INTRODUÇÃO: A Síndrome de Sézary (SS) é um linfoma cutâneo de células T (LCCT), caracterizado por eritrodermia, linfadenopatia generalizada e presença de células tumorais na pele, linfonodos e sangue periférico. Os linfócitos TCD8+ têm papel fundamental na resposta imune antitumoral, entretanto, há escassos estudos evidenciando seu perfil fenotípico e funcional. Considerando que a resposta imunológica do paciente com SS está suprimida, estratégias para potencializar a imunidade inata e adaptativa com agonistas de receptores Toll-like (TLRs) têm sido exploradas. OBJETIVO: Caracterizar o perfil de marcadores de ativação/inibição das células TCD8+, seus estágios de diferenciação, capacidade de resposta a IL-7/IL-15 e ao agonista de TLR7/TLR8 de pacientes com SS. METODOLOGIA: Foram selecionados 15 pacientes com SS (7 homens e 8 mulheres) com 48-85 anos do Ambulatório de Linfomas Cutâneos, do HC-FMUSP, e um grupo de controle com 24 indivíduos sadios. A análise de marcadores de ativação/inibição e diferenciação celular em células TCD4/TCD8+ do sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. A expressão de marcadores extracelulares e citocinas intracelulares em células mononucleadas do sangue periférico (CMN) após estimulação com o agonista de TLR7/TLR8 foi analisada por citometria de fluxo. Além disto, o efeito de IL-7 e IL-5 em células T foi avaliado pela fosforilação de STAT5, na capacidade de proliferação mitogênica e expressão de BCL-2 em CMNs, como também pelos níveis séricos de IL-7 por citometria de fluxo. RESULTADOS: Os pacientes com SS mostram perfil fenotípico de ativação crônica nos linfócitos TCD8+ periféricos, decorrente do elevadopercentual de células TCD8+ CD38+, redução percentual de TCD8+ CD127+ (IL-7R) e da população naive. Além disso, ocorreu aumento de expressão de PD-1 na população naive de células TCD8+. O marcador de ativação, CD26, até então apenas relacionado com linfócitos TCD4, foi detectado em reduzida percentagem de linfócitos TCD8. A resposta para IL-7/IL-15 parece estar funcionalmente presente tanto nos linfócitos TCD4 quanto nos linfócitos TCD8. Contudo, foi encontrado um perfil diferenciado e heterogêneo de fosforilação de STAT5 assim como de expressão de BCL-2 nos linfócitos TCD8+ de pacientes com SS. O nível sérico de IL-7 reduzido dos pacientes com SS foi inversamente correlacionado com o número absoluto de linfócitos TCD4+. CONCLUSÃO: Os linfócitos TCD8+ dos pacientes com SS encontram-se reduzidos em números absolutos, e possuem um perfil alterado de diferenciação celular e expressão de marcadores extracelulares. A redução percentual da população de TCD8+ naive associada com a presença de moléculas de ativação crônica mostra um perfil de imunosenescência. As células TCD8+ exibem baixa capacidade de resposta aos ligantes de TLR intracelulares, provavelmente devido ao perfil de ativação crônica. Além disso, há resposta parcial dos linfócitos TCD8+ às citocinas ligantes do receptor yc. Nossos resultados evidenciam alterações em linfócitos TCD8+ que debilitam a resposta imune antitumoral e que pode contribuir com a patogênese da síndrome de Sézary / INTRODUCTION: Sézary syndrome (SS) is a cutaneous T cell lymphoma (CTCL), characterized by erythroderma, generalized lymphadenopathy and the presence of tumor cells in the skin, lymph nodes and peripheral blood. The TCD8+ lymphocytes play a key role in anti-tumor immune response, whereas, there are few studies showing its phenotypic and functional profile in SS. Considering that the immune response of SS patient is suppressed, strategies to enhancing the innate and adaptive immunity by Toll-like receptors (TLRs) agonists have been explored. OBJECTIVE: To characterize the profile of activation/inhibition markers of CD8+ T cells, their stages of differentiation, ability of response to IL-7/IL-15 and TLR7/TLR8 agonist of patients with SS. METHODOLOGY: Fifteen SS patients were enrolled (7 men and 8 woman) with 48-85 years from the Clinic of Cutaneous Lymphomas, HC-FMUSP, and a control group of 24 healthy individuals. Analysis of activation/inhibition markers and cellular differentiation in CD4/CD8 T cells from peripheral blood were assessed by flow cytometry. The expression of extracellular markers and intracellular cytokines in mononuclear cells in the peripheral blood (CMN) were evaluated by flow cytometry. Moreover, the effect of IL-7 and IL-15 stimulation in T cells was assessed by the STAT5 phosphorylation, proliferative mitogenic capacity, BCL-2 expression in CMNs as well as serum IL-7 levels by flow cytometry. RESULTS: Patients with SS show a phenotypic CD8 T peripheral lymphocytes profile of chronic activation, due to the high percentage of CD8+CD38+ T cells, reduced percentage of CD8+CD127+ (IL-7R) and naïve population. Furthermore, it was observed an increased PD-1 expression in the naïve CD8+ T cells. The activation marker CD26, previously only associated with CD4 T lymphocyte, was detected at decreased percentage in CD8 T lymphocytes. The TLR7/TLR8 agonist did not affect the IFN-? and TNF secretion of CD8 T lymphocytes of SS patients, in contrast to the control group. The response to IL-7/IL-15 appears to be functional in both CD4 and CD8 T lymphocytes. However, it was founded a differentiated and heterogeneous profile of STAT5 phosphorylation and Bcl-2 expression in the CD8 T lymphocytes in SS patients. The reduced IL-7 serum of patients with SS was inversely correlated with the absolute number of CD4 T lymphocytes. CONCLUSION: CD8 T lymphocytes of patients with SS are reduced in absolute numbers, and show an altered cellular differentiation profile and extracellular markers expression. The reduced percentage of CD8 naïve population associated with chronic activation of molecules reveals an immunosenescence profile. The CD8 T cells exhibit low ability to ligands of intracellular TLR receptors, probably due to chronic activation profile. In addition, there are partial response of CD8 T lymphocytes to the cytokine receptor ?c. Our results show disturbance in CD8 T lymphocytes that may impair the anti-tumor response contributing to the pathogenesis of Sézary syndrome

Flow cytometry (FCM) is a well established technique used for enumeration and characterization of marine biological particles, which fulfills the scientific demands of rapid cell counting automation. FCM allows the discrimination of pico- and nanoplankton populations regarding its abundance, cell size, and pigment content both by natural or induced fluorescence. The cyanobacterium Prochlorococcus is widespread in the euphotic zone of the tropical and subtropical oceans, and is considered the smallest and most abundant photosynthetic organism in the planet. Synechococcus, other important cyanobacterium genus present in the picoplankton, is highly diverse and is widely distributed in marine ecosystems from cold and mesotrophic, to warm, open ocean oligotrophic waters. Photosynthetic pico- and nanoeukaryotes display a range of physiologies and life strategies. Although its abundance is generally lower, the larger cell size leads to a significant contribution to the epipelagic community biomass. In this thesis I aimed to investigate the abundance and carbon biomass distribution of heterotrophic bacteria, Prochlorococcus, Synechococcus, autotrophic pico- and nanoeukaryotes in the Southwest Atlantic Ocean off Brazil, their relation to the different water masses and the influence of hydrodynamic (South Atlantic Central Water intrusion) and biological processes (Trichodesmium spp. and Mesodinium rubrum blooms) on such distributions. / A citometria de fluxo (FCM, sigla em inglês) é uma técnica bem estabelecida, usada para enumeração e caracterização de partículas biológicas marinhas, a qual supre a demanda científica por automação rápida de contagem de células. A FCM permite a discriminação de populações pico- e nanoplanctônicas no que concerne à sua abundância, tamanho de célula e pigmentação, tanto por fluorescência natural ou induzida. A cianobactéria Prochlorococcus é amplamente disseminada pela zona eufótica dos oceanos tropicais e subtropicais, sendo considerada o menor e mais abundante organismo fotossintético do planeta. Synechococcus, outro importante gênero de cianobactérias presente no picoplâncton, é diverso e amplamente distribuído em ecossistemas marinhos, de águas frias e mesotróficas à regiões oceânicas quentes e de águas oligotróficas. Pico- e nanoeucariotos fotossintéticos apresentam uma grande variedade de fisiologias e estratégias de vida. Embora a abundância destes grupos seja geralmente menor, o maior tamanho de suas células resulta numa contribuição significante dos mesmos para a biomassa da comunidade epipelágica. Na presente tese eu objetivei investigar a abundância e a distribuição da biomassa de carbono de bactérias heterotróficas, Prochlorococcus, Synechococcus, pico- e nanoeucariotos autotróficos no sudoeste do Oceano Atlântico ao largo do Brasil, sua relação com as diferentes massas d\'água e a influência de processos hidrodinâmicos (como a intrusão da Água Central do Atlântico Sul) e biológicos (florações de Trichodesmium spp. e Mesodinium rubrum) em tais distribuições.

A atividade do sistema nervoso central (SNC) afeta aquela do sistema imune e esta por sua vez, através de produtos originados em células imunes, como por exemplo, as citocinas modificam a atividade cerebral e, portanto, alguns comportamentos. O ato de conviver com pessoas portadoras de um tumor ou de patologias crônicas debilitantes tem sido estudado por vários pesquisadores, os quais têm relatado evidencias que mostram ser algumas condições psicológicas experimentadas por ?caregivers? associadas com variações de comportamento e de imunidade. Manifestações de estresse têm sido intensamente estudadas nestas pessoas. Neste sentido, e guardado os devidos cuidados com as extrapolações, não existe um modelo animal especificamente desenvolvido para analisar, em laboratório, as eventuais alterações imunes que possam ocorrer em animais que convivem com um outro doente. Este foi o objeto do presente trabalho. Mais especificamente, avaliou-se a existência de uma possível interação neuroimune em camundongas que coabitaram com outras portadoras de um tumor de Ehrlich, através da análise de parâmetros hematológicos, imunológicos, hormonais, comportamentais e neuroquímicos. Os resultados obtidos mostraram que a convivência por 11 dias com um animal portador do tumor de Ehrlich produziu em camundongas: 1) leucopenia; 2) diminuição do burst oxidativo induzido por PMA e por S. aureus e da porcentagem e, também da intensidade de fagocitose de neutrófilos sanguíneos; 3) aumento do burst oxidativo e redução da porcentagem, mas não alterou a intensidade de fagocitose de macrófagos ativados pelo ONCO-BCG; 4) diminuição da resistência ao crescimento de um tumor de Ehrlich, isto é, aumentou a concentração de células tumorais/ml de líquido ascítico e o número total de células tumorais; 5) redução do número de leucócitos circulantes em animais inoculados com o tumor de Ehrlich; 6) diminuição dos níveis hipotalâmicos de noradrenalina e aumento daqueles de dopamina e de MHPG; 7) aumento do ?turnover? de noradrenalina no hipotálamo e de dopamina no córtex frontal; 8) aumento dos efeitos da anfetamina sobre alguns parâmetros da atividade locomotora dos animais observados no campo aberto; 9) potenciou os efeitos de um tratamento com diazepam, reduzindo ainda mais o burst oxidativo induzido por PMA e por S. aureus assim como os efeitos do fármaco sobre a porcentagem e a intensidade de fagocitose de neutrófilos sanguíneos. No entanto, esta convivência não modificou a média do número de eritrócitos, a porcentagem do hematócrito e o volume corpuscular médio, assim como a atividade de macrófagos peritoneais residentes e, não interferiu com os níveis de corticosterona sérica dos animais. Em seu conjunto, os presentes resultados mostraram que a convivência com animais portadores de um tumor ascítico de Ehrlich produziu alterações comportamentais, neuroquímicas e imunológicas, que guardam grande similaridade com sinais e sintomas relatados em caregivers. Estas alterações foram interpretadas como decorrentes de uma situação de estresse psicológico prolongado vivenciado pelas camundongas companheiras de conspecíficas portadoras de um tumor. Mais especificamente, postulou-se, neste trabalho, sejam as alterações observadas decorrentes de um aumento de atividade catecolaminérgica no SNC e/ou de ativação do SNAS. A semelhança dos resultados obtidos em companheiras de animais doentes com aqueles de caregivers permitiu sugerir, tomados os devidos cuidados com extrapolações, seja o modelo experimental agora usado de alguma utilidade para a compreensão da situação vivenciada por estes caregivers / The activity of the central nervous system (CNS) affects the immune system, which by means of products molecules synthesized by its cells, modify the activity of the CNS, and, consequently, animal behavior. People that care for and support the needs of patients bearing tumors or with chronic, debilitating diseases, have been studied by many groups, with evidences pointing towards an association between some psychological conditions experienced by caregivers and changes in behavior and immunity. Stress-associated symptoms have been intensely studied in these people. Thus, taking into account the required grounds reasonable comparisons, there was no description of a suitable model for laboratory analysis of possible changes in immunity of animals cohabiting with a sick cage-mate. Therefore, the objective of this study was to establish a suitable model for this purpose. We particularly aimed on possible neuroimmune interaction in female mice that had cohabited with Ehrlich tumor-bearing mice, using for comparison hematological, immune, hormonal, behavioral, and neurochemical parameters. The results of this study show that cohabiting with a sick mate - mice bearing the Ehrlich tumor - for 11 days induced, in female mice: 1) leukopenia; 2) decrease in PMA- or S. aureus-induced oxidative burst, and also of the percentage and intensity of phagocytosis by circulating neutrophils; 3) increase in oxidative burst and reduction in the percentage, but did not influence intensity of phagocytosis by ONCO-BCG-activated macrophages; 4) decrease in the resistance to the progression of the Ehrlich tumor, shown by the enhanced concentration of tumor cells per ml of the ascitic fluid, and total number of tumor cells; 5) reduction in the number of circulating leukocytes in animals injected with the Ehrlich tumor; 6) diminished hypothalamic levels of noradrenaline and increased those of dopamine and MHPG in the same region; 7) increased the turnover of noradrenaline in the hypothalamus, and of dopamine in the frontal cortex; 8) enhanced the effects of amphetamine on several parameters of motor activity observed in the open field arena; 9) potentiated the effects of diazepam, reducing the PMA- or S. aureus-induced oxidative burst, and on the percentage and intensity of phagocytosis by circulating neutrophils even further. Nonetheless, cohabiting with the sick mate did not alter the red cell count, the hematocrit, or the mean cell volume, nor did it influence the activity of resident peritoneal macrophages or interfere with serum corticosterone levels. Altogether, these findings show that cohabiting with animals bearing the ascitic Ehrlich tumor caused behavioral, neurochemical, and immunological changes compatible with those presented and described by caregivers. These changes are interpreted as related to a sustained, long-term situation of psychological stress experienced by the conspecific female healthy mates of the tumor-bearing mice. In particular, we postulate in this study that the changes observed might be driven by the increased cathecolaminergic activity in the CNS and/or by the activation of the sympathetic branch of the autonomic nervous system (SANS). The resemblance of the results obtained here and those seen in human caregivers allows the careful suggestion that this model may be relevant to help understanding the situation experienced by caregivers

A tartaruga verde (Chelonia mydas) é uma tartaruga marinha que se alimenta e nidifica em locais da costa brasileira, ilhas e atóis. Esta espécie tem sido acometida pela fibropapilomatose (FP), doença considerada como uma das mais importantes ameaças à sua sobrevivência e caracterizada por tumores cutâneos benignos. A etiologia é multifatorial e complexa, possivelmente havendo relação entre Chelonid Fibropapilloma-associated Herpesvirus, fatores ambientais e genéticos. Foram estudadas 133 tartarugas verdes com e sem tumores provenientes de cinco áreas brasileiras: Florianópolis/SC, Ubatuba/SP, Vitória/ES, Almofala/CE e Fernando de Noronha/PE. Foram obtidos dados de biometria (comprimento curvilíneo da carapaça-CCC, massa corporal-MC e índice de condição corporal-ICC), tamanho (classificado por categorias A, B, C e D), quantidade e localização anatômica dos tumores, além da colheita de amostra sanguínea. Os objetivos foram (1) avaliar a atividade dos leucócitos por citometria de fluxo (fagocitose e burst oxidativo); (2) investigar a presença de sete congêneres de bifenilas policloradas (PCBs) e (3) estabelecer correlações entre PCBs e a atividade dos leucócitos. Houve diferenças no CCC entre tartarugas sem tumores de acordo com a área de estudo, na MC e no ICC entre animais acometidos ou não capturados em Ubatuba. Foram quantificados e classificados 1033 tumores de 50 tartarugas verdes, sendo que a quantidade por tartaruga variou de 1 a 61 e a maior parte foi classificada nas categorias de tamanho A (446 tumores) e B (520 tumores) e na região anterior (669 tumores). Foi observada diferença significativa nas concentrações do congênere PCB 138 entre tartarugas com e sem FP capturadas em Vitória. Animais acometidos tiveram maiores concentrações de todas as PCBs quantificadas, exceto as tartarugas verdes capturadas em Vitória no caso dos congêneres PCBs 118, 138, 153 e 180. PCB 138 foi quantificado em maior concentração nas amostras e PCB 180 em níveis menores. Não foram observadas correlações significativas entre concentrações de PCBs e atividade celular. A FP tem sido amplamente pesquisada e os estudos que visam estabelecer correlações entre poluentes químicos e saúde animal são extremamente importantes, pois podem contribuir para novas direções nos planos de ação para conservação. / The green sea turtle (Chelonia mydas) feeds and nests in Brazilian coast, islands and atolls. This species has been affected by fibropapillomatosis (FP), disease considered one of the most important threats to its survival and characterized by benign skin tumors. The etiology is multifactorial and complex, possibly having relation between Chelonid Fibropapilloma-associated Herpesvirus, environmental and genetic factors. Were studied 133 green sea turtles with and without FP from five Brazilian areas: Florianópolis/SC, Ubatuba/SP, Vitória/ES, Almofala/CE and Fernando de Noronha/PE. Were taken biometric data (curved carapace length-CCL, body mass-BM and body condition index-BCI), as well as size (classified by categories A, B, C and D), numbers and anatomical distribution of tumors, besides blood sample collection. The aims were (1) to assess leukocytes activity by flow cytometry (phagocytosis and oxidative burst); (2) to investigate the presence of seven congeners of polychlorinated biphenyls (PCBs) and (3) to establish correlations between PCBs and leukocytes activity. There were differences in CCL between turtles without FP according to the study area, in BM and BCI between affected and non-affected animals caught in Ubatuba. Were quantified and classified 1033 tumors of 50 green sea turtles, the number of tumors ranged from 1 to 61 and the most part of them was classified in categories of size A (446 tumors) and B (520 tumors) and in anterior region (669 tumors). Was observed difference in PCB 138 concentrations between green sea turtle with and without FP caught in Vitória. Affected animals had higher concentrations of all PCBs quantified, except green sea turtles caught in Vitória in the event of PCBs 118, 138, 153 and 180. Were quantified highest concentrations of PCB 138 and lowest of PCB 180. There were not significant correlations between PCBs concentration and leukocyte activity. The FP has been widely investigate and the studies that aimed to establish correlations between pollutants and animal health are very important, because can contribute for new directions in sea turtle conservation issues.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Salmonellosis is a public health problem that involves issues in animal health and food handling practices that require combined actions to minimize its effects. This disease is a zoonosis with the greatest impact on public health throughout the world due to: high endemicity, high mortality and especially by its difficult to control and the development of antimicrobial resistance. This last issue has led the search for alternatives of control which includes probiotics, prebiotics and organic acids. Another important factor is the elucidation of the role of the immune system of the bird which is still largely unknown due to the complexity of this pathogen and the availability of more sensitive immunological techniques. In addition, rapid and accurate diagnoses which can detect all serotypes are utopian today. Therefore the need for more knowledge in this field is critical to a plan to control Salmonella spp. This work - divided into two chapters - aims to establish parameters of immune lymphocytes circulating through the technique of flow cytometry in birds infected with Salmonella Enteritidis and treated with organic acids, as well as evaluate the efficiency of phenotypic diagnosis by conventional microbiological method compared with quantitative methods, and the genotypic method, through the Real-time PCR in poultry samples from naturally and artificially infected with Salmonella spp. Thus, was noticed in the first study that groups not infected had higher average number of lymphocytes T CD4+, CD8β+, MHC IIbright+ and TCRVβ1+ and the infected group had a higher proportion of circulating cells and gradual recovery was observed when treatment was effective in bacterial reduction. In the second study there was variability in the behavior of different samples and there was no significant difference between the phenotypic and genotypic tests used. However no significant difference were note by x2 test between the phenotypic and genotypic methods evaluated in this experiment. / A Salmonelose é um problema de saúde coletiva a qual envolve questões de sanidade animal e de manejo de alimentos que requerem práticas conjugadas para minimizar seus efeitos. Essa enfermidade é uma das zoonoses com maior impacto sobre a saúde pública em todo o mundo devido à: elevada endemicidade, morbidade, difícil controle e, sobretudo, pelo desenvolvimento de resistência a antimicrobianos. Este último tem levado a busca de alternativas no controle as quais incluem probióticos, prebióticos e os ácidos orgânicos. Outro fator importante é a elucidação do papel do sistema imune da ave com relação a este micro- organismo, o qual é ainda pouco conhecido devido à complexidade deste patógeno e a indisponibilidade de técnicas imunológicas mais sensíveis. Além disso, um diagnóstico rápido e preciso capaz de detectar todos os sorotipos de Salmonella spp. ainda são utópicos. Portanto a necessidade de mais conhecimento neste campo é fundamental para estabelecer um plano de controle deste patógeno. Este trabalho - dividido em dois capítulos - teve como objetivo estabelecer parâmetros imunitários de linfócitos circulantes, através da técnica de citometria de fluxo, em aves contaminadas com Salmonella Enteritidis e tratadas com ácidos orgânicos, bem como avaliar a eficiência do diagnóstico fenotípico, pelo método microbiológico convencional comparado com métodos microbiológicos quantitativos, e com o método genotípico, pela técnica de Real-time PCR, em amostras de aves infectadas com Salmonella spp. de forma natural e experimental. Com isso percebeu-se no primeiro estudo (Capítulo 1) que grupos não infectados apresentaram maior quantidade média de linfócitos T CD4+, CD8β+, MHC IIbright+ e TCRVβ1+ e o grupo infectado apresentou maior proporção de células circulantes e um retorno gradual foi observado quando o tratamento foi eficaz na redução bacteriana. No segundo estudo (Capítulo 2) existiu variabilidade no comportamento das amostras natural e experimentalmente infectadas em relação ao número de aves positivas e a técnica utilizada para a sua detecção. No entanto não houve diferença significativa pelo teste de Qui-quadrado entre os métodos fenotípicos e genotípicos avaliados neste experimento.

Orientador: Hamilto Akihissa Yamamoto / Coorientador: José Carlos Sozua Trindade Filho / Coorientador: Eunice Deffune / Banca: Juliany Gomes Quitzan / Banca: Paulo Roberto Kawano / Banca: Wagner José Fávaro / Banca: Renata Aparecida de Camargo Bittencourt / Resumo: A engenharia de tecidos tem se mostrado promissora para o tratamento de lesões e doenças da uretra. No presente estudo, foi demonstrada a caracterização das células de músculo liso de bexiga de coelhos e seu implante em matrizes acelulares de aorta de suínos para reparo de lesão na uretra de coelhos. Aortas de dez suínos foram obtidas, descelularizadas e colocadas em cultura com células de músculo liso provenientes de bexiga de dez coelhos, para servirem como modelo no reparo de tecido uretral. As aortas foram descelularizadas com sodium dodecyl sulfate (SDS) a 0,1% e tiveram seu coeficiente de rigidez testado, cujos resultados demonstraram a mesma resistência antes e depois do processo. As células de músculo liso cultivadas foram caracterizadas por citometria de fluxo com o anticorpo anti-CD90 e por imunocitoquímica usando o anticorpo Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (- SMA). Com os resultados da citometria de fluxo excluiu-se a possibilidade da presença de células-tronco mesenquimais ou fibroblastos junto à cultura de células de músculo liso, enquanto que com a imunocitoquímica comprovou-se o perfil das células de músculo liso. A viabilidade das células foi mantida em 99,31% quando em contato com a matriz, demonstrando que o modelo proposto é um excelente biomaterial para uso como scaffold de células. Seu uso na reconstrução de uretra com lesões complexas pode ser considerado com otimismo, podendo resolver problemas relacionados à quantidade insuficiente de tecido na região / Abstract: Tissue engineering has shown promise for treatment in urethras injuries and diseases. In the present study, we demonstrated the rabbits smooth muscle cells of the bladder characterization and their implantation in an acellular porcine aorta for repairing injuries in rabbits urethras. Ten porcine abdominal aortas were obtained and placed in culture with rabbit bladders smooth muscle cells from ten animals to serve as a template for the repair of urethral tissue. The aortas were deccelularized with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and had a coefficient of stiffness test, whose results showed the same resistance before and after the process. The smooth muscle cultured cells were characterized by flow cytometry with anti-CD90 antibody and by immunocytochemistry using Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (-SMA) antibody. The results of flow cytometry excluded the possibility of the presence of mesenchymal stem cells or fibroblasts by the smooth muscle cells culture, whereas immunocytochemistry confirmed the profile of smooth muscle cells. When in contact with the matrix, cell viability was maintained at 99.31%, demonstrating that the proposed model is an excellent biomaterial for use as cell scaffold. Its use in urethral complex lesions reconstruction can be seen with optimism and solve problems related to insufficient quantities of urinary tissue / Doutor

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Por RT-PCR, foi observada a expressão dos transcritos de dzip1 e pum2 em CTMs derivadas de medula óssea (MO), sangue de cordão umbilical e placentário (SCU) e tecido adiposo (TA). A expressão dos transcritos também foram analisada durante a adipogênese das CTMs por qRT-PCR. Os resultados demonstram que o perfil de expressão dos dois transcritos sofre redução durante o processo, enquanto o transcrito de fabp4 (marcador adipogênico) aumenta. Por citometria de fluxo foi verificada a porcentagem de CTMs de TA que expressam DZIP1 (mais de 90% da população) e PUM2 (cerca de 50% da população). A expressão das proteínas PUM2 e DZIP1 foi confirmada por western blot em extratos totais de CTMs. Durante a diferenciação celular, a expressão da proteína DZIP1 se manteve constante enquanto PUM2 sofreu redução após induzida da diferenciação. A discrepância entre os níveis de mRNA e da proteína DZIP1 sugere regulação pós-transcricional. As imunofluorescências de DZIP1 e PUM2 nas CTMs indicaram que essas proteínas são nucleares em células de culturas recém sub-cultivadas e a localização dessas são translocadas para o citoplasma ao longo do tempo da cultura. As células diferenciadas expressam as duas proteínas no citoplasma e/ou núcleo. Análise dos transcritos de dzip1 e pum2 também foi verificada em culturas com proliferação celular intensa e reduzida. Dzip1 não apresentou mudanças significativas de expressão nas duas situações. No entanto, a expressão de pum2 aumentou nas CTMs com proliferação intensa, sugerindo uma possível participação nesse processo. Ensaios futuros serão realizados para confirmar a participação de PUM2 na proliferação celular. Além disso, a interferência de dzip1 e pum2 por RNA será providenciada para análise funcional desses genes. / Stem Cells (SCs) have the potential of differentiating into several cellular types, serving as a repair system for the organism. The ability of stem cells to replicate themselves by dividing into the same non-specialized cell type over long periods is a mechanism knows as self-renewal. The understanding of this mechanism will also help to understand the senescence and hence, the loss of SCs differentiation potential. PUMILIO2 and DZIP1 RNA binding proteins regulate the translation of specific mRNAs during self-renewal and differentiation of germ-line and embryonic stem cells of diverse organisms, including humans. In this work, we aimed to study the relevance of PUM2 and DZIP1 in self-renewal and differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We have found that dzip1 and pum2 transcripts are expressed in hMSCs derived from bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and umbilical cord blood (UC) by using RT-PCR analysis. We have found that more than 90% of the MSCs population express DZIP1 and about 50% express PUM2 by flow cytometry. The expression pattern of pum2 and dzip1 transcripts was followed during differentiation of adipose derived MSCs into adipocytes. Quantitative PCR analysis showed that mRNA levels of both genes drop during differentiation, showing an opposite pattern to the fabp4 adipocyte marker. The presence of the PUM2 and DZIP1 proteins was confirmed by western blot of total protein extracts of AT derived hMSCs. During cell differentiation, the expression of the protein DZIP1 was constant while PUM2 decreased. The discrepancy between the levels of the dzip1 mRNA and protein suggests a regulated transcriptional and post-transcriptional expression of these genes. DZIP1 and PUM2 in immunofluorescence assays in hMSCs indicated that they are nuclear in freshly plated cells and translocate to the cytoplasm over time. The differentiated cells present the two proteins in the cytoplasm and nucleus. The expression pattern of the dzip1 and pum2 transcripts was also followed in cultures of MSCs derived from AT undergoing intense and reduced cell proliferation. Dzip1 showed no significant changes of expression in both situations. However, the expression of pum2 is higher in hMSCs with intensive proliferation than with reduced proliferation suggesting a possible participation in this process. To pave the way to a better understanding of DZIP1 and PUM2 function in hMSCs, RNA interference experiment are in progress.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.

Made available in DSpace on 2016-06-17T14:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Dissertaçao-AlmeidaAF-Final.pdf: 1255683 bytes, checksum: a7eec12079ba89af0a1d43bf178a08d9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Disserta?ao-AlmeidaAF-Final.pdf.txt: 152410 bytes, checksum: edb416d121ad44fbbca484f722d9f79f (MD5) Disserta?ao-AlmeidaAF-Final.pdf: 1255683 bytes, checksum: a7eec12079ba89af0a1d43bf178a08d9 (MD5) license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / As leishmanioses são um grave problema de saúde em todo o mundo e a forma cutânea é encontrada em todas as regiões do Brasil, sendo endêmica no estado de Pernambuco. Infecções por Leishmania levam à ativação da resposta imunológica no hospedeiro, destacando-se a resposta celular. Esta é caracterizada por expansão de vários tipos celulares, sobretudo de linfócitos T, com produção de diferentes perfis de citocinas. Este estudo teve como objetivo caracterizar imunofenotipicamente pacientes portadores de leishmaniose tegumentar ativa quanto à produção das citocinas IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-4. Verificou-se a produção sérica de IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ e IL-17 em pacientes com doença ativa (AT), após tratamento (PT) e de pacientes que apresentaram cura espontânea das lesões (CE). Buscou-se também a associação entre produção de citocinas na resposta imune celular de pacientes AT, relacionando a resposta imune dos perfis Th1, Th2 e Th17. Foi observada maior proporção de linfócitos T CD3+ e T CD4+ , maior produção de IL- 17 e IL-23 por linfócitos T CD4+ e de IL-4 por linfócitos T CD4+ e T CD8+ em AT, em comparação aos controles, e também maior produção de IL-10 por linfócitos T CD8+ em AT. Os resultados revelaram maior concentração sérica de IL-6 em CE em comparação aos outros grupos. Além disso, observou-se associação positiva significativa entre citocinas Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-4) em AT. Os resultados mostram que a proporção de linfócitos T CD3+ e T CD4+ é importante no processo de cura das lesões. O predomínio de citocinas Th2 na doença ativa sugere uma desregulação imunológica temporária inicial. No entanto, pode haver um favorecimento para a cura clínica nos pacientes que apresentam uma boa indução para a resposta Th17 com produção significativa de IL-6, como observado em CE. Portanto, um balanço adequado entre as respostas imunes no paciente pode ser o ideal para uma melhor resolução das patologias causadas L. (V.) braziliensis.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giuliana Schmidt Franca Fonseca.pdf: 1055751 bytes, checksum: 050d4de10b5fae8001c2b5f264473b60 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico de rotina da leishmaniose visceral (LV) humana é usualmente baseado em parâmetros clínicos e epidemiológicos, associado a exames parasitológicos e/ou imunológicos. Tendo em vista que a doença é fatal se não tratada, a busca por métodos diagnósticos mais efetivos, que sejam de fácil execução, simples, acessíveis, menos invasivos, e rápidos, se faz necessário, diminuindo o tempo de obtenção dos resultados. Portanto, neste estudo foi avaliado o desempenho de diferentes métodos já utilizados na rotina ou propostas como ferramentas alternativas para o diagnóstico da LV, incluindo o exame direto de punção de medula óssea, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), o teste rápido com rK39 (Kalazar Detect®), a ELISA com antígeno solúvel de L. chagasi e a imunofluorescência baseada em citometria de fluxo (FC-AFPA). Para isso foram avaliadas 77 amostras biológicas (punção de medula óssea e soro) de pacientes com diagnóstico clínico de LV, tratados e curados. A sensibilidade dos testes avaliados foi de 48% para o exame parasitológico direto, 74% para RIFI, 79% para o teste rápido com rK39, 88% para o teste ELISA-ASL e 94% para a FC-AFPA. A análise comparativa dos testes avaliados demonstrou que há maior concordância entre os testes sorológicos entre si, do que entre os testes sorológicos e o exame direto, devido a sua baixa sensibilidade. Foi também realizada a comparação entre os resultados dos testes sorológicos em relação ao resultado do teste parasitológico direto. Entretanto, nossos resultados mostraram que o desempenho dos testes foi semelhante independente do resultado do exame direto. Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho de dois algoritmos para diagnóstico da LV baseados apenas em testes sorológicos. O primeiro deles utilizando a RIFI como teste de inicial, uma vez que este teste é disponibilizado pelo Ministério da Saúde (MS) para os laboratórios de referência em diagnóstico de LV e um segundo utilizando o teste rápido rK39, que tem sido recentemente sugerido como teste de triagem pelo MS. A análise dos dados demonstrou que o algoritmo para o diagnóstico da LV humana que apresentou melhor desempenho, ou seja, todos os casos foram detectados, foi aquele que utilizou o teste rápido como teste inicial, seguido de FC-AFPA / The routine diagnosis of human visceral leishmaniasis (VL) is usually based on clinical and epidemiologic parameters associated to parasitological and/or immunological tests. Being a fatal disease if not treated, the search for more effective, easy to perform, simple, affordable, and fast diagnostic methods, is necessary, decreasing the time to obtain results. Therefore, in this study the performance of different methods already used in the routine or proposed as alternative tools to the diagnose of VL was evaluated, which included the direct parasite detection (DPD) on bone marrow aspirates, indirect immunofluorescent assay (IFA), rK39 rapid test (Kalazar Detect®), ELISA test using L.chagasi soluble antigen, and immunofluorescence by flow cytometry (FC-AFPA). Seventy-seven biological specimens (bone marrow and serum) from patients with clinical diagnosis of VL, treated, and cured were assessed. The sensitivity of evaluated tests was 48% for DPD, 74% for IFA, 79% for rK39 rapid test, 88% for ELISA-SLA, and 94% for FC-AFPA. The comparative analysis demonstrated higher concordance among serological tests in comparison to serological tests and DPD, due to the low sensitivity of the latter. It was also done the comparison between the results of serological tests and direct examination. However, our results showed that the performance of tests was similar regardless of DPD results. In addition, our study evaluated the performance of two algorithms for the diagnosis of VL based only on serological tests. The first of them using IFA as a initial test, since this is the test provided by the Ministry of Health (MH) for reference laboratories for diagnosis of VL, and a second algorithm using the rK39 rapid test, that has recently been suggested as a screening test by the MH. It was demonstrated that the algorithm presenting the best performance, that is, all the cases were detected, was the one using rapid test as initial test followed by FC-AFPA