El ATP es una molécula ampliamente conocida por su papel en muchas funciones como la homeostasis celular, el mantenimiento de gradientes iónicos, el mantenimiento del pH en gránulos secretores, el almacenamiento energético, regulador de la interacción actina-miosina, etc. Además, el ATP puede actuar como molécula señalizadora a través de los receptores purinérgicos P2. De receptores P2 hay de dos tipos, los P2X, que son ionotrópicos, y los P2Y que son metabotrópicos. Los primeros son una familia de canales iónicos permeables a cationes que se abren cuando se les une el ATP. Los segundos son receptores acoplados a proteínas G, y la unión del ATP desencadena diferentes reacciones metabólicas. Ambos tipos de receptores se han relacionado con diferentes patologías.

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Estrés oxidativo e inflamación parecen jugar un papel importante en el proceso de envejecimiento relacionado con la disfunción del sistema cardiovascular humano. Hábitos de vida tales como fumar, consumo de alcohol y ejercicio físico, pueden alterar el estado redox de los tejidos y afectar la relación de los marcadores de estrés oxidativo con la edad. Se requiere Información sobre el estado oxidativo de las poblaciones humanas para verificar la función de daño oxidativo en el envejecimiento y los cambios relacionados con el sistema cardiovascular, con el fin de identificar cuáles son los factores de riesgo cardiovascular más influyentes en el daño oxidativo asociado al envejecimiento y el papel de la dieta y el estilo de vida en esta relación. Este estudio se realizó en una población de 160 personas sanas o con patología leve tratada y compensada, distribuidos uniformemente en un rango de edad de 16 a 84 años. Lo datos recogidos de cada paciente fueron; antropométricos, bioquímica general, personales, dietéticos y se determinó la concentración de variables relacionadas con el estrés oxidativo, inflamación y/o riesgo cardiovascular: Mieloperoxidasa (MPO), Homocisteina, Proteína C Reactiva (PCR) ultrasensible y Malondialdehido (MDA). Resultados. La edad se correlaciona con numerosos marcadores de riesgo cardiovascular aunque no lo hace con los de estrés oxidativo. La PCR, la MPO y el MDA se correlacionan positivamente con los triglicéridos. El MDA se correlaciona con el colesterol; la PCR con el Índice Aterogénico; el IMC y la circunferencia de cintura resultaron las variables que más influyen sobre la concentración de triglicéridos e Índice aterogénico. El MDA se correlaciona positivamente con la edad en individuos menores de 65 años. El consumo de frutas y verduras se asociaría negativamente al MDA en una regresión múltiple incluyendo solo individuos de 40 a 65 años. Los resultados de este estudio indican que las variables lipídicas son las que mejor se correlacionan con el estrés oxidativo. El IMC y la circunferencia de cintura se han comportado como las variables más influyentes sobre los valores de lipídicos. Los hábitos dietéticos relacionados con el consumo de frutas y verduras ayudan a disminuir la concentración de MDA que tiende a incrementarse con la edad en individuos de 40 a 65 años en nuestra población. / Oxidative stress and inflammation appear to play an important role in the process of ageing and in the associated dysfunction of the human cardiovascular system. Lifestyle habits such as smoking, alcohol consummation, physical exercises, might alter the redox state of body tissues and affect the relationship of oxidative stress markers with age. Information about the oxidative status of human populations is required to verify the role of oxidative damage in the ageing related changes of the cardiovascular system, and to identify what are the most influential cardiovascular risk factors on the oxidative damage associated to ageing and the influence of lifestyle in this relation. This study was conducted in a population of 160 healthy individuals or with mild disease treated and compensated, in an evenly distributed range of age of age 16 to 84 years. General biochemical, anthropometric data, personal, dietary supplements and determining the concentration of variables related to oxidative stress and / or cardiovascular risk: Myeloperoxidase (MPO), Homocysteine, ultrasensitive C-reactive protein (CRP) and Malondialdehyde (MDA) was collected of each patient. Information about individual lifestyle patterns were also collected. Interactions between variables were assessed by correlation (Pearson or Spearman) and multiple regression analyses. Results. There were not gender differences in the variables of oxidative stress and inflammation assessed in this study. hsCRP was significantly associated with age, Framingham index, waist circumference, body mass index, blood glucose and plasma triglycerides. MDA plasma concentration was related to the values of cholesterol and triglycerides blood levels. MPO was associated with the plasma concentration of triglycerides and the atherogenic index. BMI and waist circumference are variables with more influence in the concentration of triglycerides and atherogenic index. The MDA was positively correlated with age in individuals younger than 65 years. The consumption of fruits and vegetables were negatively associated with MDA in a multiple regression including only individuals from 40 to 65 years. These results indicate that plasma concentrations of triglycerides and total cholesterol positively associate with oxidative stress and inflammation in a general human population. In addition, due to the body mass index appears to be the most influential factor on the lipid plasma levels, it may be a good marker of this association. Eating habits associated with the consumption of fruits and vegetables help reduce the concentration of MDA, which tends to increase with age in individuals 40 to 65 years in our population.

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Targeted protein degradation plays a central role in eukaryotic cell regulation and homeostasis. The ubiquitin proteasome system (UPS) is involved in a large number of cellular events, being, day by day, more difficult to find pathways without links with the system. Proteins are marked for degradation by ubiquitin ligases that append polyubiquitin signals, which can recruit the targeted protein to the 26S proteasome for degradation. In the process, polyubiquitin chains appended to the target protein are disassembled into free monoubiquitin for subsequent rounds of substrate tagging by means of deubiquitinating enzymes. Rpn10 is a proteasome receptor that recognizes the Lys48-linked polyubiquitin degradation signal by means of a ubiquitin-interacting motif (UIM). Mutation of the UIM domain of Rpn10 significantly ablates the proteolytic capacity of the proteasome. Rpn10 also contains a Von Willebrand factor A (VWA) domain which is responsible of Rpn10 interactions inside the proteasome. Rpn10 is in equilibrium with a pool of free protein so that it functions as both, a receptor at the proteasome, and an extraproteasomal adaptor. In the present work, we have shown that Rpn10 is monoubiquitinated (Rpn10-mUb) in vivo and that Rpn10-mUb is found in both proteasomal and non-proteasomal pools. Levels of Rpn10-mUb are regulated in vivo by Rps5, a NEDD4 ubiquitin-ligase protein family, and Ubp2, a deubiquitinating enzyme. Our observations link for first time monoubiquitin signal with proteasome regulation. Monoubiquitination strongly inhibits Rpn10 to interact with ubiquitin conjugates by a specific interaction in cis between Rpn10 UIM domain and the linked monoubiquitin. By means of genetic and proteomics tools we found that four sites of Rpn10 sequence are subjected to monoubiquitination by Rsp5 (Lys71, Lys84, Lys99 and Lys268), but Lys84 within its VWA domain is the preferred one. Ubiquitination of Rpn10 inhibits its ability to bind polyubiquitinated substrates, thus functioning as mechanism of inactivation of this receptor. Interestingly, our findings suggest that Rpn10 monoubiquitination could decrease proteasome activity. The UIM of Rpn10 also strongly interacts with the ubiquitin-like domain (Ubl) of Dsk2, a polyubiquitin-binding protein. Furthermore, extraproteasomal Rpn10 plays a critical role in filtering Dsk2 and its substrates from the proteasome. We evaluated the affinity of several forms of Rpn10-mUb to Dsk2 and found that Ub-UIM interaction in cis of Rpn10-mUb impairs the binding of Dsk2 in trans. These results suggest that in an extraproteasomal context, Rpn10 monoubiquitination could regulate the Dsk2-Rpn10 interaction. Notably, the proteasomal pool of Rpn10-mUb is suppressed under perturbations that promote the proteolytic pathway, such as stress by temperature and oxidative stress, whereas the extraproteasomal pool remains fairly constant. To assess whether the distinct behavior of the Rpn10-mUb pools correlated with the modification of different lysine residues of Rpn10, we set up assays of absolute quantification of the two major ubiquitination sites, Lys84 and Lys268, by mass spectrometry (AQUA). The obtained results clearly indicate that Lys84 is the main target of Rsp5 ligase in both pools of Rpn10, enhancing the role of the VWA domain in Rpn10 ubiquitination. Finally, we have combined ubiquitin remnant profiling with quantitative proteomic approaches to identify ubiquitinated species that are increased in RPN10-RAD23 deletion, under standard growth conditions and cold-shock stress. Enriched conjugates have been distributed across different biological functions being proteins involved in RNA processing and transport metabolism accounting for the biggest fractions. Further molecular biology approaches and informatic analysis are required to address which proteins are likely to be true UPS substrates as opposed to proteins regulated by ubiquitination in a non-proteolytic manner. Overall, our results provide a novel evidence of involvement of monoubiquitin signals in the regulation of the availability of substrates to bind proteasomal surfaces. Considering that substrate binding is the first event in the multicatalytic process promoted by the proteasome, the control of the accessibility of proteasome receptors is a crucial level of proteasome regulation. Thus, if the NEDD4 enzyme catalyzed monoubiquitination of Rpn10 inhibits proteasome activity, the control of this reaction could be an interesting target. Classical proteasome inhibitors, such as Bortezomib, which target the proteolytic activity of the core particle of the proteasome, are used as anticancer drugs. We propose that Rpn10 monoubiquitination could be considered as a new target in cancer research. / La degradació de proteïnes juga un rol essencial en la regulació i homeostasi de les cèl•lules eucariotes. Les proteïnes són marcades per a la seva degradació per ubicuitina lligases les quals annexen cadenes de poliubicuitina enviant de manera específica la proteïna al 26S proteasoma on serà degradada. Rpn10 és un receptor del proteasoma que reconeix cadenes d’ubicuitina a través del seu motiu UIM (ubiquitin-interacting motif). Rpn10 també conté un domini VWA el qual és responsable de les interaccions de Rpn10 en el seu context proteasomal. Rpn10 també es troba en equilibri amb una fracció no proteasomal. En el present treball hem demostrat que Rpn10 està monoubicuitinat (Rpn10-mUb) in vivo i que aquesta modificació es troba en ambdues fraccions proteasomal i extraproteasomal. Els nivells de Rpn10-mUb estan regulats in vivo per Rsp5, una ubicuitina lligasa de la família de les NEDD4, i Ubp2, una deubicuitinasa. Mitjançant mètodes genètics i de proteòmica es van trobar quatre lisines modificades per ubicuitina en la seqüència de Rpn10 (Lys71, Lys84, Lys99 and Lys268) éssent la Lys84 la diana preferent de Rsp5. La monoubicuitinació inhibeix la capacitat de Rpn10 d’unir substrats poliubicuitinats i en, conseqüència, és un mecanisme d’innactivació d’aquest receptor. També s’ha trobat que Rpn10-mUb disminuiex l’activitat del proteasoma. Els nostres resultats relacionen per primera vegada la monoubicuitinació amb la regulació del proteasoma, procés que imita la droga Bortezomib. Es proposa que Rpn10-mUb podria considerar-se com a nova diana en la teràpia contra el càncer.

BACKGROUND: Spinal muscular atrophy (SMA) is a neuromuscular disease characterized by degeneration and loss of spinal cord motor neurons leading to denervation and muscular atrophy. It is caused by defects in the Survival Motor Neuron 1 gene (SMN1) and it is classified by age of onset and motor milestones into three main types which strongly correlate with the copy number of its homologous gene, SMN2. SMN2 expresses markedly less full‐length protein than SMN1, provoking disease manifestations. The essential neuropathological feature in SMA is motor neuron death. Previous studies in SMA foetal samples showed early pathological changes in spinal cord suggesting that the disease is a developmental disorder. Studies in mouse SMA models support that neuromuscular junctions (NMJs) may play a significant role in the disease, although this implication has not yet been addressed in humans. AIMS AND METHODOLOGIES: To better understand the mechanisms of SMA disease, a comprehensive histologic, immunohistochemical and ultrastructural analysis of the muscle and neuromuscular junctions in prenatal and postnatal SMA samples was carried out. To further correlate neuropathological findings with early developmental manifestations of the disease, foetal motility between 11‐14 gestational weeks was recorded and analyzed by 2D ultrasound in pregnancies predicted to develop SMA. RESULTS: At 12 weeks, most SMA myotubes were smaller than controls, indicating a delay in muscle maturation. At this stage, the presence of early acetylcholine receptor (AChR) clusters in developing SMA muscles suggested that pre‐patterned and nerve‐independent AChR clustering would not be affected by the disease. However, as development proceeded in the following weeks, early degeneration of nerve terminals was present associated with a dispersion of AChRs and abnormal preterminal accumulation of vesicles. These findings pointed towards a defect in maintenance of the initial innervation in developmental SMA muscle. Furthermore, postnatal muscle of type I SMA patients showed persistence of the foetal subunit of acetylcholine receptors, suggesting a continuous delay in maturation of neuromuscular junctions. Therefore, if nerve terminals are unable to efficiently maintain functional NMJs, a dying‐back process leading to motor neuron degeneration and loss may appear, with the consequent increase in programmed cell death. Despite all these early neuropathological findings, we did not observe qualitative differences in foetal movements between unaffected and SMA prenatal cases. The synaptic defects in SMA at this stage of development, therefore, might be compensated by several mechanisms. During perinatal and postnatal periods compensation would no longer be present, resulting in the drastic SMA pathology and clinical manifestations. CONCLUSIONS: These developmental studies open new possibilities to improve our knowledge of presymptomatic SMA stages. Early therapeutic strategies should be investigated to reverse the process of denervation, maintain activity of the NMJ, and improve maturity of the motor endplates. / INTRODUCCIÓN: La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad neuromuscular infantil caracterizada por la muerte de las neuronas motoras del asta anterior de la médula espinal. Como consecuencia de ello hay una degeneración y atrofia muscular, por lo que los pacientes mueren a menudo de insuficiencias respiratorias graves. La AME se clasifica en tres tipos principales según el grado de gravedad, la edad de aparición y las pautas motoras. Se trata de una enfermedad con patrón de herencia autosómico recesivo causada por ausencia o mutaciones en el gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1). Existe un gen homólogo, SMN2, que está presente en todos los pacientes aunque a diferencia del SMN1, produce mucha menor proteína SMN completa y, por lo tanto, no evita la aparición de la enfermedad. Sin embargo se ha demostrado una importante correlación con el tipo de AME y el número de copias de SMN2. El rasgo patológico esencial de la AME es la muerte de las neuronas motoras. Estudios hechos en muestras fetales indican que ya existen hallazgos patológicos en el estadio prenatal lo que sugiere que la AME sería un trastorno del desarrollo. Además en modelos de ratón AME se ha determinado que la unión neuromuscular tendría un papel importante en la patogenia de la enfermedad aunque en humanos todavía no existen investigaciones al respecto. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA: Con el fin de profundizar en los conocimientos de la patogenia de la AME, en esta tesis se ha realizado un análisis histológico, inmunohistoquímico y utraestructural del músculo y la unión neuromuscular en muestras prenatales y postnatales de controles y AME. Paralelamente, se han correlacionado los resultados neuropatológicos obtenidos con el estudio de la motilidad fetal por ecografía 2D entre las 11 y 14 semanas de gestación en embarazos diagnosticados genéticamente como AME. RESULTADOS: A partir de las 12 semanas, los miotubos AME son más pequeños que los controles lo que es compatible con un retraso en la maduración muscular. En esta etapa, la presencia de receptores de acetilcolina agrupados en músculo AME sugiere que éste es capaz de formar la placa neuromuscular. Sin embargo en semanas posteriores se observa una degeneración temprana de los terminales nerviosos asociados a una dispersión de los receptores de acetilcolina y acumulación anormal de vesículas presinápticas. Esto indica que en este período uno de los principales defectos sería la falta de mantenimiento de la unión neuromuscular. El músculo postnatal AME muestra persistencia de la expresión del receptor fetal de acetilcolina que refuerza la idea de una maduración retardada de la unión neuromuscular que persiste durante todo el desarrollo. La falta de mantenimiento de las uniones neuromusculares justificaría el inicio de un proceso de muerte retrograda (“dying back process”) dando lugar a una excesiva pérdida de neuronas motoras en la médula espinal. El estudio de los movimientos fetales, sin embargo, no demostró diferencias cualitativas entre los fetos normales y los AME. La falta de correlación entre la neuropatología descubierta en los fetos con AME tipo I y la presencia de movimientos fetales normales en ese mismo grupo indica que deben existir mecanismos compensatorios en el feto AME que enmascaran las posibles consecuencias funcionales de los defectos sinápticos hallados. Estos mecanismos compensatorios desaparecerían más tarde dando lugar a las graves manifestaciones de la enfermedad en las etapas perinatal y neonatal. CONCLUSIONES: Los resultados obtenidos contribuyen al mejor conocimiento de esta enfermedad en etapas presintomáticas, y abre nuevas perspectivas para investigar estrategias terapéuticas a fin de revertir los procesos de denervación, mantener la actividad de las uniones neuromusculares y mejorar la maduración de las placas motoras.