Orientador : Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T16:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_PriscilaPerez_M.pdf: 20067507 bytes, checksum: 5426f2ef7cbcf8da8d4ac245aab7ffaf (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Fundamentação: O estímulo mecânico é o principal fator responsável pela indução de crescimento celular hipertrófico em miócitos cardíacos em condições de sobrecarga hemodinâmica. Dados experimentais disponíveis indicam que este efeito do estiramento mecânico se faz através da ativação de mecanismos que envolvem múltiplas vias de transdução e sinalização celular, que, por sua vez, regulam a expressão de um conjunto complexo de genes responsáveis pelas alterações fenotípicas dos miócitos cardíacos. Evidências mais recentes indicam que o estímulo mecânico é percebido e traduzido em sinais bioquímicos através de sítios especializados constituídos por proteínas transmembrana conhecidas como integrinas que conectam a matriz extracelular à rede do citoesqueleto. Em miócitos cardíacos, existem estruturas semelhantes, que conectam a linha Z do sarcômero à matriz extracelular através de integrinas. Esta estrutura estabelece ligação através da qual o estímulo mecânico pode ser transferido da matriz extracelular para as organelas, sarcômero e núcleo do miócito cardíaco. Além disso, várias moléculas de sinalização são imobilizadas e têm suas funções dependentes da ancoragem ao citoesqueleto, estabelecendo a base fisica para a transdução mecano-bioquímica. Dentre as várias moléculas de sinalização envolvidas na sinalização celular mediada pelas integrinas, a quinase de adesão focal tem sido das mais estudadas, porque evidências experimentais indicaram que esta enzima tem função central nos efeitos celulares resultantes da ativação de integrinas. A ativação da Fak por estímulos mecânicos foi demonstrada em miócitos cardíacos em cultura e em miocárdio de corações intactos de gatos e ratos. Em estudos anteriores demonstramos que o estímulo mecânico ativa precocemente a Fak, bem como um complexo de sinalização associado a esta enzima. A relação estreita entre a carga mecânica e a associação Fak/Src, Fak/PI-3 Kinase/ Grb2 e a ativação simultânea da Erk1l2 indicaram que este complexo pode contribuir para a resposta miocárdica à sobrecarga mecânica. Obietivo: Opresente estudo foi planejado para avaliar a influência do estímulo mecânico na ativação da Fak em corações isolados. Além disso, a ativação da Erk1l2, um efetor da Fak foi estudada com anticorpos fosfo-específicos para Erkl/2. A importância relativa da tensão passiva! estiramento e atividade contrátil na ativação da Fak e Erkl/2 pelo estímulo mecânico foi avaliada em corações paralizados com solução cardioplégica em corações perfundidos com diferentes concentrações de cálcio, respectivamente. Além disso, as localizações da Fak e Erk1l2 nos miócitos cardíacos foram confirmadas pela análise por imunohistoquúnica de cortes histológicos do miocárdio. Resultados: Aumentos na pressão diastólica de ~ Oaté 15 mrnHg aumentou rapidamente a fosforilação em tirosina da Fak (2,3 vezes), associação Fak/c-Src (2,8 vezes) e Fak/Grb2 (3,6 vezes). Estes resultados foram acompanhados por ativação da Erk1l2 (2,8 vezes) e aumentam a associação Fak/Erk1l2. Tanto a Fak como a Erk1l2 foram detectadas no sarcoplasma dos miócitos cardíacos, mas a Erk1l2 foi também encontrada nos núcleos de miócitos cardíacos. Estiramento do ventrículo esquerdo provocado por aumento da pressão da cavidade em corações perfundidos com solução cardioplégica provocaram ativação da Fak e Erk1l2 de maneira similar àquelas observadas em corações com batimento espontâneo. Contudo, aumentos na atividade contrátil induzida por cálcio não foram acompanhados de ativação da Fak ou Erkl/2 no miocárdio. De maneira geral, estes achados demonstraram que o estiramento mecânico e não a atividade contrátil é responsável pela ativação da Fak e da Erk1l2 durante sobrecargas mecânicas. Conclusões: Nossos resultados acrescentaram informação sobre a ativação da Fak pelo estímulo mecânico. A demonstração de que o estiramento ou tensão passiva e não aumentos na atividade contrátil ativaram a Fak e seu efetor Erk1l2 é compatível com a hipótese de que a ativação da Fak pelo estímulo mecânico pode estar ligada à ativação do complexo integrina/citoesqueleto / Abstract: The mechanical input plays a major role in cardiac adaptive responses to hemodynamic overload. In addition of triggering the force-Iength mechanism and the homeometric autoregulation, the mechanical input activates signaling mechanisms involved on hypertrophic growth of cardiac myocytes, the hal1mark of themyocardial structural adaptation in response to sustained hemodynamic overload. How mechanical input is converted to biochemical signals that induce the myocardial responses is still not completely understood. However, increasing evidence support the notion that the living cells transduce and transmit forces into biochemical signals through specialized focal sites of the membrane whereby integrins connect the cytoskeleton to the extracellular matrix. This includes cardiac and skeletal myocytes, where the costameres, the counterpart of focal adhesion compleXoconnect the sarcolemma to sarcomere -Z lines through cytoskeletal proteins. Such structures provide a continuous path for mechanical signal transfer ttom extracellular matrix to internal organelles, sarcomere and nucleus. In addition, many signaling molecules are immobilized and have their function dependent on the anchorage to the cytoskeleton, which provide the physical basis for mechano-biochemical transduction. Among the various signaling molecules involved on integrin-mediated signaling, focal adhesion kinase (Fak) has received much attention, because experimental evidence indicate that it plays a key role in the celIular effects elicited by the integrinlcytoskeletal system, such as celI growth and gene expression. Fak activation has been demonstrated in isolated cardiac myocytes subjected to pulsatile mechanical stretch and overloaded feline and rat myocardium.The close relationship between increased load and Fak/c-Src activation, Fak/PI-3 kinase/Grb2 association and the concurrent activation of Akt and Erk1/2, two potential downstream effectors of the Fak multicomponent-signaling compleXoindicated that it may play a role in the earlier myocardial responses to increased workload. Thus, this study W@Sdesigned to examine, in an isolated perfused heart preparation, the separated influence of mechanical stimulus, tension development and contractile activity on Fak activation during increases in myocardial workload. In addition, the Erk1/2 activation, a downstream effector ofFak, was studied by using an anti-phosphospecific antibody against Erk1/2. The relative importance of myocardial passive tension and contractile activity on load-induced Pak and Erk1l2 activation were examined by perfusing isolated hearts with cardioplegic solution and by increasing calcium concentration in the perfusate, respectively. Purthermore, the locations of Pak and Erkl/2 in cardiac myocytes were confirmed by immunohistochemical analysis of myocardial sections. Increases of diastolic pressure from ~O up to ~15 mmHg rapidly (within 10 min) increased Pak tYfosine phosphorylation (maximum: 2.3-fold) and binding to c-Src (mx: 2.8-fold) and Grb2 (mx:3.6-fold). This was paralleled by a load-induced activation of Erk1l2 (mx; 2.8-fold) as assessed with phospho-specific antibodies, and also binding of Erk1l2 and phospho-Erk1l2 to Pak. Pak and Erk1l2 protein were immunolocalized at sarcolemmal sites of cardiac myocytes, but consistent Pak and Erk1l2 immunoreactivity were also detected regularly distributed at sarcoplasma and in the case of Erkl/2 at nuclei. Balloon inflation to raise ventricular pressure from ~O to ~15 mmHg in hearts perfused with cardioplegic solution activated Pak and Erk1l2 to levels comparable to those seen in beating hearts. However, increases in contractile activity induced by the heart perfusion with increasing calcium concentration (from 0.5 to 5 mM) did not activate Pak multicomponent signaling complex or Erk1l2 in the myocardium. Over all, these findings demonstrated tOOtmechanical stretch rather than contractile activity, triggers Pak and Erk1l2 activation during increased myocardium workload. In conc1usion, our results provide further argument for a role ofPak in the early myocardial responses to mecOOnicalstimuli. The demonstration here tOOtstretch or passive tension alone instead of increases in contractile activity can activate Pak and its downstream effectors is compatible with the appealing hypothesis that load induced Pak activation in myocardial cells could be linked to the integrin/citoskeletal signaling complexo Purthermore, experiments showing tOOtstretch or passive tension-induced binding of Pak to Grb2, Erk1l2, and activated Erkl/2, and also a common localization ofthese eI1ZYIlles at the sarcolemma and sarcoplasma of cardiac myocyts, indicate a linkage between load-induced Pak and Erk1/2 activation during mechanical overload / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Resumo: Miosinas são motores moleculares envolvidas com diferentes formas de movimentação celular, como fagocitose, citocinese, contração muscular, batimento de cílios e tráfego de organelas e partículas. Elas usam a energia derivada da hidrólise do ATP para realizar esses movimentos e possuem um domínio motor comum. A diversidade dos membros da família nos permite agrupá-las em classes. A miosina muscular foi definida como convencional (classe 2), enquanto outros tipos são referidos coletivamente como miosinas não-convencionais (agrupadas em várias classes). Miosinas que filogeneticamente não se agrupam com qualquer outra miosina são denominadas miosinas órfãs. T. cruzi possui, além dos genes que codificam para duas miosinas (uma presente em quase todos os organismos – classe 1 – e uma presente apenas em outros tripanosomatídeos – classe 13), outros sete genes identificados que codificam para miosinas órfãs, chamadas de MyoA, MyoB, MyoC, MyoD, MyoE , MyoF, MyoG, que são o foco deste trabalho. Para iniciar a caracterização destas miosinas, experimentos foram delineados visando elucidar a localização celular e as proteínas que interagem com as miosinas. Para alcançar estes objetivos foi necessária a expressão de proteínas recombinantes para a produção de anticorpos em camundongos que foram utilizados para ensaios de imunolocalização e imunoprecipitação. Em paralelo, a transfecção do parasita para a expressão da proteína fusionada ao GFP e identificação da sua localização foi realizada. Os resultados nos confirmam que cinco das sete miosinas identificadas in silico são encontradas nos extratos protéicos das formas epimastigotas do parasita, mas que essa expressão deva ocorrer em baixos níveis. A localização celular visualizada através da utilização de anticorpos foi realizada para a MyoC, MyoD e MyoE. As miosinas C e E se concentram na região anterior do parasita, compatível com a bolsa flagelar e base do flagelo respectivamente e a miosina D tem uma localização granular dispersa pelo citoplasma. As demais miosinas tiveram sua localização visualizada somente quando expressas fusionadas à etiqueta de GFP, através da captação da fluorescência da etiqueta. A maioria dessas localizações apresentaram um padrão disperso pelo corpo celular, com exceção da MyoF que apresentou uma localização filamentar concentrada da porção anterior do parasita. Estamos trabalhando para identificar as proteínas que possam estar interagindo com as miosinas órfãs de T. cruzi. O nocaute gênico foi realizado para MyoC e ocorreu morte da cultura celular após o provável silenciamento de um dos alelos desta proteína. Estamos investigando se o hemizigoto realmente não é viável ou se não houve a adequada recombinação do cassete de resistência nessa primeira tentativa de transfecção. O estudo das miosinas de T. cruzi, suas funções e suas interações dentro da célula irá contribuir para a avaliação do papel do citoesqueleto em Trypanosoma cruzi.

Orientador: Paulo Pinto Joazeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_SuzanaGuimaraes_M.pdf: 7379393 bytes, checksum: 81d96ac157f0966b8e36ef547c5d2b7d (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A sínfise púbica é um tipo de articulação ligeiramente móvel localizada na confluência dos ossos pubianos, unindo-os através de coxins de cartilagem hialina. A estabilidade apresentada por essa articulação é alterada durante a gestação, período em que tanto a cérvix uterina como toda a cavidade pélvica, inclusive a sínfise, devem se adaptar proporcionando um parto normal. A separação da sínfise púbica fibrocartilaginosa do camundongo na prenhez depende de sua transformação em um ligamento extensível, processo este que envolve o aumento da biossíntese da matriz extracelular (MEC), principalmente colágeno, proteoglicanos e glicosaminoglicanos e a mudança na relação entre síntese e degradação dos mesmos. Na sínfise de camundongo o tumover destes componentes foram estimados por estudos bioquímicos e de microscopia de luz; porém pouca atenção tem sido dada aos aspectos ultra-estruturais e histoquímicos, tão pouco encontramos relatos sobre os componentes do sistema elástico e a plasticidade celular. O presente trabalho teve por objetivo conhecer a distribuição das fibras do sistema elástico e caracterizar o imunofenótipo e aspectos ultra-estruturais de células envolvidas na formação e involução do ligamento interpúbico na sínfise púbica de camundongos, durante prenhez, parto e pós-parto. O estudo foi realizado por meio de métodos seletivos de coloração para sistema elástico, imunohistoquímica para identificação das células (utilizando anticorpos específicos anti-a-actina de músculo liso (a-SMA), desmina e vimentina) e análise ultra-estrutural para ambos. Os resultados obtidos mostraram variação de tipos e de distribuição das fibras do sistema elástico, assim como um aumento de diâmetro e de comprimento aparente das mesmas, durante a prenhez. Estas observações indicam que o sistema elástico deve desempenhar importante papel, tanto impedindo o rompimento do ligamento interpúbico durante a evolução do mesmo, quanto recuperando a organização dessa estrutura após o parto. Com relação ao compartimento celular, foi observada uma intensa imunomarcação para anti-a-SMA durante todos os períodos observados, enquanto vimentina e desmina apresentaram uma expressão transitória (entre o 15° dia de gestação e 24 horas pós-parto). A análise ultra-estrutural mostrou ainda que estas células passam por algumas alterações morfológicas durante a formação do ligamento interpúbico, adquirindo características descritas anteriormente para miofibroblastos, como núcleo indentado e presença de fibronexus e geralmente são vistas próximas às fibras elásticas. Os dados morfológicos e ultra-estruturais sugerem que essas células possuem um aparato de contração formando uma rede entre célula e MEC capaz de transmitir a força gerada pela movimentação dos ossos púbicos durante a prenhez, tanto para células adjacentes como para outros componentes da MEC, a exemplo das fibras do sistema elástico. Portanto, a presença de células e fibras com essas características particulares na sínfise púbica pode contribuir para integridade estrutural e mecânica dessa articulação / Abstract: Pubie symphysis is a type of slightly mobile joint, formed with a fibroeartilaginous dise Iying between the hyaline cartilage-eovered mediar borders of the pubie bones. The stability presented for this joint is modified during the pregnaney, period where as mueh eervix uterine as the entire pelvie eavity, ineluded symphysis, must be adapted to providing a normal labor. The spreading apart of mouse pubie symphysis in pregnaney depends on its transformation in an extensible ligament, proeess this that involves the inerease of biosynthesis of the extraeellular matrix (ECM), mainly eollagen, proteoglycans and glyeosaminoglyeans and the ehange in the relationbetween synthesis and degradation of the same ones. In mouse symphysis the fumaver of these eompanents had been estimated by bioehemieal studies and light microscopy, however little attention has been given to the ultrastruetural and histoehemieal aspeets, so little we find reports about the elastie system components and the eellular .plasíic.i.ty. The aims of the present work were to know the distribution of the elastie system fibers and to ehal acterize the immunophenotype and ultrastrueturaJ aspe.cts of mvolved eells in the formation and involution of the interpubie ligament in mouse pubie symphysis, during pregnaney, parturition and post-partum. The study ap-pJjeds_leetive stainingmethods for elastie system, Immunohistoehemistry (using speeifie antibodies anti-a-actin of smooth musele (aSMA), desmin and vimentin) and ultrastructural analysis. Our results showed variation of types and distribution of the elastie sy_stem fibers, as well as an inerease of diameter and apparent length of the same ones, during the.pregnaney. These observations indieate that the elastie system must play important roles, preventing the disruption of interpubie ligament during it evolution, as well as reeov.erjng1he organization of this strueture after the parturition. With eoneem to the eellular eompartment, it was observed an intense immunoreaetivity for anti-a-SMA during ali the observed periods, while vimentin and desmin presented a transient expression (from 15° day of pregnaney until 24 hours postpartum). The ultrastruetural analysis still showed that these eells pass for some morphologie alterations during the interpubie ligament formation, aequiring eharaeteristie deseribed previously for myofibroblasts, as indentated nueleus and presenee of fibronexus and generally are seen elose to elastie fibers. The morphologie and ultrastruetural data suggest that these eells possess a eontraetion apparatus eonstituting a network between cell and ECM capable to transmit the force generatedbythe movement of the pubjc bones during the pregnancy, as much for adjacent cells as for other components of the ECM, such elastic system fibers. Therefore, the presenceof _ceJJs and fibers wjth these particular features in pubic symphysis can contribute for structural and mechanical integrity of this joint / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Trabalhos recentes na literatura demonstraram que proteínas do citoesqueleto, mais especificamente os microfilamentos de actina, estão correlacionadas com a promoção e manutenção do estresse oxidativo, bem como modulação de processos mitocondriais. Trabalhos do nosso grupo caracterizaram que o tratamento com retinol (vitamina A) em células de Sertoli cultivadas era capaz de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), desbalanço na atividade de enzimas antioxidantes, com conseqüente promoção de estresse oxidativo. Radicais livres produzidos pelo tratamento com retinol, também foram capazes de induzir uma transformação pré-neoplásica, modulação de eventos recombinatórios, modulação de enzimas envolvidas na divisão celular como ornitina decarboxilase (ODC), progressão de ciclo celular e apoptose. O tratamento com retinol também foi capaz de, por uma via radical livre dependente, induzir a divisão de células de Sertoli terminalmente diferenciadas e não-proliferativas, com a conseqüente formação de focos proliferativos. Uma vez que o citoesqueleto participa de muitos dos processos relatados (proliferação, transformação e apoptose), e trabalhos recentes na literatura correlacionam estresse oxidativo com proteínas do citoesqueleto, nós decidimos avaliar a influencia do citoesqueleto e suas proteínas na produção e manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. O primeiro capítulo dessa dissertação caracteriza uma modulação radical livre dependente do citoesqueleto das células de Sertoli tratadas com retinol, onde uma proteção/adaptação do citoesqueleto foi observada frente ao ambiente pró oxidativo gerado pelo retinol. Neste primeiro capítulo nós também sugerimos que a adaptação observada poderia ser relacionada com um possível papel de condução de elétrons pelos filamentos de actina. O segundo capítulo dessa dissertação demonstra uma dependência da correta organização dos filamentos de actina para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. Juntamente, o segundo capítulo apresenta uma explicação para a teoria de condução de elétrons pelos filamentos de actina, onde é descrito como esse fenômeno poderia ocorrer. Os resultados apresentados nessa dissertação sugerem que os microfilamentos de actina são essenciais para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol, e que essa dependência pode ser explicada por uma nova função fisiológica de biocondutor de elétrons. / Recent works presented in the literature have shown that cytoskeleton proteins, specifically actin microfilaments, are correlated with promotion and maintenance of oxidative stress, and mitocondrial functions modulations. Works of our research group have characterized that retinol treatment in cultived Sertoli cells was able to induce reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity imbalance, resulting in oxidative stress production. Free radicals produced by retinol treatment, were also able to induce pre neoplasic transformation, modulation of recombinatory events, modulation of enzymes involved in cell division such as ornitina decarboxilase (ODC), cell cycle progression and apoptosis. Retinol treatment was also able by a free radical-dependent way, induce the division of terminate differentiated and non proliferative Sertoli cells, resulting in proliferative focus formation. Once cytoskeleton participates of many of the related process (proliferation, transformation and apoptosis), and recent works presented in the literature correlated oxidative stress with cytoskeleton proteins, we decided evaluated the cytoskeleton influence in the production and maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. The first chapter presented in this manuscript characterizes a cytoskeleton modulation free radical-dependent in the Sertoli cells treated with retinol, where a cytoskeleton adaptation/protection was observed in response to a pro oxidative environment produced by retinol. In this first chapter we also suggested that the adaptation observed could be related with a possible function of electrons conductions through actin microfilaments. The second chapter of this manuscript shows an actin microfilaments dependence to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. Together, the second chapter shows an explanation of the electron conduction theory through actin microfilaments, where a description of the electron conduction process is presented. The results presented in this manuscript suggest that actin microfilaments are essential to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment, and that this dependence could be explained by a new physiologic function of electron bioconductor.

Trabalhos recentes na literatura demonstraram que proteínas do citoesqueleto, mais especificamente os microfilamentos de actina, estão correlacionadas com a promoção e manutenção do estresse oxidativo, bem como modulação de processos mitocondriais. Trabalhos do nosso grupo caracterizaram que o tratamento com retinol (vitamina A) em células de Sertoli cultivadas era capaz de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), desbalanço na atividade de enzimas antioxidantes, com conseqüente promoção de estresse oxidativo. Radicais livres produzidos pelo tratamento com retinol, também foram capazes de induzir uma transformação pré-neoplásica, modulação de eventos recombinatórios, modulação de enzimas envolvidas na divisão celular como ornitina decarboxilase (ODC), progressão de ciclo celular e apoptose. O tratamento com retinol também foi capaz de, por uma via radical livre dependente, induzir a divisão de células de Sertoli terminalmente diferenciadas e não-proliferativas, com a conseqüente formação de focos proliferativos. Uma vez que o citoesqueleto participa de muitos dos processos relatados (proliferação, transformação e apoptose), e trabalhos recentes na literatura correlacionam estresse oxidativo com proteínas do citoesqueleto, nós decidimos avaliar a influencia do citoesqueleto e suas proteínas na produção e manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. O primeiro capítulo dessa dissertação caracteriza uma modulação radical livre dependente do citoesqueleto das células de Sertoli tratadas com retinol, onde uma proteção/adaptação do citoesqueleto foi observada frente ao ambiente pró oxidativo gerado pelo retinol. Neste primeiro capítulo nós também sugerimos que a adaptação observada poderia ser relacionada com um possível papel de condução de elétrons pelos filamentos de actina. O segundo capítulo dessa dissertação demonstra uma dependência da correta organização dos filamentos de actina para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. Juntamente, o segundo capítulo apresenta uma explicação para a teoria de condução de elétrons pelos filamentos de actina, onde é descrito como esse fenômeno poderia ocorrer. Os resultados apresentados nessa dissertação sugerem que os microfilamentos de actina são essenciais para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol, e que essa dependência pode ser explicada por uma nova função fisiológica de biocondutor de elétrons. / Recent works presented in the literature have shown that cytoskeleton proteins, specifically actin microfilaments, are correlated with promotion and maintenance of oxidative stress, and mitocondrial functions modulations. Works of our research group have characterized that retinol treatment in cultived Sertoli cells was able to induce reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity imbalance, resulting in oxidative stress production. Free radicals produced by retinol treatment, were also able to induce pre neoplasic transformation, modulation of recombinatory events, modulation of enzymes involved in cell division such as ornitina decarboxilase (ODC), cell cycle progression and apoptosis. Retinol treatment was also able by a free radical-dependent way, induce the division of terminate differentiated and non proliferative Sertoli cells, resulting in proliferative focus formation. Once cytoskeleton participates of many of the related process (proliferation, transformation and apoptosis), and recent works presented in the literature correlated oxidative stress with cytoskeleton proteins, we decided evaluated the cytoskeleton influence in the production and maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. The first chapter presented in this manuscript characterizes a cytoskeleton modulation free radical-dependent in the Sertoli cells treated with retinol, where a cytoskeleton adaptation/protection was observed in response to a pro oxidative environment produced by retinol. In this first chapter we also suggested that the adaptation observed could be related with a possible function of electrons conductions through actin microfilaments. The second chapter of this manuscript shows an actin microfilaments dependence to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. Together, the second chapter shows an explanation of the electron conduction theory through actin microfilaments, where a description of the electron conduction process is presented. The results presented in this manuscript suggest that actin microfilaments are essential to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment, and that this dependence could be explained by a new physiologic function of electron bioconductor.

Resumo

Resumo: O citoesqueleto dos organismos da família Trypanosomatidae é muito pouco estudado. Esta família inclui organismos que causam doenças em humanos, como doença de Chagas e doença do sono – Trypanosoma cruzi e T.brucei, respectivamente – e leishmaniose – causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Microtúbulos são os principais filamentos dos tripanossomatídeos e ainda não foi detectada a presença dos filamentos de actina, embora já tenha sido mostrada a presença desta proteína por imunoensaios. Microtúbulos e filamentos de actina podem funcionar como trilhos para motores moleculares, responsáveis pelo transporte de carga. As miosinas são as proteínas motoras que se movem ao longo dos filamentos de actina e são classificadas de acordo com suas similaridades. Os tripanossomatídeos possuem a miosina de classe I, presente em quase todos os organismos eucarióticos, e uma miosina exclusiva da família, a de classe XIII. A presença desta miosina de tripanossomatídeos é bastante intrigante, principalmente porque pouco se sabe sobre o citoesqueleto de actina destes organismos. Este trabalho visa à caracterização funcional das duas miosinas de T.cruzi comuns aos tripanossomatídeos – myo1 e myo13 – e tem como propostas: verificação da expressão destas proteínas pelo parasita, localização celular e identificação de complexos proteicos ligados às miosinas obtidos por imunoprecipitação, utilizando anticorpos produzidos em camundongos; localização através da expressão da miosina inteira e cauda fusionadas à GFP em T.cruzi; remoção ou inibição da atividade funcional da proteína através de nocaute e ensaio dominante-negativo. Anticorpos foram produzidos em camundongos inoculados com os fragmentos cabeça e cauda das miosinas expressas em E.coli. Os soros produzidos se mostraram específicos para proteínas de tamanho esperado, porém os produzidos contra myo1 reagiram também contra outras bandas. Estes resultados de ligação cruzada podem ser explicados devido à baixa expressão desta proteína pelo parasita, como mostrado em estudos de proteômica e transcriptômica. Resultados de imunofluorescência da myo1 mostraram uma concentração da proteína próxima ao cinetoplasto, podendo ser a bolsa flagelar. Esta localização é semelhante à myo1 de T.brucei, que está envolvida com a endocitose. A imunolocalização realizada com o soro contra a myo13 marcou uma região na base do flagelo, a mesma região da myo13 de L.donovani, que está envolvida na montagem do flagelo. A cauda da myo1-GFP se localizou na mesma região da imunofluorescência, compatível com a bolsa flagelar, indicado que a carga pode ser a responsável pela localização desta miosina. Experimentos estão em andamento para a identificação dos complexos proteicos nos quais as miosinas estão interagindo. A superexpressão da cauda para promoção de um fenótipo dominante negativo não teve efeito morfológico visível a microscópio óptico ou na taxa de replicação de epimastigotas. Estamos trabalhando para a geração de parasitas nocaute. Baseando-se nas localizações e nos trabalhos publicados com T.brucei e L.donovani, sugerimos que a myo1 esteja envolvida com endocitose e tráfego de vesículas, e que a myo13 esteja envolvida com a montagem do flagelo. Assim, com este trabalho, iniciamos a caracterização das miosinas de T.cruzi, o que pode contribuir para um maior conhecimento do processo de transporte intracelular destes parasitas.

Trabalhos recentes na literatura demonstraram que proteínas do citoesqueleto, mais especificamente os microfilamentos de actina, estão correlacionadas com a promoção e manutenção do estresse oxidativo, bem como modulação de processos mitocondriais. Trabalhos do nosso grupo caracterizaram que o tratamento com retinol (vitamina A) em células de Sertoli cultivadas era capaz de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), desbalanço na atividade de enzimas antioxidantes, com conseqüente promoção de estresse oxidativo. Radicais livres produzidos pelo tratamento com retinol, também foram capazes de induzir uma transformação pré-neoplásica, modulação de eventos recombinatórios, modulação de enzimas envolvidas na divisão celular como ornitina decarboxilase (ODC), progressão de ciclo celular e apoptose. O tratamento com retinol também foi capaz de, por uma via radical livre dependente, induzir a divisão de células de Sertoli terminalmente diferenciadas e não-proliferativas, com a conseqüente formação de focos proliferativos. Uma vez que o citoesqueleto participa de muitos dos processos relatados (proliferação, transformação e apoptose), e trabalhos recentes na literatura correlacionam estresse oxidativo com proteínas do citoesqueleto, nós decidimos avaliar a influencia do citoesqueleto e suas proteínas na produção e manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. O primeiro capítulo dessa dissertação caracteriza uma modulação radical livre dependente do citoesqueleto das células de Sertoli tratadas com retinol, onde uma proteção/adaptação do citoesqueleto foi observada frente ao ambiente pró oxidativo gerado pelo retinol. Neste primeiro capítulo nós também sugerimos que a adaptação observada poderia ser relacionada com um possível papel de condução de elétrons pelos filamentos de actina. O segundo capítulo dessa dissertação demonstra uma dependência da correta organização dos filamentos de actina para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. Juntamente, o segundo capítulo apresenta uma explicação para a teoria de condução de elétrons pelos filamentos de actina, onde é descrito como esse fenômeno poderia ocorrer. Os resultados apresentados nessa dissertação sugerem que os microfilamentos de actina são essenciais para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol, e que essa dependência pode ser explicada por uma nova função fisiológica de biocondutor de elétrons. / Recent works presented in the literature have shown that cytoskeleton proteins, specifically actin microfilaments, are correlated with promotion and maintenance of oxidative stress, and mitocondrial functions modulations. Works of our research group have characterized that retinol treatment in cultived Sertoli cells was able to induce reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity imbalance, resulting in oxidative stress production. Free radicals produced by retinol treatment, were also able to induce pre neoplasic transformation, modulation of recombinatory events, modulation of enzymes involved in cell division such as ornitina decarboxilase (ODC), cell cycle progression and apoptosis. Retinol treatment was also able by a free radical-dependent way, induce the division of terminate differentiated and non proliferative Sertoli cells, resulting in proliferative focus formation. Once cytoskeleton participates of many of the related process (proliferation, transformation and apoptosis), and recent works presented in the literature correlated oxidative stress with cytoskeleton proteins, we decided evaluated the cytoskeleton influence in the production and maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. The first chapter presented in this manuscript characterizes a cytoskeleton modulation free radical-dependent in the Sertoli cells treated with retinol, where a cytoskeleton adaptation/protection was observed in response to a pro oxidative environment produced by retinol. In this first chapter we also suggested that the adaptation observed could be related with a possible function of electrons conductions through actin microfilaments. The second chapter of this manuscript shows an actin microfilaments dependence to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. Together, the second chapter shows an explanation of the electron conduction theory through actin microfilaments, where a description of the electron conduction process is presented. The results presented in this manuscript suggest that actin microfilaments are essential to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment, and that this dependence could be explained by a new physiologic function of electron bioconductor.

Orientador: Maria Edwiges Hoffmann / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T06:12:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_PaolaRocha_D.pdf: 10187030 bytes, checksum: 88b67111d48c447b2350bbc00e187e47 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O isoproterenol (lP) é uma catecolamina sintética de grande interesse farmacológico, por ser o mais potente agonista (3-adrenérgico conhecido. Recentes trabalhos revelaram o envolvimento das reações de oxidação de IP em mecanismos de cardiotoxicidade. O cobre é um microelemento essencial que possui um papel fundamental no metabolismo dos organismos vivos. Em excesso, o cobre é muito tóxico, fato este ilustrado em disfunções neurodegenerativas como: Doenças de Menkes e Wilson. Os estudos de oxidação do IP mostraram que os metais de transição, principalmente, Cu+2 são catalisadores da reação. Neste trabalho são apresentados alguns efeitos tóxicos de IP associado ao Cu+2, sobre proteína e DNA ín vítro, e em cultura de fibroblastos de pulmão de hamster chinês. O complexo IP/Cu+2 induziu a formação de carbonilas em aminoácidos e fragmentação da cadeia polipeptídica da SSA, e a formação de 8-0H-2'-desoxiguanosina em DNA de timo bovino. O sistema contendo IP até 7,OIJM, associado ao Cu+2 (2SIJM), inibiu totalmente a proliferação celular. A oxidação de IP/Cu+2 promoveu outras alterações funcionais, como a perda da adesão celular às placas de cultura e a perda da viabilidade celular. Em condições contendo IP isolado do metal não foram encontrados efeitos significativos. Alterações morfológicas foram encontradas nas células tratadas com IP/Cu+2, gerando perda da morfologia típica dos fibroblastos que inclui achatamento celular, evidenciando os núcleos e nucléolos, e surgimento de bolhas. Os antioxidantes CAT e GSH reduziram parcial ou totalmente a velocidade de reação de IP/Cu+2, respectivamente. A GSH impediu a indução de lesões morfológicas nas células pela ação de IP/Cu+2. Também foi verificado que o sistema oxidativo gerou a destruição de todos os filamentos estudados do citoesqueleto (vimentina, actina, a-tubulina e lamina S) e induziu ao aparecimento de drásticas alterações nucleares, como o aumento do índice de DNA e o surgimento de núcleos picnóticos. Em conjunto, os resultados evidenciaram o papel crítico do cobre 11 na toxicidade de IP. Os efeitos citotóxicos observados indicam uma provável ocorrência de bloqueio do ciclo celular e morte celular por apoptose nas células V79 tratadas / Abstract: Isoproterenol (IP) is a synthetic catecholamine of great pharmacological interest, as it is the most potent B-adrenergic known agonist. Recent works revealed the involvement of IP oxidation reactions in cardiotoxicity mechanisms. Copper is an essential microelement which has a fundamental role in living organisms metabolism. In high concentration copper is extremely toxic, as iIIustrated by neurodegenerative dysfunctions such as Menkes and Wilson diseases. Studies on IP oxidation have shown that transition metais, specially CU2+, are effective catalysers of such reaction. This research presents some toxic effects of IP associated to Cu2+ on protein and on DNA in vitra, and on V79 Chinese hamster lung fibroblasts culture. IP/Cu2+ complex inducted carbonils formation in aminoacids and fragmentation of BSA polipeptidic chain, as well as formation of 8-0H-2'-deoxiguanosine in Calf thimus DNA. System containing up to 7,OJJM IP, associated to Cu2+ (2SJJM) totally inhibited cellular proliferation. Oxidation of IP/Cu2+ caused other functional alterations, such as loss of cellular adhesion to culture plates and loss of cellular viability. Conditions containing IP isolated from the metal did not produce significative effects. Morphological alterations were found in cells treated with IP/Cu2+, generating loss of fibroblasts typical morphology, mainly by bubbles appearance and cellular spreading which evidenciated nuclei and nucleolus. Antioxidants CA T and GSH respectively inhibited partially or completely the reaction of IP/Cu2+. GSH prevented lesions in cells morphology inducted by IP/Cu2+. It was also verified that the oxidant system leads to destruction of ali citoskeleton filament analysed (vimentine, actine, a-tubuline and lamin B) and to appearance of drastic nuclear alterations, like increase in DNA index and appearance of picnotic nuclei. Obtained results demonstrated the critical role of copper " on IP toxicity. Observed citotoxic effects suggest a probable interruption of cellular cycle and cellular death from apoptosis on V79 treated cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Lucia Furlan Wada / Tese (doutorado) - Universidade estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T14:42:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Genari_SelmaCandelaria_D.pdf: 7860909 bytes, checksum: c06aff4e50ce3da83aae6bebb70ad6c6 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Condições não fisiológicas de tratamento por estresse nutricional e diminuição do pH, têm sido associadas a indução de efeitos genotóxicos e transformação em cultura de células de mamíferos. As linhagens celulares Vero, estabelecida a partir de células fibroblásticas renais de macaco verde da África (Cercopithecus aethiops) e MDCK (Madin-Darby canine kidney) a partir de células epiteliais renais, assim como células de cultura primária de líquido amniótico humano foram submetidas ao estresse nutricional, com o objetivo de se investigar o efeito desse sobre vários caracteres celulares. As células estressadas assim como seus respectivos controles foram analisadas com relação a aspectos morfológicos e de crescimento em cultura, características citogenéticas e alterações no citoesqueleto e elementos de matriz extracelular. As linhagens estabelecidas Vero e MDCK assim como as células de cultura primária de líquido amniótico, apresentam inibição por contato e crescimento em monocamadas. Após serem submetidas ao estresse nutricional essas populações passaram a crescer em múltiplas camadas com formação de agregados celulares, perdendo portanto a inibição por contato. A linhagem Vero estressada mostrou alterações morfológicas na superficie celular, com aumento em estruturas vesiculares e microvilosidades, pouco observadas na população controle, que exibia superficie regular. As células presentes nos agregados ou grumos da população Vero estressada apresentaram ainda um certo grau de diferenciação, com células achatadas na superficie do grumo e células arredondadas no interior do mesmo e presença de material extracelular, simulando a formação de pequenas colônias tumorais. Nas monocamadas celulares da população MDCK estressada houve a formação de estruturas denominadas domes, evidenciando a ocorrência de transporte transepitelial. Após a confluência e crescimento em múltiplas camadas, as células MDCK estressadas organizaram-se formando estruturas tubulares. As células Vero controle apresentaram codistribuição de fibronectina e actina, as quais concentraram-se principalmente nas fibras de estresse e se acumularam nas regiões de contato entre as células da monocamada. Nas células Vero estressadas houve redução da resposta imunocitoquímica para fibronectina sem codistribuição com a actina, bem como a redução da coloração para vimentina. A diminuição de fibronectina nas células Vero estressadas provavelmente encontra-se associada à desorganização no padrão de crescimento, levando à formação de múltiplas camadas e diminuição nos índices de adesão, enquanto a presença da fibronectina entre as células da monocamada manteria a adesão ao substrato e o crescimento em monocamadas. As células MDCK controle e estressadas exibiram codistribuição de fibronectina e actina especialmente nas regiões de contato entre as células estressadas, enquanto a vimentina apresentou-se mais intensamente corada nas células MDCK estressadas. A codistribuição de fibronectina e actina nas regiões de contato entre células adjacentes da população MDCK estressada, assim como o aumento da evidenciação de vimentina encontram-se associados à formação de estruturas tubulares por estas células. Células Vero, MDCK e de líquido amniótico apresentaram número modal de cromos somos diferentes de suas populações celulares controle, assim como elevados índices de poliploidia, indicando que o estresse nutricional associado ao abaixamento do pH é responsável não somente por alterações morfológicas, mas também genéticas nos tipos celulares estudados. Pelo presente trabalho pudemos concluir que condições não fisiológicas de tratamento por estresse nutricional associado à redução do pH do meio, foram responsáveis pela indução da transformação em todos os tipos celulares estudados, levando a alterações em vários dos aspectos celulares analisados / Abstract: Non-physiological treatment conditions by nutritional stress and lowered pH have been associated with genotoxic effect and cellular transformation in mammalian culture cells. Vero cell tine, obtained ITom fibloblastic kidney cells of African green monkey (Cercopithecus aethiops), and MDCK (Madin-Darby canine kidney) epithelial cells as well as a primary culture of amniotic human cells were submitted to nutritional stress conditions, o investigate the effect of this treatment, in several cellular characteristics in these cell types. The cellular morphological, growth, cytogenetical, cytoskeleton and extracellular characteristics of cells submitted to stress conditions and their respective controls were analyzed. Vero and MDCK cell lines as well as the primary culture of amniotic cells presented contact inhibition and monolayer growth. After submitted to nutritional stress conditions all these cell types presented multilayered growth with formation of cellular aggregates, losing the contact inhibition property. Vero stressed cells presented morphological alterations at the cellular surface, with enhanced of vesicular and microvilli structures, not often observed in controí cells. At the periphery of Vero cell aggregates, flattened cells were observed, while in the aggregate, the inner cells presented a rounded shape with extracellular material, indicating an ability to stimulate miniature tumoral colony formation. On the monolayer of stressed MDCK cells specific structures called domes were observed, which indicate that transepithelial transport has been performed. After confluence an multilayered growth of stressed MDCK cells were organized in tubular structures. ContraI Vero cells presented fibronectin and actin codistribution at stress fibers and between adjacent cells in the monolayer. Stressed Vera cells showed reduced immunocytochemical response to fibronectin and vimentin without actin codistribution. The reduction of. fibronectin response in Vero stressed cells probably is associated to the growth pattem disorganization, with multilayer growth and a reduced adhesion index, while fibronectin between adjacent cells is responsible forthe substrate adhesion and monolayer growth. Control and stressed MDCK celIs presented fibronectin and actin codistribution at the cell-cell contact regions, while the vimentin immunocytochemical response was enhanced in stressed cells. These characteristics in stressed MDCK celIs probably are associated with the formation of the tubular structures observed. Vero and MDCK lines as well as amniotic human celIs presented altered modal chromosome number and enhanced polyploidy index when compared at their controls, showing that nutritional stress conditions and lowered pH are associated, not only to morphological, but also to genetical alteration in the analyzed celI types. In the present research we can conclude that non physiological conditions by nutritional stress associated with lowered medium pH were responsible by transformation induction in alI the cellular types studied. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Ciências