Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, uma das doenças tropicais mais negligenciadas. Estima-se que cerca de 11 milhões de pessoas no mundo estão infectadas por T. cruzi e cerca de 6 a 7 milhões de pessoas estão em risco por encontrarem-se em áreas endêmicas. Durante o processo de invasão moléculas do parasita e do hospedeiro interagem permitindo a transdução de sinal e a expressão de genes de modulação em resposta à invasão. A diversidade de proteínas e vias acionadas para reparar a lesão pela ruptura da membrana plasmática nos interessou e dessa forma o presente estudo desenvolveu uma nova forma de detecção e quantificação por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) da carga parasitária de T. cruzi e a quantificou os níveis transcricionais relativos (RT-qPCR) da Disferlina, Esfingomielina esferase ácida (ASM), Fator de Transcrição EB (TFEB), Galectinas 1 e 3 e Anexina A2. Neste estudo, foi demonstrado que a quantificação por PCR em tempo real utilizando os iniciadores P21fw e P21rv foi específico e sensível para a detecção de T. cruzi in vivo e in vitro, bem como os níveis transcricionais de genes relacionados a organização do citoesqueleto e reparo de membrana plasmática são moduladas em resposta ao dano gerado pelo parasita. / Trypanosoma cruzi is causative agent of Chagas disease, one of most neglected tropical diseases. Estimated that about 11 million people worldwide are infected by T. cruzi and about 6 to 7 million people are at risk in endemic areas. During the process of invasion of host and parasite interact enabling signal transduction and gene expression modulation in response to invasion. The diversity of activated proteins and pathways to repair the damage by disruption of the plasma membrane interest to us and thus present study developed a new form of detection and quantitation by polymerase chain reaction in real time (qPCR) of parasitic load T. cruzi and quantified transcriptional levels relative (RT-qPCR) of dysferlin, Sphingomyelin acid esferase (ASM), transcription factor EB (TFEB) Galectins 1 and 3 and Annexin A2. This study demonstrated that quantification by real time PCR using primers P21fw and P21rv was specific and sensitive for detection of T. cruzi in vivo and in vitro, as well as transcriptional levels of genes related to cytoskeletal organization and repair plasma membrane are modulated in response to damage generated by parasite. / Tese (Doutorado)

O estudo de agentes que interferem no funcionamento das proteínas relacionadas com o ciclo celular é importante para a compreensão dos processos de transformação e de morte celular. Alterações de ploidia, embora presentes na maioria dos tumores humanos, não têm ainda seu papel conhecido no processo de oncogênese. A alteração do número cromossômico é conseqüência primária de erros que envolvem o fuso mitótico e o cinetócoro. Dessa maneira, drogas que agem sobre os microtúbulos são consideradas aneugênicas potenciais. O presente trabalho enfocou o estudo do mecanismo pelo qual drogas que atuam sobre microtúbulos levam ao aparecimento de células multinucleadas e o significado biológico destas. Os resultados mostraram que a vincristina induziu bloqueio em mitose das células BBnt e MDCK, com conseqüente entrada em interfase no estado multinucleado. As células multinucleadas não apresentaram sinais de morte celular por apoptose, entretanto, quando em prófase apresentaram vários centrossomos, que poderiam originar divisões celulares com fusos multipolares. Estes resultados indicam que essas linhagens celulares possuem pontos de checagem mitótico funcionais e células multinucleadas são viáveis e capazes de prosseguir no ciclo celular. A presença de mitoses com fusos multipolares é indício de que as células multinucleadas passam por divisões anormais, que progrediriam para apoptose resultando na eliminação desta população. / The study of agents that interfere in the functionality of proteins related to cell cycle is important for the understanding of the transformation and cell death processes. Although ploidy alterations are presented in the majority of human tumors, their role in oncogenic process is not understood yet. The alteration on chromosomal number is the primary consequence of errors involving the mitotic spindle and kinetocore. Thus, drugs acting on the microtubules are considered as potentially aneugenic agents. The present work aimed to study the mechanism of multinucleated cells induction by action of antimicrotubule drug and biological meaning of these cells. The results showed that vincristine induced mitotic arrest of both BBnt and MDCK cells, with consequent entrance into interphasic-multinucleated status. Multinucleated cells did not present features of cell death by apoptosis; they were still viable and able to go further in cell-cycle progression. The presence of many structures suggested microtubule enucleation, centrosomes-like were detected on treated cells and could be responsible for the multi-spindle assembling that leads the multinucleated cells to abnormal divisions. Later on, when the multinucleated cells accumulated more abnormalities they were eliminated from the cell population by apoptosis.

A instabilidade cromossômica e a aneuploidia são características associadas às células malignas. Sabe-se que essas alterações podem ser resultantes de erros em eventos durante a mitose. Com o objetivo de gerar uma população com ganho de ploidia, utilizamos dois inibidores de fases distintas da mitose. Resultando no aumento da frequência celular em G2/M, ou seja, células com 4 vezes o número de cromossomos (4C) e de células com DNA acima de 4, hipertetraploide. Quantificamos a quantidade de núcleos e demonstramos que o tratamento, especificamente, levou a uma NCI, e não a multinucleação. Ambas linhagens celulares submetidas ao tratamento apresentaram alterações morfológicas, como protrusões de membrana, indicando alterações no citoesquelto. Nas análises de mRNA e da expressão proteica, observamos alterações na regulação da actina, coincidindo com a elevação dos mRNAs de YAP/TAZ, efetores co-transcricionais da via Hippo, regulada por alterações no citoesqueleto de actina. Desde modo, propomos, que o tratamento utilizado é um método eficiente para o estudo de células aneuploides e da NCI, que o citoesqueleto de actina é modulado por esse fenótipo e requer YAP/TAZ, provavelmente para manter a sobrevivência e favorecer a proliferação celular observada após o tratamento. / Chromosomal instability and aneuploidy are characteristics associated with malignant cells. It is known that these changes may be due to errors in events during mitosis. In order to generate a population with gain of ploidy, we used two inhibitors of distinct phases of mitosis. Resulting in increasing cell frequency in G2/M, cells with 4 times the number of chromosomes (4C) and cells with DNA above 4, hypertetraploid. We quantified the number of nuclei and demonstrated that the treatment specifically led to NCI, not multinucleation. Both cell lines submitted to treatment presented morphological alterations, such as membrane protrusions, indicating changes in the cytoskeleton. In the analysis of mRNA and protein expression, we observed alterations in actin regulation, coinciding with the elevation of YAP / TAZ mRNAs, co-transcriptional effectors of the Hippo signaling pathway, regulated by changes in the actin cytoskeleton. We propose, that the treatment used is an efficient method for the study of aneuploid cells as well NCI. Also, the actin cytoskeleton is modulated by that phenotype which requires high YAP / TAZ, probably to maintain cell survival and promote cell proliferation observed.

Gliomas são tumores altamente invasivos, resistentes aos tratamentos disponíveis atualmente e com alta taxa de mortalidade. A superexpressão de RECK na linhagem de glioma humano T98G comprometeu a capacidade das células de migrar e invadir in vitro, com rearranjo do citoesqueleto e alteração na distribuição espacial de FAK fosforilado. Entretanto, o possível mecanismo envolvido na inibição da migração mediada por RECK não foi desvendado. Para estudarmos os mecanismos envolvidos nesta alteração da capacidade migratória, as células T98G foram transfectadas com o vetor plasmidial pCXN2-hRECK (RECK+). A via das integrinas, a atividade de alguns membros da família das RhoGTPases e elementos do citoesqueleto foram avaliados através de imunoblotting, imunomarcação e ensaios de pull-down para as células RECK+ em comparação com células T98G não-transfectadas (WT), células T98G transfectadas com vetor pCXN2 na ausência do gene RECK (vetor) e fibroblastos primários humanos (FF287). Nossos resultados mostram um aumento na expressão de integrina β1 e uma diminuição da fosforilação de FAK no sítio de auto-fosforilação Tyr397 que, juntamente com o aumento das fibras de estresse e a diminuição dos lamelipódios, sugerem um fenótipo menos migratório da célula. Porém, quando avaliada a atividade de Rac1, esta se mostrou aumentada, embora uma das vias de ativação de Rac1 seja através da fosforilação de FAK levando à formação dos lamelipódios. A hipótese é que RECK inibe a quebra das adesões focais que participam do processo de migração, dificultando a mobilidade celular. Como as células continuam recebendo o estímulo para migrar, estas ativam Rac1 através de uma via independente de FAK. Além disso, a imunomarcação de paxilina mostrou um aumento no tamanho das adesões focais nas células RECK+, indicando que RECK pode influenciar nas estruturas responsáveis pelo contato célula-matriz. / Gliomas are highly invasive, treatment-resistant and lethal tumors. Overexpression of RECK in human glioma cell line T98G decreased cell migration and invasion in vitro, lead to cytoskeleton rearrangement and caused changes in phospho-FAK distribution. However, the pathway involved in RECK-mediated inhibition of cell migration has not been elucidated yet. To study the mechanisms by which RECK affects cell motility, T98G cells were transfected with pCXN2-hRECK vector (RECK+). Some proteins involved in the integrin pathway, activity of some proteins of RhoGTPase family and cytoskeleton proteins were analyzed through immunoblotting, immunostaining and pull-down assay in RECK+ cells and compared with non-transfected T98G cells, T98G transfected with pCXN2 without RECK gene and human primary fibroblasts (FF287). Our results showed an increase in integrin β1 expression and a decrease in FAK phosphorylation in the Tyr397 site, which together with the increase of stress fibers and decrease of lamellipodia, suggest a less migratory phenotype. Despite this, Rac1 activity was increased even though one of Rac activation pathways is through phospho-FAK, leading to lamellipodium formation. Our hypotheses is that RECK affects focal adhesion turnover, diminishing cell motility. As cells are still receiving a positive signal to migrate, they activate Rac1 through a FAK-independent pathway. Besides that, paxillin immunostaining showed that focal adhesions are larger in RECK+ cells, indicating that RECK can influence structures related with cell-matrix contact.

FtsZ é homóloga de tubulina, presente em quase todas as bactérias, que se autoassocia em filamentos que formam uma estrutura chamada anel Z dentro das células. O anel Z quando formado recruta de um macrocomplexo proteico chamado divisomo, que é responsável pela síntese do septo de divisão, formando duas células filhas. Diversos moduladores se ligam diretamente a FtsZ regulam sua polimerização, controlando o momento e o local onde o anel Z é formado. MciZ é um peptídeo de 40 aminoácidos expresso durante a esporulação de Bacillus subtilis e inibe a formação do do anel Z na célula mãe. O objetivo do presente trabalho foi estudar a interação entre as proteínas FtsZ e MciZ e investigar os mecanismos envolvidos na inibição da polimerização de FtsZ por MciZ. Através de uma triagem genética, usando uma biblioteca de mutantes de ftsZ, identificamos treze mutações em ftsZ que conferiram resistência à superexpressão de MciZ in vivo. Sete delas eram capazes de crescer na presença e na ausência da superexpressão de MciZ e as outras seis se mostraram dependentes da superexpressão de MciZ. A partir da coexpressão e copurificação do complexo FtsZ:MciZ, observamos que todas as proteínas mutantes ainda continuavam interagindo com MciZ in vitro. O Kd estimado para a interação entre as proteínas foi de 150±50nM, e mostrou-se que MciZ não se liga nem ao CTP (C-Terminal Peptide) de FtsZ, nem compete com GTP para a ligação no mesmo sítio. Usando construções truncadas de MciZ, determinou-se que o N-terminal da proteína (resíduos 1 ao 27) é suficiente para inibição. A partir das estruturas tridimensionais de MciZ (RMN) e do complexo FtsZ:MciZ (cristalografia de raios x), determinou-se que MciZ é um peptídeo desenovelado, que assume uma estrutura terciária ao interagir através da sua α-hélice H2 e folha-β B2 com a α-hélice H10 e a folha-β S9 de FtsZ. MciZ mostrou-se capaz de reduzir o tamanho dos protofilamentos de FtsZ de forma subestequiométrica, gerando fragmentos menores de filamentos. Proporções de MciZ:FtsZ de 1:10 foram suficientes para extinguir completamente o anel Z, confirmando a inibição subestequiométrica também in vivo. A conservação da inibição da fusão FtsZ-MciZ e a cinética de despolimerização de FtsZ induzida por MciZ provaram que MciZ não é um simples sequestrador. Marcações fluorescentes de MciZ sugeriram que o peptídeo é capaz de interagir com o anel Z in vivo, e também decorar feixes de FtsZ in vitro, formando focos localizados frequentemente na ponta dos filamentos. Cossedimentações com polímeros de FtsZ mostraram a presença de MciZ ou da fusão FtsZ-MciZ. Apesar de MciZ induzir o aumento da atividade GTPáscia específica de FtsZ, a ausência de hidrólise de GTP não eliminou o efeito subestequiométrico de MciZ. Nossos resultados em conjunto mostram que MciZ é um capeador dos filamentos de FtsZ, bloqueando a elongação pela ponta menos e bloqueando o anelamento entre protofilamentos / FtsZ is a tubulin-like protein present in most bacteria, that self-assembles into filaments forming a structure known as Z-ring in the cells. Following formation, the Z- ring recruits a protein macrocomplex, the divisome, which is responsible by the division septum synthesis, resulting in two daughter cells. Many modulators interact directly to FtsZ, regulating its polymerization and controlling the time and place of the Z-ring formation. MciZ is a 40-amino-acid peptide that is expressed during sporulation in Bacillus subtilis and inhibits the formation of the Z-ring in the mother-cell. The aim of this work was to study the interaction between FtsZ and MciZ proteins, and to investigate the mechanisms involved in FtsZ inhibition by MciZ. Applying a genetic screening, using an ftsZ mutant library, we identified 13 mutations on ftsZ that conferred resistance to MciZ overexpression in vivo. Seven of them were able to grow either in the presence or absence of MciZ overexpression, and the other six showed to be dependent on it. With the co-expression and co-purification of the FtsZ:MciZ complex, we observed all mutant proteins still interact with MciZ in vitro. Estimated Kd for the interaction was 150±50nM, and it was demonstrated that MciZ does not bind to FtsZ CTP (C-Terminal Peptide), nor does it compete with GTP for the same binding site. Using truncated versions of MciZ, it was determined that its N-terminal (residues 1 to 27) is sufficient for the inhibition. Based on the tridimensional structure of MciZ (NMR) and of the FtsZ:MciZ complex (x- ray crystallography), it was determined that MciZ is an unstructured peptide that assumes a tertiary structure by interacting with FtsZ α-helix H10 and β-sheet S9 through its α-helix H2 and β-sheet B2. MciZ was able to reduce the size of FtsZ protofilaments in a substoichiometric manner, generating smaller fragmented filaments. 1:10 ratios of MciZ:FtsZ were sufficient to completely extinguish the Z-ring, thus confirming the substoichiometric inhibition in vivo as well. The inhibition of FtsZ polymerization by the FtsZ-MciZ fusion and the FtsZ depolymerization kinetics induced by MciZ proved that MciZ is not a simple sequesterer. Fluorescent dyeing of MciZ suggests the peptide is able to interact with the Z-ring in vivo, as well as decorate FtsZ bundles in vivo, forming localized spots frequently at the filaments\' ends. Co- sedimentations with FtsZ polymers showed the presence of MciZ or of the FtsZ-MciZ fusion. Despite MciZ-induced increase in specific GTPase activity of FtsZ, the lack of GTP hydrolysis did not eliminate the substoichiometric effect of MciZ. Combined, our results show that MciZ is an FtsZ filament capper, blocking elongation at the minus end and blocking the annealing between protofilaments

FtsZ é homóloga de tubulina, presente em quase todas as bactérias, que se autoassocia em filamentos que formam uma estrutura chamada anel Z dentro das células. O anel Z quando formado recruta de um macrocomplexo proteico chamado divisomo, que é responsável pela síntese do septo de divisão, formando duas células filhas. Diversos moduladores se ligam diretamente a FtsZ regulam sua polimerização, controlando o momento e o local onde o anel Z é formado. MciZ é um peptídeo de 40 aminoácidos expresso durante a esporulação de Bacillus subtilis e inibe a formação do do anel Z na célula mãe. O objetivo do presente trabalho foi estudar a interação entre as proteínas FtsZ e MciZ e investigar os mecanismos envolvidos na inibição da polimerização de FtsZ por MciZ. Através de uma triagem genética, usando uma biblioteca de mutantes de ftsZ, identificamos treze mutações em ftsZ que conferiram resistência à superexpressão de MciZ in vivo. Sete delas eram capazes de crescer na presença e na ausência da superexpressão de MciZ e as outras seis se mostraram dependentes da superexpressão de MciZ. A partir da coexpressão e copurificação do complexo FtsZ:MciZ, observamos que todas as proteínas mutantes ainda continuavam interagindo com MciZ in vitro. O Kd estimado para a interação entre as proteínas foi de 150±50nM, e mostrou-se que MciZ não se liga nem ao CTP (C-Terminal Peptide) de FtsZ, nem compete com GTP para a ligação no mesmo sítio. Usando construções truncadas de MciZ, determinou-se que o N-terminal da proteína (resíduos 1 ao 27) é suficiente para inibição. A partir das estruturas tridimensionais de MciZ (RMN) e do complexo FtsZ:MciZ (cristalografia de raios x), determinou-se que MciZ é um peptídeo desenovelado, que assume uma estrutura terciária ao interagir através da sua α-hélice H2 e folha-β B2 com a α-hélice H10 e a folha-β S9 de FtsZ. MciZ mostrou-se capaz de reduzir o tamanho dos protofilamentos de FtsZ de forma subestequiométrica, gerando fragmentos menores de filamentos. Proporções de MciZ:FtsZ de 1:10 foram suficientes para extinguir completamente o anel Z, confirmando a inibição subestequiométrica também in vivo. A conservação da inibição da fusão FtsZ-MciZ e a cinética de despolimerização de FtsZ induzida por MciZ provaram que MciZ não é um simples sequestrador. Marcações fluorescentes de MciZ sugeriram que o peptídeo é capaz de interagir com o anel Z in vivo, e também decorar feixes de FtsZ in vitro, formando focos localizados frequentemente na ponta dos filamentos. Cossedimentações com polímeros de FtsZ mostraram a presença de MciZ ou da fusão FtsZ-MciZ. Apesar de MciZ induzir o aumento da atividade GTPáscia específica de FtsZ, a ausência de hidrólise de GTP não eliminou o efeito subestequiométrico de MciZ. Nossos resultados em conjunto mostram que MciZ é um capeador dos filamentos de FtsZ, bloqueando a elongação pela ponta menos e bloqueando o anelamento entre protofilamentos / FtsZ is a tubulin-like protein present in most bacteria, that self-assembles into filaments forming a structure known as Z-ring in the cells. Following formation, the Z- ring recruits a protein macrocomplex, the divisome, which is responsible by the division septum synthesis, resulting in two daughter cells. Many modulators interact directly to FtsZ, regulating its polymerization and controlling the time and place of the Z-ring formation. MciZ is a 40-amino-acid peptide that is expressed during sporulation in Bacillus subtilis and inhibits the formation of the Z-ring in the mother-cell. The aim of this work was to study the interaction between FtsZ and MciZ proteins, and to investigate the mechanisms involved in FtsZ inhibition by MciZ. Applying a genetic screening, using an ftsZ mutant library, we identified 13 mutations on ftsZ that conferred resistance to MciZ overexpression in vivo. Seven of them were able to grow either in the presence or absence of MciZ overexpression, and the other six showed to be dependent on it. With the co-expression and co-purification of the FtsZ:MciZ complex, we observed all mutant proteins still interact with MciZ in vitro. Estimated Kd for the interaction was 150±50nM, and it was demonstrated that MciZ does not bind to FtsZ CTP (C-Terminal Peptide), nor does it compete with GTP for the same binding site. Using truncated versions of MciZ, it was determined that its N-terminal (residues 1 to 27) is sufficient for the inhibition. Based on the tridimensional structure of MciZ (NMR) and of the FtsZ:MciZ complex (x- ray crystallography), it was determined that MciZ is an unstructured peptide that assumes a tertiary structure by interacting with FtsZ α-helix H10 and β-sheet S9 through its α-helix H2 and β-sheet B2. MciZ was able to reduce the size of FtsZ protofilaments in a substoichiometric manner, generating smaller fragmented filaments. 1:10 ratios of MciZ:FtsZ were sufficient to completely extinguish the Z-ring, thus confirming the substoichiometric inhibition in vivo as well. The inhibition of FtsZ polymerization by the FtsZ-MciZ fusion and the FtsZ depolymerization kinetics induced by MciZ proved that MciZ is not a simple sequesterer. Fluorescent dyeing of MciZ suggests the peptide is able to interact with the Z-ring in vivo, as well as decorate FtsZ bundles in vivo, forming localized spots frequently at the filaments\' ends. Co- sedimentations with FtsZ polymers showed the presence of MciZ or of the FtsZ-MciZ fusion. Despite MciZ-induced increase in specific GTPase activity of FtsZ, the lack of GTP hydrolysis did not eliminate the substoichiometric effect of MciZ. Combined, our results show that MciZ is an FtsZ filament capper, blocking elongation at the minus end and blocking the annealing between protofilaments

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:22:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_AdrianadaSilvaSantos_D.pdf: 10849571 bytes, checksum: 5933b39c78d15eee6a1a067f3e9cd55b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A identificação e caracterização estrutural e funcional de genes diferencialmente expressos entre tecidos tumorais e normais constituem etapas fundamentais para permitir a compreensão do processo neoplásico e o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e verificar sua função nos processos celulares. Neste estudo foi demonstrado que o gene ANKHD1localiza-se no cromossomo 5, possui vários transcritos variantes possivelmente gerados por mecanismos de clivagem alternativa e codifica proteínas com domínios de repetições de anquirina. A região promotora desse gene possui vários elementos regulatórios importantes como sítios de ligação ao fator de transcrição GATA-1 e sequências ricas em dinucleotídeos CG, as ilhas CpG. A expressão do gene ANKHD1 e de algumas de suas variantes em tecidos normais e em linhagens de células neoplásicas foi detectada em intensidades variáveis. Em modelos de diferenciação e proliferação celular foi demonstrado o aumento da expressão desse gene ao longo desses processos. No entanto durante o processo de apoptose observou-se diminuição na expressão de ANKHD1 e transcritos variantes. Em células de pacientes diagnosticados com Síndrome Mielodisplásica (SMD) foi constatada baixa expressão de ANKHD1. Durante a diferenciação eritróide de células CD34+ obtidas de medula óssea desses pacientes não foi observado o aumento da expressão do gene ANKHD1 e do fator de transcrição GATA-1 como era esperado. As células mononucleares de pacientes com SMD tratadas com decitabina, um agente desmetilante, apresentaram aumento na expressão do gene ANKHD1 em comparação às células não tratadas. O mesmo foi observado em células CD34+ tratadas durante a diferenciação eritróide. No entanto em células de pacientes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e com Mieloma Múltiplo (MM), caracterizadas pela proliferação e resistência aos mecanismos de apoptose, foi demonstrada a alta expressão do gene ANKHD1 e de seus transcritos variantes. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada através de Western Blotting, em células da linhagem de MM denominada RPMI 8226. Foi observada a diminuição da expressão do gene ANKHD1 nessas células quando induzidas ao processo de apoptose por dexametasona. Em conclusão o presente estudo identificou ANKHD1 e alguns de seus transcritos variantes como um novo gene com perfis de expressão variados em células hematopoéticas normais e neoplásicas, demonstrou seu envolvimento em processos celulares básicos à manutenção da homeostase e a sua associação com SHP2 em Mieloma Múltiplo. ANKHD1 pode estar envolvida com o fenótipo anormal da célula neoplásica através de uma possível função na via da apoptose. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia de neoplasias, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e neoplásicas. / Abstract: The identification and the structural and functional characterization of genes differentially expressed between tumors and normal tissues are fundamental steps towards the understanding of the neoplastic process and the development of new anti-cancer strategies. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, the expression pattern and function of ANKHD1 have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene expression pattern of ANKHD1 in normal and leukemic hematopoietic cells and to determine their function in cellular process.This study has demonstrated that the ANKHD1 gene is located on chromosome 5, this gene has several possible variant transcripts generated by splicing alternative mechanisms and encodes proteins with domains of ankyrin repeats. The promoter region of this gene has several regulatory elements such as the transcription factor GATA-1 binding sites and rich sequences in dinucleotide CG, CpG islands.The expression of the ANKHD1 gene and some of the gene's variants in normal tissues and neoplastic cell lines was detected in different intensities. The increase in the expression of this gene was demonstrated using cellular differentiation and proliferation models. However, during the process of apoptosis, a decrease in the expression of ANKHD1 transcripts variants was observed. In the cells of patients with myelodysplastic syndrome (MDS), a low expression of ANKHD1 was observed. During erythroid differentiation of CD34+ cells obtained from the bone marrow of these patients, no increase in the expression of ANKHD1 gene and transcription factor GATA-1 was observed, as expected. The mononuclear cells of MDS patients were treated with decitabine, a demethylation agent, and showed an increase in the ANKHD1 gene expression compared to untreated cells. The same was observed in CD34+ cells treated during erythroid differentiation. However in cells of acute myeloid leukemia (AML) or Multiple Myeloma (MM) patients, characterized by proliferation and resistance mechanisms of apoptosis, the high expression of gene transcripts ANKHD1 and its variants was demonstrated. The association of SHP2 with ANKHD1 was identified by Western Blot in RPMI 8226 MM cell line. A decrease in the ANKHD1 gene expression in these cells when the process of apoptosis was induced by dexamethasone was observed. In conclusion, this study identified ANKHD1 and some of gene's transcripts variants as a new gene with a variable expression profile in normal and neoplastic hematopoietic cells. The study has also demonstrated the involvement of the ANKHD1 in basic cellular processes, which maintain homeostasis and the association of ANKHD1 with SHP2 in multiple myeloma. ANKHD1 may be involved with the abnormal phenotype of tumor cells through a possible role in the apoptosis pathway. The findings herein described suggest that ANKHD1 could be a molecular target for neoplasic disease therapy and could guide further studies towards a better elucidation of the specific functions of ANKHD1 in normal and neoplasic hematopoietic cells. / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Gliomas são tumores altamente invasivos, resistentes aos tratamentos disponíveis atualmente e com alta taxa de mortalidade. A superexpressão de RECK na linhagem de glioma humano T98G comprometeu a capacidade das células de migrar e invadir in vitro, com rearranjo do citoesqueleto e alteração na distribuição espacial de FAK fosforilado. Entretanto, o possível mecanismo envolvido na inibição da migração mediada por RECK não foi desvendado. Para estudarmos os mecanismos envolvidos nesta alteração da capacidade migratória, as células T98G foram transfectadas com o vetor plasmidial pCXN2-hRECK (RECK+). A via das integrinas, a atividade de alguns membros da família das RhoGTPases e elementos do citoesqueleto foram avaliados através de imunoblotting, imunomarcação e ensaios de pull-down para as células RECK+ em comparação com células T98G não-transfectadas (WT), células T98G transfectadas com vetor pCXN2 na ausência do gene RECK (vetor) e fibroblastos primários humanos (FF287). Nossos resultados mostram um aumento na expressão de integrina β1 e uma diminuição da fosforilação de FAK no sítio de auto-fosforilação Tyr397 que, juntamente com o aumento das fibras de estresse e a diminuição dos lamelipódios, sugerem um fenótipo menos migratório da célula. Porém, quando avaliada a atividade de Rac1, esta se mostrou aumentada, embora uma das vias de ativação de Rac1 seja através da fosforilação de FAK levando à formação dos lamelipódios. A hipótese é que RECK inibe a quebra das adesões focais que participam do processo de migração, dificultando a mobilidade celular. Como as células continuam recebendo o estímulo para migrar, estas ativam Rac1 através de uma via independente de FAK. Além disso, a imunomarcação de paxilina mostrou um aumento no tamanho das adesões focais nas células RECK+, indicando que RECK pode influenciar nas estruturas responsáveis pelo contato célula-matriz. / Gliomas are highly invasive, treatment-resistant and lethal tumors. Overexpression of RECK in human glioma cell line T98G decreased cell migration and invasion in vitro, lead to cytoskeleton rearrangement and caused changes in phospho-FAK distribution. However, the pathway involved in RECK-mediated inhibition of cell migration has not been elucidated yet. To study the mechanisms by which RECK affects cell motility, T98G cells were transfected with pCXN2-hRECK vector (RECK+). Some proteins involved in the integrin pathway, activity of some proteins of RhoGTPase family and cytoskeleton proteins were analyzed through immunoblotting, immunostaining and pull-down assay in RECK+ cells and compared with non-transfected T98G cells, T98G transfected with pCXN2 without RECK gene and human primary fibroblasts (FF287). Our results showed an increase in integrin β1 expression and a decrease in FAK phosphorylation in the Tyr397 site, which together with the increase of stress fibers and decrease of lamellipodia, suggest a less migratory phenotype. Despite this, Rac1 activity was increased even though one of Rac activation pathways is through phospho-FAK, leading to lamellipodium formation. Our hypotheses is that RECK affects focal adhesion turnover, diminishing cell motility. As cells are still receiving a positive signal to migrate, they activate Rac1 through a FAK-independent pathway. Besides that, paxillin immunostaining showed that focal adhesions are larger in RECK+ cells, indicating that RECK can influence structures related with cell-matrix contact.

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O estudo de agentes que interferem no funcionamento das proteínas relacionadas com o ciclo celular é importante para a compreensão dos processos de transformação e de morte celular. Alterações de ploidia, embora presentes na maioria dos tumores humanos, não têm ainda seu papel conhecido no processo de oncogênese. A alteração do número cromossômico é conseqüência primária de erros que envolvem o fuso mitótico e o cinetócoro. Dessa maneira, drogas que agem sobre os microtúbulos são consideradas aneugênicas potenciais. O presente trabalho enfocou o estudo do mecanismo pelo qual drogas que atuam sobre microtúbulos levam ao aparecimento de células multinucleadas e o significado biológico destas. Os resultados mostraram que a vincristina induziu bloqueio em mitose das células BBnt e MDCK, com conseqüente entrada em interfase no estado multinucleado. As células multinucleadas não apresentaram sinais de morte celular por apoptose, entretanto, quando em prófase apresentaram vários centrossomos, que poderiam originar divisões celulares com fusos multipolares. Estes resultados indicam que essas linhagens celulares possuem pontos de checagem mitótico funcionais e células multinucleadas são viáveis e capazes de prosseguir no ciclo celular. A presença de mitoses com fusos multipolares é indício de que as células multinucleadas passam por divisões anormais, que progrediriam para apoptose resultando na eliminação desta população. / The study of agents that interfere in the functionality of proteins related to cell cycle is important for the understanding of the transformation and cell death processes. Although ploidy alterations are presented in the majority of human tumors, their role in oncogenic process is not understood yet. The alteration on chromosomal number is the primary consequence of errors involving the mitotic spindle and kinetocore. Thus, drugs acting on the microtubules are considered as potentially aneugenic agents. The present work aimed to study the mechanism of multinucleated cells induction by action of antimicrotubule drug and biological meaning of these cells. The results showed that vincristine induced mitotic arrest of both BBnt and MDCK cells, with consequent entrance into interphasic-multinucleated status. Multinucleated cells did not present features of cell death by apoptosis; they were still viable and able to go further in cell-cycle progression. The presence of many structures suggested microtubule enucleation, centrosomes-like were detected on treated cells and could be responsible for the multi-spindle assembling that leads the multinucleated cells to abnormal divisions. Later on, when the multinucleated cells accumulated more abnormalities they were eliminated from the cell population by apoptosis.