Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-30Bitstream added on 2014-08-13T18:01:30Z : No. of bitstreams: 1 000747006.pdf: 3768762 bytes, checksum: 6cb20d492a096743121ca347a299f63e (MD5) / Este trabalho está centrado no desenvolvimento, caracterização e utilização de uma superfície composta por monocamada auto-organizada (self assembled monolayer – SAM) de L-cisteína, funcionalizada com a enzima metalo-β-lactamase (MβL). A função designada a este sensor foi de detecção da velocidade da cinética enzimática, em tempo real, da reação da penicilinase com seu substrato, um antibiótico β-lactâmico, por técnica piezelétrica, microbalança a cristal de quartzo (QCM), e por técnicas eletroquímicas. As curvas de progresso foram obtidas pela variação da frequência no cristal de quartzo, demonstrando a cinética em tempo real. Não foram obtidas curvas com perfil hiperbólico, como esperado pelo modelo de Michaelis-Menten, por ambas as técnicas devido às baixas concentrações de substrato utilizadas nas análises. Foram obtidos gráficos com padrões lineares e a partir deles foi possível calcular a constante de Michaelis-Menten ( ). A obtida a partir da técnica eletroquímica mostrou-se mais próxima ao valor fornecido pelo fabricante da enzima. No entanto, pela técnica piezelétrica a foi maior, refletindo em perda de sensibilidade da enzima pelo substrato. / The aim of this study was to develop, characterize, and apply the functionalized tranducer imobilized with metalo-β-lactamase (MβL) enzyme using appropriate procedures based on L-cysteine self-assembling monolayer-SAM. The enzymatic activity of MBL under β-lactam antibiotic was measured, on real time, by piezoeletric quartz crystal microbalance (QCM) and eletrochemical techniques. The progress curves were obtained by varying the frequency of quartz crystal. The hyperbolic pattern corresponding to the pattern set on the model of the Michaelis-Menten was not obtained due to low concentration of substrate. On the other side, linear graphic was obtained and the Km was calculated. The Km obtained from electrochemical analyses showed a value similar to manufacturer’s instructions of fabricant, and the Km obtained by QCM showed higher, reflecting the lost of sensibility.

Orientador: Ethel Lourenzi Barbosa Novelli / Banca: Ana Catarina Cataneo / Banca: Ana Angélica Fernandes / Banca: Rodrigo Cardoso de Oliveira / Banca: Ana Carolina Magalhães / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo determinar os efeitos da suplementação nutricional de azeite de oliva extra-virgem e seus fenóis, oleuropeína e ácido caféico, sobre os parâmetros morfométricos, calorimétricos e estresse oxidativo no músculo cardíaco de ratos normais e obesos. Para tanto, foram utilizados 48 ratos, Wistar, 180,52 ± 21,05g, divididos inicialmente em 2 grupos. O grupo P (n=24) foi mantido com ração padrão e água ad libitum e o grupo H (n=24) foi mantido com ração rica em colesterol e sacarose e água ad libitum. Após 21 dias de tratamento os dois grupos foram divididos em 4 subgrupos cada (n=6): (C) considerados controles, mantidos com as respectivas dietas P, ou H e sem suplementação; (AO) receberam respectivamente ração P ou H e suplementação nutricional com azeite de oliva extra-virgem (Colavita, Itália) (3mL/Kg/dia); (O) receberam ração P ou H, respectivamente e suplementação nutricional com oleuropeína (Genay, France) (0,023mg/Kg/dia); (AC) receberam respectivamente ração P ou H e suplementação nutricional com ácido caféico (Sigma, USA) (2,66mg/Kg/dia). O experimento teve duração de 43 dias. Ingestão de ração hipercalórica induziu obesidade. A análise calorimétrica permitiu sugerir que os efeitos da suplementação nutricional com azeite de oliva foram similares à suplementação com ácido cafeico, tanto o azeite de oliva como o ácido cafeico induziram elevação na oxidação de lipídios, independentemente da dieta utilizada. Administração de azeite de oliva e oleuropeína apresentaram atividade antioxidante evidenciada pela elevação nas substâncias antioxidantes totais e redução nas concentrações de hidroperóxido de lipídio, no tecido cardíaco de animais mantidos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not Available / Doutor

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-22T18:55:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225985.pdf: 2489469 bytes, checksum: f9317609185391153b21ab5ba854dc83 (MD5) / Os ésteres são importantes compostos orgânicos, utilizados em diversos setores industriais como petroquímica, alimentos, cosméticos, tintas e vernizes, entre outros. Uma grande aplicação deles está relacionada à sua utilização como aromas. Quando sintetizados utilizando enzimas como catalisador podem ser considerados aromas naturais, aumentando seu valor no mercado. Nesse trabalho estudou-se a obtenção do éster alifático (aroma) octanoato do n-pentila por esterificação direta utilizando enzima Lipozyme TL IM como catalisador. Foi verificada a influência da concentração inicial dos reagentes (0,1 a 0,95 mol.L-1) na velocidade inicial da reação em função da temperatura de síntese (30, 40 e 50 ºC). A velocidade inicial da reação foi determinada através do consumo de ácido octanóico ao longo do tempo. A concentração de ácido foi determinada por titulação ácido-base com solução alcoólica de KOH e o éster caracterizado por FTIR. Modelos cinéticos encontrados na literatura foram ajustados aos dados experimentais. Os resultados obtidos demonstram que a enzima sofre inibição em concentrações iniciais de substrato acima de 0,65 mol.L-1, para qualquer valor de temperatura utilizada. A velocidade máxima atingida pela reação possui valores aproximados de 0,0067, 0,0092 e 0,0080mol.L-1.min-1 para 30, 40 e 50ºC, respectivamente. O modelo proposto por Wu e colaboradores se adaptou bem ao comportamento reação. Os parâmetros Ki= 0,738 0,032 mol.L-1e n= 17,11 1,83 mostraram ser independentes da temperatura. O parâmetro Vm mostrou ser afetado pelo efeito da temperatura, apresentando valores de 0,0163 (30 ºC), 0,0298 (40ºC) e 0,0155(50ºC)mol.L-1.min-1. Para o parâmetro Ks ele variou de maneira dependente a Vmax atingindo valores de 0,969, 1,473 e 0,702 mol.L-1 para as temperaturas de 30, 40 e 50ºC respectivamente. A enzima pode ser reutilizada por aproximadamente 6, 16 e 26 vezes para as temperaturas de 50, 40 e 30ºC, respectivamente. A maior quantidade de éster produzida pode ser obtida à temperatura de 30ºC (0,057 mol) para bateladas de 10 mL com concentração inicial dos reagentes igual a 0,65 mol.L-1.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-19Bitstream added on 2014-06-13T20:03:22Z : No. of bitstreams: 1 ebaid_gmx_dr_botfm.pdf: 1264184 bytes, checksum: daa1de14991327d1b14b47a86e0084da (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve por objetivo determinar os efeitos da suplementação nutricional de azeite de oliva extra-virgem e seus fenóis, oleuropeína e ácido caféico, sobre os parâmetros morfométricos, calorimétricos e estresse oxidativo no músculo cardíaco de ratos normais e obesos. Para tanto, foram utilizados 48 ratos, Wistar, 180,52 ± 21,05g, divididos inicialmente em 2 grupos. O grupo P (n=24) foi mantido com ração padrão e água ad libitum e o grupo H (n=24) foi mantido com ração rica em colesterol e sacarose e água ad libitum. Após 21 dias de tratamento os dois grupos foram divididos em 4 subgrupos cada (n=6): (C) considerados controles, mantidos com as respectivas dietas P, ou H e sem suplementação; (AO) receberam respectivamente ração P ou H e suplementação nutricional com azeite de oliva extra-virgem (Colavita, Itália) (3mL/Kg/dia); (O) receberam ração P ou H, respectivamente e suplementação nutricional com oleuropeína (Genay, France) (0,023mg/Kg/dia); (AC) receberam respectivamente ração P ou H e suplementação nutricional com ácido caféico (Sigma, USA) (2,66mg/Kg/dia). O experimento teve duração de 43 dias. Ingestão de ração hipercalórica induziu obesidade. A análise calorimétrica permitiu sugerir que os efeitos da suplementação nutricional com azeite de oliva foram similares à suplementação com ácido cafeico, tanto o azeite de oliva como o ácido cafeico induziram elevação na oxidação de lipídios, independentemente da dieta utilizada. Administração de azeite de oliva e oleuropeína apresentaram atividade antioxidante evidenciada pela elevação nas substâncias antioxidantes totais e redução nas concentrações de hidroperóxido de lipídio, no tecido cardíaco de animais mantidos... / Not Available

Orientador: Delia B. Rodriguez-Amaya / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-29T04:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_JoseEmilsonMacedo_M.pdf: 16621138 bytes, checksum: bbff18306296b33b7d015bd14dff0edd (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Dada a grande importância dos carotenóides como corantes naturais e como substâncias bioativas que reduzem os riscos de doenças degenerativas, a preservação destes compostos nos alimentos é de suma importância. Isto, no entanto, representa um grande desafio, por se tratar de moléculas com cadeias poliênicas suscetíveis à isomerização e oxidação. O estudo da cinética de degradação de 'alfa'-caroteno, 'beta'-caroteno, luteína e licopeno em sistemas modelos de baixa umidade (amido de milho, fécula de batata e celulose microcristalina) e aquoso, à temperatura ambiente, na presença da luz e no escuro, demonstrou predominância do modelo cinético de primeira ordem. O licopeno foi o carotenóide que mais degradou nos sistemas modelos de baixa umidade, na presença de luz e no escuro, com os maiores valores das constantes de velocidade de degradação (k) .eos menores tempos de meia-vida (tl/2). A luteína apresentou comportamento variável, sendo mais estável em fécula de batata no escuro e menos estável em meio aquoso, tanto na presença como na ausência da luz. O licopeno isolado de três fontes naturais (goiaba vermelha, melancia e tomate) em sistema de fécula de batata seguiu um modelo cinético de primeira ordem ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_MariaAngelica_M.pdf: 9143256 bytes, checksum: aa14d687161f89068c82024fdc8fdc9c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Quatro isoformas APl, AP2Al, AP2A2 e AP2B da fosfatase ácida (E.C. 3.1.3.2.) de fígado de cação (Rhizoprionodon lalandei) foram detectadas e parcialmente purificadas através de bath em Hidroxiapatita, cromatografias em colunas de SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S200 e Concanavalina A-Sepharose 4B. As isoformas AP2Al, AP2A2 e AP2B foram parcialmente purificadas cerca de 68_ 57 e 34 vezes, com atividades específicas de 5,6_ 4,7 e 2,8 !lmol min-l . mg-l respectivamente. Neste estágio de purificação, estas isoformas mostraram-se altamente instáveis. A isoforma APl foi parcialmente purificada cerca 20 vezes, com atividade específica de 1,66 !lmol min-1. mg-l. A massa molecular relativa da isoforma APl, determinada por HPLC da Shimadzu (coluna Shim pack diol 150), foi de 58 kDa. Esta isoforma mostrou-se mais estável que as isoformas AP2. As propriedades cinéticas da fração APl foram estudadas. A enzima apresentou alta atividade em pH 4,7 - 5,0_ a temperatura ótima obtida foi de 65°C. A hidrólise a 37°C e pH 5,0 foi linear até 45 minutos e a energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pela equação de Arrhenius, foi de 39,37 kJ.mor1. Um valor da Km de 0,97 mM foi obtido utilizando-se pnitrofenilfosfato como substrato. Dentre os substratos testados, a isoforma API apresentou maior especificidade pelo PPi. Utilizando-se pNPP como substrato vários compostos foram testados como potenciais inibidores. Molibdato (O,lmM) e NaF (5mM) inibiram 100%, pCMB (lmM) e NaF (1mM) inibiram cerca de 80%, o-vanadato (0,1 mM) e tartarato (5mM) , cerca de 500/0. Baseado no estudo de inibidores a isoforma APl da fosfatase ácida de cação apresenta características mais similares as fosfatases ácidas de Imamíferos de alta massa molecular / Abstract: Four isoforms API, AP2AI, AP2A2 and AP2B of acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2.) were detected and partially purified from shark (Rhizoprionodon Ia/andei) liver through bath Hydroxyapatite, cromatography columns of SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S-200 and Concanavalin A-Sepharose 4B.The fractions AP2AI, AP2A2 and AP2B were purified 68.3; 57.3 and 34.2-fold, with specific activities of 5.6; 4.7 and 2.8 Jlmol min-1.mg-l respectively. The fraction APl was partially purified 20-fold, with specific activity of 1,66 Jlmol min-1.mg-l. The relative molecular mass ofthis fraction, determined by HPLC (Shim pack diol 150 column), was 58 kDa. At this stage of purification the fraction APl has shown to be more stable than the isoforms AP2. The kinetic properties of the API fraction were determined using pnitrophenyl phosphate (pNPP) as substrate. High activities were observed at pH around 4.7 - 5.0, and temperature of 65° C, at temperature of 37°C, pH 5.0 the hidrolysis was linear up to 45 minutes. The activation energy value of 39,37 kJ.mor1 for the hidrólysis ofpNPP, was calculated from the Arrhenius equation. An apparent Km value of 0.97 mM was determined for pNPP. From the substrates tested, inorganic pyrophosphate was the best substrate, whit a 5-fold lower Km and 2-fold higher specificity constant, when compared with pNPP. Several compounds were tested as potential inhibitors, with pNPP as substrate. Molybdate (O.lmM) and fluoride (5mM) inhibited 100%; p-CMB (lmM) and NaF (ImM) inhibited about 80%, and o-vanadate (0.1 mM) and tartrate (5mM), about 50%. Based on inhibitors studies the API isoform of acid phosphatase purified from shark liver presents more similar characteristics the fosfatases acid of mammals of high molecular mass / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Everson Alves Miranda, Gustavo Paim Valença / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T16:31:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HaberPerez_Victor_D.pdf: 3235735 bytes, checksum: c84db1347546f8cb4db20cc0b7e2df85 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A conversão enzimática de substratos gasosos constitui um avanço recente na engenharia de bioprocessos. Estes sistemas apresentam importantes vantagens quando comparados com os sistemas líquidos (aquosos ou em fase orgânica), as quais incluem condições de transferência de massa mais favoráveis, possibilidade de reciclo do biocatalisador e uma recuperação mais simples dos produtos, entre outras. Algumas das aplicações potencias da biocatálise em fase gasosa incluem a destoxificação de correntes gasosas, o desenvolvimento de biossensores e a síntese de diversos produtos orgânicos incluindo fármacos, fragrâncias e aromas para a indústria de cosméticos e de alimentos. Este trabalho apresenta, os resultados experimentais do estudo cinético da reação de esterificação e hidrólise de acetato de etila em fase gasosa catalisada por dois biocatalisadores: a) Lipase PS (Amano, Japão) imobilizada em suportes de óxidos puros e mistos de Si/Mg com tamanhos de poros controlados e b) Lipozyme IM (Novo Nordisk, Dinamarca). O sistema experimental, operando continuamente em regime diferencial, é constituído por três blocos: 1) bloco de preparação dos substratos, onde é usado He como gás de arraste que gera correntes gasosas em equilíbrio com as fases líquidas; 2) bloco de reação, formado por um reator tubular de vidro; e 3) bloco de aquisição de dados, constituído por um cromatógrafo a gás e um computador, conectados em linha. Variações na quantidade de biocatalisador não mostraram a existência de limitações por transferência de massa para as mesmas condições de reação. Desta forma, a cinética da reação foi estudada em função da concentração de acetato de etila e do teor de água no sistema, mantendose constante a temperatura de reação a 45°C, sendo que o teor de água no sistema mostrou ser um parâmetro importante no processo, conforme relatado na literatura. Foi proposto um mecanismo de reação, cuja equação da taxa avaliada em função da temperatura, para este sistema Bi-Bi, permitiu estimar a energia de ativação como sendo 24,8 kJ/kmol. A ordem de reação global caracterizada como de primeira ordem mostrou uma dependência de primeira ordem em relação às concentrações dos substratos. Finalmente, são discutidos os resultados do efeito do comprimento das cadeias do substrato sobre o desempenho da reação a partir da hidrólise do acetato de etila e butila / Abstract: Enzymes supported in a solid phase catalyzing reactions with substrates and products in gaseous phase constitute a recent progress in the biotechnology. It has technological applications that include: toxic gas remediation, biosensors and synthesis of pharmaceutical, fragrances and aromas for the food industry and cosmetics. This work presents, the experimental results of the kinetic study of the esterification and hydrolysis reactions of ethyl acetate in gaseous phase catalyzed by two biocatalysts: the) Lipase PS (Amano, Japan) immobilized in supports of pure and mixed oxides of Si/Mg with controlled pore and b) Lipozyme 1M (Novo Nordisk, Denmark). The experimental system is formed by three blocks: the first is responsible for the preparation of the substrates in gaseous phase, considering that a carrier gas, after bubbling in a substrate, is in equilibrium with the liquid phase, and so the partial pressure of the substrate in the gas leaving the saturation flask is equal to the vapor pressure corresponding to the bubble point pressure above the pure compound. The second is the reaction block and the last block is formed by the gas chromatography and acquisition of data systems on-line connected. Variations in the amount of biocatalyst did not show the existence of limitations for mass transfer for the same reaction conditions. This way, the reaction kinetics was studied as a function of the ethyl acetate and water concentration with a constant reaction temperature of the 45°C. The water showed to be an important parameter in the process, as reported in the literature. A reaction mechanism Bi-Bi was proposed. The activation energy as being 24,8 kJ/kmol was calculated. The order of global reaction (determined as 1) showed a dependence of first order in relation to the substrate concentrations. Finally, the results of the effect of the length of the chains of the substrate in the hydrolysis reactions of the ethyl and butyl acetate are discussed. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Graciliano de Oliveira Neto, Lauro Tatsuo Kubota / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T07:40:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RoverJunior_Laercio_D.pdf: 3024594 bytes, checksum: 130d8e93666adacafebc78e6202f2d96 (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:18:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juca_MarilenaBezerra_D.pdf: 9583247 bytes, checksum: 3c650d200ba2b5d69b14e0c0c77e75a9 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O bloqueio da replicação retroviral é realizado principalmente através da inibição da transcriptase reversa. Novobiocina, brometo de etídeo, tetrametil brometo de etídeo, os alcalóides metoximetilvoacalotina, laurifolina e erisodina e o composto platínico Pt(BCP)(CBDCA) inibiram a atividade DNA polimerase da transcriptase reversa de vírus de mieloblastose de aves (TR de AMV). Independentemente da matriz utilizada: DNA ativado, poli(rA)(dT)12 e poli(rC)(dG), 0,5 mM de novobiocina inibiu 50% da atividade enzimática (IC50). O valor de IC50 para DNA polimerase a era o mesmo obtido para transcriptase reversa, significando que a droga não era específica para a enzima viral. A inibição por brometo de etídeo dependia do grupo substituinte na posição 2' do açúcar, onde a substituição de OH por Fluor no derivado poliadenílico como matriz, tornava a reação catalisada por transcriptase reversa menos susceptível à ação deste inibidor. Este padrão de inibição também foi observado com o composto platínico Pt(BCP)(CBDCA). Tanto para brometo de etídeo quanto para o seu análogo tetrametil brometo de etídeo, inibições mais eficientes foram obtidas quando se utilizou análogos de poli(rA)(dT)12 como matrizes. A eficiência da inibição pelos derivados etídeos era dependente da matriz poli(rA)(dT)12, poli(dAFI)(dT)12, poli(Am)(dT)12, poli(dA)(dT)12 e do cátion divalente (Mg2+, Mn2+, C02+) utilizado. O efeito inibitório do alcalóide metoximetilvoacalotina foi alterado pela natureza da matriz-iniciador tendo-se obtido os seguintes valores de IC50, 5,0; 3,5 e 1,0 mM para poli(rA)(dT)12, DNA ativado e poli(rC)(dG)12, respectivamente. O alcalóide laurifolina inibiu consideravelmente a TR de AMV mas não houve alterações significativas quando a matriz-iniciador poli(rA)(dT)12 foi substituida por poli(dAFI)(dT)12 como também quando Mg2+ foi substituido por Mn2+. Laurifolina é um inibidor não competitivo e, provavelmente, liga-se à enzima com alta afinidade (Ki = 0,66 µM). Laurifolina é, portanto, um efetivo inibidor da TR de AMV e um promissor agente antiretroviral. O alcalóide erisodina apresentou uma inibição mais apreciável na reação de TR dirigida por poli(rA)(dT)12. DMSO ativou a TR de AMV até a concentração de 4%. A maiores concentrações, este solvente inibiu a enzima em presença de poli(rA)(dT)12 e DNA ativado. Com poli(dAFI)(dT)12 esta ativação alcançou um máximo à 20% de DMSO, inibindo a maiores concentrações. O efeito ativador do DMSO pode estar relacionado com o decréscimo do valor de Km de 9,1µg/mI na ausência do solvente para 3,3 µg/rnl na presença do solvente. DMSO não protegeu a TR da inativação durante quatro horas a 0°C. Oito compostos platínicos foram anaIizados. Pt(BCP)(CBDCA) inibiu consideravelmente a enzima tendo discriminado a atividade DNA polimerase RNA-dependente (RDDP) da atividade DNA polimerase DNA-dependente (DDDP). Análises cinéticas revelaram que o tipo de inibição da TR de AMV para os compostos estudados era não competitiva, com exceção do alcalóide erisodina e do composto platínico Pt(BCP)(CBDCA) que apresentaram uma inibição competitiva em relação a poli(rA)(dT)12 e dTTP, respectivamente / Abstract: The blockage of retroviral replication is performed mainly through the reverse transcriptase inhibition. Novobiocin, ethidium bromide, tetramethyl ethidium bromide, the alkaloids methoxymethylvoachalotine, laurifoline, erisodine, and the platinum compound Pt(BCP)(CBDCA) inhibited the DNA polymerase activity of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV RT). lndependently ofthe template used: activated DNA, poly(rA)(dT)12 and poly(rC)(dG)12, 0.5 mM novobiocin inhibited 50% of the enzyme activity (IC50). This drug was not specific for the viral enzyme since the IC50 value for DNA polymerase a was similar to that obtained for reverse transcriptase. The inhibition ofRT by ethidium bromide depended on the 2' -substituent in the sugar moiety, where the substitution of OR by fluorine on the template polyadenilic acid (poly A), became the reaction catalyzed by reverse transcriptase less sensitive to the action of this inhibitor. A similar pattem of the inhibition also was observed with the platinum compound Pt(BCP)(CBDCA). Ethidium bromide and its analog tetramethyl ethidium bromide more efficiently inhibited the reaction, when poly(A) analogs were used as templates. The efficiency of inhibition for the ethidium derivates was dependent on the templates poly(rA)(dT)12, poly(dAFI)(dT)12, poly(Am)(dT)12, poly(dA)(dT)12 and on the divalent cations (Mg2+, Mn2+, Co2+) utilized. The inhibitory effect by the alkaloid methoxymethylvoachalotine was also template-primer dependent and the following IC50 values were obtained: 5.0; 3.5 and 1.0 mM for poly(rA)(dT)12, activated DNA and poly(rC)(dG)12, respectively. The alkaloid laurifoline considerably inhibited the AMV RT but there were no significative differences when the template-primer poly(rA)(dT)12 was substituted for poly(dAFl)(dT)12 and when Mg2+ was substituted for Mn2+. Laurifoline was a non-competitive inhibitor and, probably binds to the enzyme with high affinity (Ki = 0.66 µM). Therefore, laurifoline, an effective inhibitor for the AMV R T, could be a promising antiretroviral agent. The aIkaloid erisodine showed a more appreciable inhibition on the poly(rA)(dT)12-directed RT reaction. DMSO activated the AMV RT at concentrations up to 4%. At higher concentrations, this solvent inhibited the enzyme in the presence of poly(rA)(dT)12 or activated DNA. With poly(dAFl)(dT)12 this activation reached a maximum at 20% DMSO, inhibiting at higher concentrations. The activator effect of DMSO could be related to a decrease in the Km value from 9.1µg/mI in the absence to 3.3 in the presence of the solvent. DMSO did not protect the RT from inactivation, during four hours, at 0°C. From eight platinum compounds analyzed, Pt(BCP)(CBDCA) considerably inhibited the enzyme activity, discriminating the RNA- from the DNA-dependent DNA polymerase activities. Kinetic analysis reveled that, with the exception of the alkaloid erisodine and the platinum compound Pt(BCP)(CBDCA) that presented competitive inhibitions relation to poly(rA)(dT)12 and dTTP, respectively, the inhibitions of the AMV RT by the other compounds studied in this work were of the non-competitive type / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T12:05:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_CarmenVerissima_M.pdf: 6901592 bytes, checksum: ae281be837b3a7c042cf49f019d3a59e (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Quatro frações contendo atividade fosfatásica ácida (AP1, AP2, AP3A e AP3B) foram detectadas e purificadas à partir do extrato solúvel de sementes de soja quiescentes através da precipitação com sulfato de amônio e acetona e cromatografias de troca iônica, filtração em gel e afinidade. Em coluna de SP-Sephadex a fração APl foi eluída com o tampão de equilíbrio (tampão acetato 0,01 M, pH 5,0), enquanto as frações AP2 e AP3 foram eluídas com 0,05 e 0,3 M de fosfato, respectivamente. As frações AP3A e AP3B foram obtidas da fração AP3 aplicada em coluna de DEAE-Sephadex. A atividade enzimática foi determinada utilizando p-NPP como substrato em tampão acetato 100 mM, pH 5,0, a 37°C. Atividades específicas de 50, 10, 0,84 e 2 'um¿ .min-1.mg-1 foram obtidas para Apl (purificação de 910 vezes), AP2 (180 vezes), AP3A (16 vezes), e AP3B (36 vezes), respectivamente. Massas moleculares relativas de 51.000, 58.000, 52.000 e 30.000 foram determinadas para APl, AP2, AP3A e AP3B, respectivamente, através de filtração em gel na coluna SW 300 (Waters Protein Glass) acoplada a um sistema de LC. Das 4 frações, somente a APl se ligou à coluna de conA-Sepharose, embora provavelmente as outras frações também tenham carboidratos em suas estruturas. O perfil de eluição nas cromatografias de troca iônica mostrou que as 4 frações apresentavam pI diferentes. Após a purificação, foram realizados estudos cinéticos para as 4 frações de fosfatases ácidas. A fração APl apresentou uma alta atividade em pH 4,5-6,0, enquanto para as outras frações, a faixa de pH ótimo foi 5,0-6,5. APl e AP2 exibiram maior especificidade pelo substrato do que AP3A e AP3B. Os valores de Km foram determinados para p-NPP, Tyr-P e PPi, em pH 5,0 a 37°C. As fosfatases ácidas apresentaram os seguintes valores de Km: APl (p-NPP - 0,49, PPi - 0,51 e Tyr-P - 1,14 mM); AP2 (p-NPP - 0,38, PPi - 1,33 e Tyr-P - 1,14 mM); AP3A (p- NPP - 0,20, PPi - 0,16 e Tyr-P - 0,19 mM) e AP3B (p-NPP - 0,086, PPi - 0,17 e Tyr-P - 0,17 mM). A atividade das 4 frações não foi afetada na presença de EDTA, DTT, GSH e 2-mercaptoetanol. O fosfato, fluoreto, vanadato, molibdato e os cátions CU2+e Zn2+,inibiram as 4 frações, quando se utilizou o p-NPP como substrato. Ao contrário de outras fosfatases ácidas de planta, as 4 frações apresentaram alta atividade em temperatura acima de 80°C, durante 10 minutos de incubação. No entanto, quando as mesmas foram pré-incubadas a 80°C houve perda da atividade após 5 min., indicando portanto que a presença do substrato é importante para a manutenção da atividade nesta temperatura. Nenhuma das frações catalizou a reação de transfosforilação, uma vez que na presença de aceptores de fosfato (glicerol, metanol e etanol) não ocorreu aumento da atividade enzimática. Os resultados obtidos mostram que as 4 frações não apresentaram diferenças significativas em suas propriedades cinéticas / Abstract: Four fractions of acid phosphatase (API, AP2, AP3A,and AP3B) have been detected and purified from soybean seeds soluble extract through ammonium sulfate and acetone precipitations, and ion exchange, gel filtration and concanavalin Asepharose chromatographies. API was eluted with equilibrium buffer, while AP2 and AP3 were eluted with 0.05 and 0.3 M inorganic phosphate, respectively, from SP-Sephadex column, AP3A and AP3B were the enzymatic fractions originated from AP3 applied on the DEAE-Sephadex column. The enzyme activity was determined using p-nitrophenylphosphate as substrate in 100mM acetate buffer, pH 5, at 37°C. Specific activity values of 50, 10, 0.84 and 2 Umol.min-1.mg-w1 ere obtained for API (910-fold purification), AP2 (180-fold), AP3A (16-fold), and AP3B (36-fold), respectively.The relative molecular mass of API, AP2, AP3A and AP3B were determined by 300 SW Waters Protein Glass column, were found to be 51,000, 58,000, 52,000 and 30,000, respectively. The four acid phosphatase forms purified seemed to be glycoproteins, however, only AP1 could bind to concanavalina A Sepharose. Ion exchange chromatography elution pattems showed that soybean seed acid phosphatases essentially differed in relation to their isoelectric point. The kinetic properties of the four fractions of soybean seeds acid phosphatases were studied. API presented a high activity at pH 4.5-6.0, while for the other fractions the optimum pH range was 5.0-6.5. API and AP2 exhibited higher substrate specificity than AP3A and AP3B. The Km values were determined for p-nitrophenylphosphate, tyrosinephosphate and inorganic pyrophosphate, at pH 5.0 and 37°C. The acid phosphatases presented the following apparent Km values: API (pNPP -0.49, PPi -0.51 and TyrP - 1.14mM);AP2 (pNPP- 0.38, PPi - 1.33 and TyrP - 1.14 mM); AP3A (pNPP - 0.20, PPi - 0.16 and TyrP - 0.19 mM) and AP3B (pNPP - 0.086, PPi - 0.17 and TyrP - 0.17 mM). Using pNPP as substrate, no effect was observed in the acid phosphatases activity in the presence of EDTA, dithiothreitol, glutathione and 2-mercaptoethanol. The four fractions were inhibited by inorganic phosphate, fluoride, vanadate, molybdate, CU2+and Zn2+.In contrast to other plant acid phosphatases alI the soybean seeds enzymatic forms presented high activities above 80°C, during 10 min incubation. However the enzymes were inactivated after 5 min when pre-incubated at 80°C in the absence of substrate. The soybean seeds acid phosphatases did not catalyze the transphosphorylation reaction since no stimulation was observed with inorganic phosphate acceptors (glycerol, methanol and ethanol). Our results showed that no significative differences could be observed on the kinetic properties for the four soybean seed acid phosphatase fractions / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas