófico e supereutrófico, a cianobactéria não apresentou diferenças no crescimento e na produção de saxitoxina, comparado ao seu controle, quando em interação com a clorofícea. O mesmo não foi observado para M. contortum nestes dois níveis de trofia, pois teve seu crescimento prejudicado nas interações com C. raciborskii. As velocidades específicas de crescimento de M. contortum foram crescentes conforme o aumento da trofia, e as da C. raciborskii decrescentes. As concentrações de clorofila-a também foram crescentes conforme o aumento de trofia, e diminuíram no final dos experimentos. O consumo de ortofosfato foi semelhante na simulação dos três ambientes e o consumo do nitrato, foi maior quanto mais elevado o nível trófico. A partir dos resultados, foram feitas previsões das espécies fitoplanctônicas dominantes regidas pelo nível trófico do reservatório, que contribuirão nas medidas de conservação e manejo deste ecossistema aquático. / The Reservoir Itupararanga within the state of São Paulo, whose main purpose is public supply, besides electricity generation, and recreational areas and fishing. The urban growth and agriculture around the water body has changed its quality, favoring the growth of cyanobacteria. Preliminary studies of phytoplankton showed a dominance of cyanophyceae Cylindrospermopsis raciborskii and clorofícea Monoraphidium contortum. In order to investigate the trophic level of the reservoir and its influence on the dominance of these species, tests of the interaction between these microorganisms under different phosphorus concentrations were performed, simulating the reservoir in three different trophic levels: oligotrophic, mesotrophic and supereutrophic. The production of saxitoxin by the cyanobacteria was also defined. In the oligotrophic C. raciborskii showed a decrease of cell volume, increased production of saxitoxin and senescence in interaction with M. contortum. In mesotrophic and supereutrofic environments, the cyanobacteria did not show differences in growth and production of saxitoxin, compared to their control when interacting with the chlorophycea. The same was not observed for M. contortum in these two trophic levels, as its growth was affected by the interactions with C. raciborskii. The specific growth rates of M. contortum were growing with increasing trophic, and those of C. raciborskii decreasing. The chlorophyll-a concentrations were also growing with increasing trophic, and decreased at the end of the experiments. The orthophosphate consumption was similar in the three simulation environments and consumption of nitrate was greater the higher the trophic level. From the results, were made estimates of the dominant phytoplankton species was governed by the trophic level of the reservoir, which will help in the conservation and management of this aquatic ecosystem.

Fischerella é um gênero cianobacteriano de ocorrência em diversos ambientes subaerofíticos que apresenta importância ecológica, evolutiva, biogeoquímica, biotecnológica e ecotoxicológica. O estudo de seu genoma pode levar a uma melhor compreensão de seu metabolismo secundário e de sua capacidade de produção de cianotoxinas e outras moléculas bioativas. A linhagem Fischerella CENA161, isolada de uma nascente de água na região de Piracicaba, foi identificada como produtora do peptídeo hepatotóxico microcistina. Este foi o primeiro relato da produção dessa toxina por esse gênero de cianobactéria. Dessa maneira, este trabalho teve como objetivo sequenciar o genoma da cianobactéria Fischerella CENA161 e realizar sua montagem e a anotação de genes envolvidos com seu metabolismo secundário. Para isso, a linhagem foi tratada com hipoclorito de sódio para remover as bactérias heterotróficas, com posterior esgotamento de pequenos fragmentos em placa de cultura sólida, de forma a isolar a linhagem. Foi realizada a extração de ácido desoxirribonucleico das células tratadas da CENA161 cultivadas em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido BG-110. Uma biblioteca genômica foi construída para o sequenciamento MiSeq e, então, foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. A anotação de genes foi realizada utilizando a ferramenta antiSMASH, para a predição de metabólitos secundários, e também foi realizado o alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra o genoma da CENA161, utilizando a ferramenta BLASTN. As moléculas bioativas produzidas pela linhagem foram investigadas através de bioensaios contra bactérias e fungo, e utilizando cromatografia líquida de alta pressão e espectrometria de massas. Os resultados mostraram que a linhagem CENA161 possui, em seu genoma, o agrupamento gênico de biossíntese da microcistina, apresentando os 10 genes descritos primeiramente (mcyA-mcyJ), e alta identidade de suas sequências com as sequências da linhagem Fischerella sp. PCC 9339, embora sua sintenia gênica esteja mais próxima à da linhagem Nostoc sp. 152. Ainda, foram anotados os agrupamentos gênicos de biossíntese de ambiguina (amb), apresentando 25 genes do total de 32 genes descritos para a linhagem Fischerella sp. UTEX 1903, com identidade mínima de 98 % entre as sequências nucleotídicas. Foram encontrados, também, seis genes do total de oito que formam o agrupamento de biossíntese de nostopeptolida (nos), descrito para Nostoc sp. GSV224, e com sintenia diferenciada para a linhagem CENA161. As análises químicas de espectrometria de massas mostraram a produção de sete variantes de microcistina (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MC-LAba e [D-Asp3]Mc-LL), essas duas últimas raramente descritas pela literatura. Os bioensaios mostraram bioatividade dos extratos intracelular polar e apolar contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris e Candida albicans. A coleta das frações do extrato apolar por cromatografia líquida revelou bioatividade em três diferentes tempos de aquisição. As frações coletadas do extrato polar evidenciaram o pico de microcistina, constatada a partir da linhagem CENA161 axênica, inclusive. Nossos resultados revelaram a presença de agrupamentos gênicos de síntese de moléculas bioativas e a habilidade da linhagem Fischerella sp. CENA161 em produzir diferentes substâncias bioativas, sintetizadas pela via ribossomal e não ribossomal, em condições axênicas. / Fischerella is a cyanobacterial genus that occurs in several subaerophytic environments and presents ecological, evolutive, biogeochemical, biotechnologic and ecotoxicologic importance. The study of the genome can leads to the better compreension about its metabolism and its ability to produce cyanotoxins and other bioactive molecules. The Fischerella sp. strain CENA161 was isolated from a spring water in Piracicaba, and it was identified microcystin peptide hepatotoxic producer. That was the first report about the production of the toxin by this cyanobacterial genus. The aim of this study was to sequence the genome of the cyanobacteria Fischerella sp. strain CENA161 and perform the assembly and annotation of the genes involved in its secondary metabolism. For this, the strain was previously treated with 0,5 % sodium hypochlorite to remove the heterothrophic bacteria, followed with exhaustion from the short filaments in Petri plates, searching isolate the strain. The deoxirribonucleic acid was extracted from the CENA161 cells cultivated in Erlenmeyers with BG-110 liquid media. The genomic library was performed by MiSeq sequencing, and the ab initio assembly was performed with the reads obtained from the sequencing. The gene annotation and prediction were performed with the antiSMASH tool, for the secondary metabolites screening, and the nucleotides sequences alignment was performed using known genes present in other cyanobacteria producers and the CENA161 genome, using the BLASTN tool. The bioactive compounds produced by the strain were investigated with bioassays against bacteria and fungi, and also using high performance liquid chromatography with mass spectrometry. The results revealed the Fischerella sp. strain CENA161 presents the microcystins gene cluster in its genome, with the ten genes that were described in the first time (mcyA-mcyJ), and showed high identity in your sequences with the Fischerella sp. PCC 9339 sequences, although the synteny is very close to Nostoc sp. strain 152 microcystin gene cluster. We also found the ambiguine gene cluster (amb), that showed 25 genes out of 32 genes of total from the Fischerella sp. strain UTEX 1903, with high identity (98 %) among the nucleotide sequences. We found six genes out of eight that compose the nostopeptolide gene cluster (nos) described for Nostoc sp. strain GSV224, but presenting differentiated synteny for the CENA161. The chemical analyses by mass spectrometry showed the production of seven microcystin variants (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MCLAba and [D-Asp3]Mc-LL), the last two ones being rarely described by literature. The bioassays showed bioactivity from the polar and nonpolar intracellular extracts against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris and Candida albicans. The collect of the peaks from the nonpolar extract in HPLC revealed bioactivity in three different acquisition times. The peaks collected from the polar extract did not show bioactivity, but the running in HPLC showed the peak corresponding to microcystin, produced by axenic CENA161 strain. Our results revealed the presence of some gene clusters involved in the bioactive molecules synthesis and the ability for the Fischerella sp. strain CENA161 to produce different bioactive compounds, synthesized by ribosomal and nonribosomal pathway, in non-axenic and axenic condictions.

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O presente estudo objetivou analisar o perfil de resistência da Phormidium sp. em diferentes concentrações de arsenato de sódio. A cianobactéria foi inoculada em tubos contendo 4 mL de meio BG-11 líquido e diferentes concentrações de arsenato (5, 10, 30, 50, 100, 130, 150, 200 e 250 mM) e sem a presença do metaloide (controle) e cultivadas durante 20 dias a 25ºC, sem agitação e com fotoperíodo de 12/12 horas de luz/escuro. A toxicidade do arsenato para Phormidium sp. foi caracterizada pela inibição do crescimento, sendo este determinado pela concentração de clorofila a. Todas as condições foram realizadas em triplicatas. A determinação do arsênio total presente nas amostras foi obtida através da técnica de espectrometria de emissão óptica com plasma induzido, do Instituto Evandro Chagas. A resistência de Phormidium sp. ao arsenato foi observada em até 50 mM do composto (p>0,05). À partir de 100 mM de arsenato foi observada inibição do crescimento cianobacteriano (p<0,05). As análises da dosagem de arsênio total no meio de cultura mostram que, durante os primeiros dias de experimento, a concentração de arsênio no meio de cultura foi reduzido, seguido de um aumento gradativo na concentração deste metaloide. Provavelmente, esta cianobacteria pode acumular o arsênio e posteriormente excretar este metaloide para o meio extracelular. Os resultados obtidos indicam a capacidade que a cianobactéria Phormidium sp. possui de crescer em meio contendo altas concentrações de arsênio. No entanto, outras análises se tornam fundamental para elucidar as vias metabólicas envolvidas durante o processo de resistência a este metaloide. / Environmental contamination by arsenic has been increasing in recent years, either through natural or anthropogenic sources, which can cause greater exposure of humans to this toxic compound. Several studies have been developed to analyze the capacity of cyanobacterial species in bioremediation. The filamentous cyanobacterium Phormidium sp. excels due to well developed mechanisms to adapt to different environmental conditions. The present study aimed to analyze the resistance profile of Phormidium sp. at different concentrations of sodium arsenate. The cyanobacterium was inoculated in tubes containing 4 ml of BG-11 liquid medium and different concentrations of arsenate (5, 10, 30, 50, 100, 130, 150, 200 and 250 mM) without the presence of metalloid (control) and cultured for 20 days at 25 ° C without agitation and with a photoperiod of 12/12 h light / dark. The toxicity of arsenate to Phormidium sp. has been characterized by growth inhibition being determined by the concentration of chlorophyll a. All conditions were performed in triplicate. The determination of total arsenic in the samples was obtained using the technique of optical emission spectrometry with inductively coupled plasma, the Instituto Evandro Chagas. The resistance of Phormidium sp. to arsenate was observed up to 50 mM of compound (p>0.05). Growth inhibition was observed above 100mM of arsenate (p<0.05). The analyzes of the total dose of arsenic in the culture medium showed that during the first day of experiment, the concentration of arsenic in the culture medium was lowered, followed by a gradual increase in the concentration of this metalloid. Probably, this cyanobacteria can accumulate arsenic and later excrete this metalloid to the extracellular medium. The results indicate the ability of the cyanobacterium Phormidium sp. has to grow in medium containing high concentrations of arsenic. However, other analyzes become fundamental for elucidating the metabolic pathways involved in the process of resistance to this metalloid.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-12-06T18:22:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseCrescimentoPerfil.pdf: 950043 bytes, checksum: 957110d7532999cebe823348eca5c684 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-12-16T13:55:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseCrescimentoPerfil.pdf: 950043 bytes, checksum: 957110d7532999cebe823348eca5c684 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-16T13:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseCrescimentoPerfil.pdf: 950043 bytes, checksum: 957110d7532999cebe823348eca5c684 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / O arsênio é um metalóide tóxico que se tornou um problema de saúde pública em todo o mundo. Como forma de reduzir a contaminação ambiental por este metalóide, a qual é proveniente de atividades antropogênicas e naturais, a utilização de microorganismos em processos de biorremediação se tem mostrado uma estratégia promissora. A cianobactéria filamentosa homocitada, Geitlerinema unigranulatum UFV-E01, pertencente à ordem Pseudanabaenales, foi isolada de um ambiente contaminado por arsênio, sugerindo uma habilidade em lidar com o efeito tóxico deste metalóide. Com vista nisso, o presente trabalho objetivou caracterizar a resistência ao arsenato de sódio e quantificar o arsênio total extracelular da cianobactéria G. unigranulatum UFV-E01. As análises de resistência ao arsenato de sódio revelaram que a cianobactéria foi capaz de crescer em até 50 mM por 20 dias. Além disso, a cianobactéria G. unigranulatum UFV-E01 acumulou arsenato de sódio por 10 dias, reduzindo em até 67% o arsênio extracelular. Pelos dados obtidos neste estudo, a cianobactéria G. unigranulatum UFV-E01 foi capaz de resistir a altas concentrações de arsenato de sódio, no entanto outras análises, como a caracterização das vias metabólicas envolvidas no processo de resistência, devem ser realizadas para considerar sua aplicação em ambientes impactados por arsênio. / Arsenic is a toxic metalloid that has become a public health problem worldwide. In order to reduce the environmental contamination by this metalloid, which is derived from natural and anthropogenic activities, the use of micro-organisms in bioremediation process has shown to be a promising strategy. A filamentous homocitada cyanobacterium belonging to the order Pseudanabaenales, Geitlerinema unigranulatum UFV-E01, was isolated from an environment contaminated by arsenic, suggesting an ability to deal with the toxic effect of this metalloid. In view of this, this study aimed to characterize the resistance to sodium arsenate and quantify the total arsenic extracellular cyanobacterium G. unigranulatum UFV-E01. Analyses of sodium arsenate resistance showed that the cyanobacterium was able to grow in 50 mM for 20 days. Furthermore, the cyanobacterium G. unigranulatum UFV-E01 accumulated sodium arsenate for 10 days, reducing up to 67% arsenic extracellular. From the data obtained in this study, the cyanobacterium G. unigranulatum UFV-E01 was able to withstand high concentrations of sodium arsenate, although other analysis, the characterization of the metabolic pathways involved in the resistance must be taken to consider their use in environments impacted by arsenic.

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Georgette Cristina Salvador Lazaro.pdf: 2041914 bytes, checksum: a92cd3028e6d390006dee3ef94c44369 (MD5) Previous issue date: 2012-06-25 / A presente pesquisa teve como objetivo simular e avaliar os impactos de variáveis ambientais (ferro e UV-C) sobre o crescimento e produção de MCY de M. aeruginosa (NPLJ-4). Para tanto, tal cepa foi cultivada sob condições controladas. No ensaio do ferro, não houve diferença significativa de densidade, biovolume e clorofila-a entre as diferentes concentrações de ferro, enquanto que taxa de crescimento, tempo de duplicação e concentração de toxina apresentaram tal diferença. Foram observadas mais divisões celulares (G) a uma menor taxa nas culturas com maior teor de Fe, causando aumento de densidade e biomassa (vice-versa). As divisões reduziram-se a uma taxa maior até que o Fe ficasse escasso (10, 4, 1 e 0,5 &#956;M, respectivamente). Culturas com 0,5 &#956;M registraram: maior taxa, menor tempo de duplicação, menor densidade e biovolume. Quanto a toxina, células da fase log (6º ao 14º dia) e estacionária (16º ao 35º dia) influenciaram nos altos valores de MCY-LR total das culturas com Fe. Os teores aumentaram do 10º para o 20º dia e caíram no 30º dia nas culturas com 4 e 10 &#956;M Fe. Ademais, o tratamento com 1 &#956;M Fe obteve maior densidade, biovolume, picos de maior área e maiores concentrações de MCY-LR total em relação as culturas com 0,5, 4, e 10 &#956;M Fe, respectivamente. Assim, o crescimento de MA nem sempre está atrelado aos maiores níveis de Fe e uma única célula pode ser responsável por produção de grande quantidade de toxina. Já no experimento de simulação de exposição à radiação UV-C, obteve-se remoção completa da MCY-LR total em meio ASM-1 com floração de M. aeruginosa, sendo que mais que 50% da toxina foi degradada nas 2 primeiras horas de exposição. Os valores de MCY-LR total, densidade, biovolume e clorofila-a declinaram à medida que o tempo de exposição à UV-C aumentava. Ademais, não ocorreu produção de microcistina LA e RR em nenhum dos experimentos / This research aimed to simulate and evaluate the impact of environmental variables (iron and UV-C) on M. aeruginosa (NPLJ-4) growth and MCY production. This strain was cultivated under controlled conditions. The iron assay did not show significant difference of cell density, biovolume and chlorophyll-a between different iron concentrations, while the growth rate, duplication time and toxin concentration showed that difference. More cell divisions (G) were observed with a lower rate at highest iron content cultures, inducing a cell density and biomass increase. The cell divisions were reduced to a lower rate until the iron become scarce (10, 4, 1 e 0.5 &#956;M, respectively). 0.5 &#956;M cultures registered higher growth rate and lower duplication time, cell density and biovolume. Log (6th to 14th day) and stationary (16th to 35th day) phase influenced the high total MCY-LR values of iron cultures. MCY-LR content increased from 10th to 20th day and reduced in 30th day in the 4 and 10 &#956;M iron cultures. 1 &#956;M iron treatment showed higher cell density, biovolume, biggest area peaks and total MCY-LR concentrations in comparison with 0.5, 4 and 10 &#956;M cultures, respectively. Thus, M. aeruginosa growth is not always related to high iron levels and one cell, alone, can be responsible for the production of high toxin content. On the other hand, in the UV-C radiation exposure simulation experiment, complete total MCY-LR remotion was reached in ASM-1 medium with M. aeruginosa bloom, with more than 50% of the toxin degraded at the two initial hours of exposure. The total MCY-LR, cell density, biovolume and chlorophyll-a reduced as the UV-C exposure time increased. Finally, did not occurred MCY-LA and MCY-RR production in the experiments

Este trabalho teve como propósito investigar a cinética de floculação de água bruta com baixa turbidez, utilizando o sulfato de alumínio (Al2(SO4)3o18H2O) e o cloreto férrico (FeCl3o6H2O) como coagulantes. Os resultados experimentais foram obtidos em ensaios de \"jar test\". A água bruta utilizada nos ensaios foi preparada em laboratório, simulando um manancial superficial eutrofizado contendo células da cianobactéria Microcystis aeruginosa. Foram testadas 5 dosagens distintas de cada coagulante, 3 valores de G, 2 valores de TAS e 12 tempos de floculação. Utilizou-se a turbidez como medida principal de avaliação dos resultados experimentais. O valor de turbidez inicial (N0) foi corrigido, levando-se em consideração o acréscimo de turbidez em função das dosagens de coagulante. Determinou-se que as dosagens mais efetivas, em termos de remoção de turbidez, foram 20 mg.L-1 para o sulfato de alumínio e 40 mg.L-1 para o cloreto férrico (ambas expressas como massa de coagulante). Para ambos os coagulantes, constatou-se que G = 20 s-1 e TAS = 27 m3.m-2.dia-1 resultaram nas melhores eficiências de remoção de turbidez. Verificou-se também a variação do potencial zeta em função das dosagens de coagulante. Observou-se que o aumento da dosagem de coagulante leva à redução do potencial zeta, aproximando-o do ponto isoelétrico. Porém, o ponto isoelétrico não necessariamente coincide com a melhor eficiência em termos de remoção de turbidez. Com base nos resultados experimentais, foi proposta uma modificação ao modelo clássico da cinética de floculação de suspensões coloidais. Nesta, foi incluso um segundo termo referente à ruptura de flocos (quebra irreversível). O ajuste do modelo proposto foi obtido através de procedimentos de iteração numérica computacional com a função \"Solver\" do programa Microsoft Excel®. Foram calculados os valores das constantes KA, KB e KC do modelo proposto. Amostras do lodo gerado nos ensaios de cinética de floculação foram caracterizadas visualmente através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). / The purpose of this work was to investigate flocculation kinetics of low-turbidity raw water, using aluminum sulfate (Al2(SO4)3o18H2O) and ferric chloride (FeCl3o6H2O) as coagulants. Experimental results were obtained in jar tests. Raw water used in the jar tests was prepared in laboratory, simulating a eutrophic natural water source containing cells of the cyanobacteria Microcystis aeruginosa. 5 different coagulant doses were tested for each coagulant, 3 G values, 2 SLR values and 12 flocculation times. Turbidity was selected as the major parameter for experimental results analysis. Initial turbidity values (N0) were corrected taking into account turbidity increase due to coagulant dosing. In terms of turbidity removal, it was determined that the most effective dosage for aluminum sulfate was 20 mg.L-1, and for ferric chloride, 40 mg.L-1 (both expressed as coagulant mass). For both coagulants, it was found that G = 20 s-1 and SLR = 27 m3.m-2.day-1 resulted in the best turbidity removal efficiencies. Zeta potential variation, due to coagulant dosing, was also verified. It was noted that increasing coagulant dosing led to zeta potential reduction, bringing it closer to the isoelectric point. However, the isoelectric point does not necessary coincides with the best turbidity removal efficiency. Based on the experimental results, it was proposed a modification to the classic colloidal suspension flocculation kinetics model. In this modification, a second term regarding floc rupture (irreversible breakage) was included. Through computer numeric iteration using Microsoft Excel®\'s \"Solver\" function, the proposed model adjustment was obtained. Kinetics constants KA, KB e KC values, from the proposed model, were calculated. Sludge samples, generated during flocculation kinetics tests, were visually characterized through scanning electronic microscopy (SEM).