A micróglia é essencial para a homeostase do Sistema Nervoso Central (SNC), função neuro-imune inata, e exerce papel importante na neurodegeneração, envelhecimento cerebral e tumorigênese. Gliomas difusos são tumores cerebrais primários caracterizados por crescimento infiltrativo e altas taxas de heterogeneidade, o que torna a doença praticamente incurável. Avanços em análises genéticas caracterizaram alterações moleculares relacionadas ao tempo de sobrevida e à resposta clínica desses pacientes, especialmente em glioblastomas (GBM). No entanto, a tumorigenicidade dos gliomas não é controlada unicamente por suas alterações genéticas. As interações entre as células tumorais, a micróglia residente e os macrófagos/monócitos infiltrados desempenham um papel crucial na modulação do crescimento e agressividade do glioma. Neste estudo, analisamos o fenótipo de ativação da micróglia/macrófagos em gliomas, incluindo astrocitomas e oligodendroglimas de diferentes graus de malignidade, apresentamos o perfil de expressão gênica da população pura de micróglia cortical e do tecido cerebral total correspondente. Usando sequenciamento de DNA de alta performance, classificamos as amostras de GBM em Proneural, Clássico e Mesenquimal. Em seguida, avaliamos os status de ativação da micróglia/macrófagos dessas amostras. Apesar do alto grau de heterogeneidade, pudemos observar níveis mais altos dos marcadores mielóides (IBA1, CD11b and CD68) em tumores astrocíticos comparados a tumores de origem oligodendrocítica e ao tecido não-neoplásico. Marcadores de anti-inflamação, como CD163, foram mais abundantes em astrocitomas, bem como em GBMs do subtipo Mesenquimal e Clássico; enquanto que marcadores de pró-inflamação, como IL1-beta, mostraram uma expressão mais heterogênea entre as amostras. Em seguida, micróglia foi isolada de 25 amostras de córtex parietal provenientes de autópsia de indivíduos cognitivamente preservados e foi feito o RNA-seq. Os resultados foram comparados à micróglia de camundongo e a outras células mielóides. Boa parte dos genes expressos pela micróglia humana foram similares àqueles expressos pela micróglia murina, como CX3CR1, P2YR12 e ITGAM. Porém, foram identificados genes de característica imune, abundantemente expressos na micróglia humana e não identificados na micróglia de camundongos, como TLR, Fcy, receptores do tipo SIGLEC, e fatores de transcrição NLRC5 e CIITA. A comparação dos dados de expressão gênica da micróglia com monócitos e macrófagos identificou novos marcadores que distinguem a micróglia humana de outras células mielóides. Nossos dados sobre a micróglia em gliomas sugerem características de imunossupressão e de pró-crescimento em tumores de pior prognóstico, ligado a um fenótipo específico de ativação das células mielóides. Este é o primeiro estudo a identificar o transcriptoma da micróglia humana pura, demonstrando que ela é claramente diferente da micróglia murina e de outras células mielóides. Esses resultados abrem portas para estudos de populações específicas de células mielóides em gliomas / Microglia are essential for central nervous system (CNS) homeostasis and innate neuroimmune function, and play important roles in neurodegeneration, brain aging and tumorigenesis. Diffuse gliomas are primary brain tumors characterized by infiltrative growth and high heterogeneity, which renders the disease mostly incurable. Advances in genetic analysis have characterized molecular alterations leading to impact on patients\' overall survival and clinical outcome, particularly in glioblastoma (GBM). However, glioma tumorigenicity is not controlled uniquely by its genetic alterations. The crosstalk between tumor cells, resident microglia and infiltrating monocytes/macrophages plays a crucial role in modulating glioma growth and aggressiveness. Here, we assess the activation status of microglia/macrophages in gliomas,including astrocytomas and oligodendrogliomas of different grades of malignancy, and present the gene expression profile of pure cortical human microglia and corresponding unsorted brain tissue. Using high-throughput DNA sequencing, we have classified GBM samples in Proneural, classical and mesenchymal. Next, we evaluated the activation status of microglia/macrophages within these samples. Despite the great heterogeneity, we observed higher levels of myeloid markers (IBA1, CD11b and CD68) in astrocytic tumors compared to oligodendrocytic ones and to non-neoplastic (NN) tissue. Anti-inflammation markers, such as CD163, are also more abundant in astrocytomas, as well as in the mesenchymal and classical GBM subtypes, while pro-inflammation markers, such as IL1-beta, show a more widespread expression throughout samples. Next, microglia were isolated from the parietal cortex of 25 autopsy samples of cognitively preserved humans and RNA sequenced. Overall, genes expressed by human microglia are similar to mouse microglia, such as CX3CR1, P2YR12, and ITGAM. Interestingly, a number of immune genes, not identified as mouse microglia signature genes, were abundantly expressed in human microglia, such as TLR, Fcy and SIGLEC receptors and NLRC5 and CIITA transcription factors. Comparison of microglia to monocyte and macrophage expression data underscored the CNS-specific functions of microglia and new markers were identified that distinguish human microglia from other myeloid cells. Our glioma-related data suggests an immune-suppressive and growth supportive characteristic for tumors with worse clinical outcome, linked to an activation profile of myeloid cells. This data is the first comprehensive pure human microglia gene expression profile; human microglia clearly differ from mouse microglia and other myeloid cells. These results will help further studies focusing on pure myeloid cells populations in glioma

A ressurgência da massa de Água Central do Altântico Sul (ACAS) é o principal processo oceanográfico de disponibilização de nutrientes na zona eufótica da plataforma continental sudeste do Brasil (PCSE). Isto gera um acréscimo na população de organismos autotróficos e consequente de heterotróficos que produzem e oxidam a matéria orgânica gerada. O que possibilita um aumento no fluxo de carbono e consequentemente a manutenção dos recursos pesqueiros na região durante o verão. A abundância de micro-organismos autotróficos e heterotróficos planctônicos e a relação destes com as massas de água da PCSE foram avaliadas no verão de 2013. Para o tal, os micro-organismos autotróficos, menores que 20 µm foram quantificados por citometria de fluxo. Foram realizadas análises de abundância do gene 16S de bactérias, archaeas e do clado Sar11 e a expressão dos genes rubisco e proteorodpsina por meio de PCR em tempo real. O valor médio obtido de micro-organismos autrotróficos, Prochlorococcus spp. e Synechococcus spp. foi de 15.151 e de 8.313 células.ml-1, respectivamente. E de bactérias heterotróficas de 7.4x105 células.ml-1. Em relação aos domínios, a distribuição de Bacteria ocorreu na superfície e de Archaea no fundo da região oceânica. Os resultados indicam que a distribuição dos micro-organismos ocorreu conforme as características físicas e a disponibilidade de nutrientes das massas de água. Bactérias heterotróficas foram abundantes em regiões costeiras provavelmente devido a maior disponibilidade de matéria orgânica, o que corrobora com o resultado encontrado de maior biomassa de carbono em região costeira. / The resurgence of South Atlantic Central Waters (ACAS) is the main oceanographic process that involves availability of nutrients in the photic zone of the southeast continental shelf in Brazil. This causes an increase in the population of autotrophs and heterotrophic organisms (that produce and oxidizes the organic matter). The carbon flux increase and consequently the maintenance of fish resource in the region during the 2013 summer. The abundance of autotrophic and heterotrophic planktonic microorganisms was evaluated and also was studied their relation with the masses of water of the continental shelf. Thus, autotrophic microorganisms, smaller than 20 microns were quantified by flow cytometry. Using real time PCR were analysed 16S abundance of bacteria, archaea and SAR11 clade and the expression of the rubisco and proteorhodopsin gene. Autotrophic microorganisms, Prochlorococcus spp. and Synechococcus spp. had a mean value of 15.151 and 8.313 cell.ml-1, respectively. Heterotrophic bacteria had a mean value of 7.4x105 cell.ml-1. In relation to the domains, the distribution of bacteria occurred in the surface and the Archaea in the deep of the ocean region. The results indicate that the distribution of micro-organisms occur as the physical characteristics and the availability of nutrients of water masses. Heterotrophic bacteria were abundant in coastal areas probably due to increased of organic matter, which corroborates the result of higher biomass carbon in coastal region.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-10-21T01:01:09Z No. of bitstreams: 1 shaianysabrinalopesgomes.pdf: 8345225 bytes, checksum: 345de5fe2a909ceb0a04bbb96016c1ff (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-10-21T13:13:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 shaianysabrinalopesgomes.pdf: 8345225 bytes, checksum: 345de5fe2a909ceb0a04bbb96016c1ff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-21T13:13:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 shaianysabrinalopesgomes.pdf: 8345225 bytes, checksum: 345de5fe2a909ceb0a04bbb96016c1ff (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 / As orquídeas do complexo "Zygopetalum maculatum" (Kunth) Garay são típicas dos campos rupestres e de altitude do leste do Brasil. Atualmente são reconhecidas seis espécies para este grupo que, por compartilharem características morfológicas diagnósticas, são reconhecidas aqui como um complexo de espécies. De forma a contribuir para entender o padrão de variação fenotípica observado entre as populações e com isso tentar esclarecer a formação deste complexo, este trabalho caracterizou do ponto de vista genético ar 22 populações de "Z. maculatum", sendo 21 provenientes do Brasil e uma da Bolívia. As análises compreenderam estimativa da quantidade de DNA nuclear, determinação do número cromossômico, comportamento meiótico e diversidade genética identificada por marcadores do tipo ISSR. O conteúdo médio de DNA revelou três níveis de ploidia no complexo, 7,36 pg, 10,52 pg e 14,09 pg de DNA, sendo estes relacionados a números cromossômicos de 2n=48; 2n=72; 2n=96, respectivamente. Tal variação ocorreu entre e dentro das populações. Dados cariotípicos (morfometria, DNAr 5S e 45S) evidenciaram similaridade entre os três níveis de ploidia. A meiose mostrou-se irregular, com ocorrência de atraso e perda cromossômica, pontes, “cromossomos aderentes”, micronúcleos e assincronia em todos os níveis de ploidia. O dendrograma baseado em marcadores ISSR revelou tendência de agrupamento de indivíduos com o mesmo nível de ploidia e originados das mesmas regiões geográficas. Os resultados sugerem que as populações possuem baixos índices de diversidade genética entre indivíduos e que a maior diversidade encontra-se entre as populações. De forma geral, os resultados indicam que eventos de poliploidização estejam relacionados à diversificação e especiação de “Z. maculatum”, sendo um processo importante para explicar as variações morfológicas observadas dentro do complexo. / The orchids of the "Zygopetalum maculatum" (Kunth) Garay complex are typical of the “campos rupestres” of the east side of Brazil. Currently, six species are recognized for this group which, due to their morphological similarity, is recognized here as a species complex. In order to understand the phenotypic pattern observed among the populations and contribute to clarify the formation of this complex, this study characterized 22 populations of “Z. maculatum”, being 21 populations from Brazil and one population from Bolivia. The study included DNA amount estimation, determination of the chromosome number, meiotic behavior and genetic diversity estimation. The average of DNA content revealed three 2C values, 7.36 pg, 10.52 pg and 14.09 pg of DNA, which were associated to 2n = 48; 2n = 72 and 2n = 96 chromosomes, respectively. The variation was observed within and among populations. Karyotypic data (morphometry, 5S and 45S rDNA) showed similarity among all ploidy levels. Meiosis behavior was not regular being observed chromosome delay and loss, bridges, micronuclei, chromosomal stickiness and asynchrony. The dendrogram based on ISSR revealed similarity regarding the ploidy level and the geographical distribution of the individuals. The data also suggested low genetic diversity within populations being most of the diversity observed among populations. In general, the results indicate that polyploidization events are probably related to the Zygopetalum diversification and speciation, being an important process to explain the morphological variations observed within the complex.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-08-03T15:27:59Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-28T13:54:44Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-28T13:54:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-04-08 / Introdução: O uso de células progenitoras hematopoéticas mobilizadas no sangue periférico tornaram-se a fonte preferencial para transplante autólogo. Alguns fatores podem afetar a mobilização de células CD34+ no transplante autólogo de células progenitoras hematopoéticas (TACPH). Este estudo teve como objetivo avaliar a influência desses fatores e correlacionar com a contagem de células CD34+ pré-aférese. Método: Estudo prospectivo que envolveu a avaliação de pacientes submetidos a mobilização de células progenitoras hematopoéticas com fator de crescimento de granulócitos (G-CSF) para realizar o transplante autólogo. Foi realizada quantificação de células CD34+ no sangue periférico pré-aférese e no produto final. Foi determinado a quantidade de células CD34+ relacionada com menor número de coletas para se obter o valor necessário para a realização do transplante, além da associação com os dados clínicos e laboratoriais. Resultados: Do total de 34 pacientes, 85% tinham mais que 20.000 leucócitos/μl. Dos pacientes que apresentaram falha na mobilização, 100% apresentaram leucometria inferior a 20.000 leucócitos/μl. Houve diferença estatisticamente significativa na associação entre o CD34+ pré-aférese e as variáveis idade (p=0,025), leucometria (p<0,001) e células mononucleares (p=0,001) do sangue periférico. O CD34+ ≥ 14 células/μl pré-aférese teve relação com um melhor rendimento dessas células no produto final e com a necessidade de apenas uma coleta para se obter a quantidade necessária para realizar o TACPH. Conclusão: Esse estudo demonstra que a contagem de células CD34+ relacionada com a idade e a leucometria pré-aférese do paciente, foi o único fator associado estatisticamente com o número de coletas e com rendimento do produto final. / Introduction: The use of hematopoietic progenitor cells mobilized in the peripheral blood became the preferred source for autologous transplantation Some factors may affect the mobilization of CD34+ cells in autologous transplantation of hematopoietic progenitor cell (ATHPC). This study aimed to evaluate the influence of these factors and to correlate with the pre-apheresis CD34+ cell count. Method: This is a prospective study evaluating 34 patients submitted to the mobilization of hematopoietic progenitor cells with granulocyte growth factor (G-CSF). Quantification of CD34+ cells in the peripheral blood pre-apheresis and in the final product of the apheresis was performed. The amount of CD34+ cells related to fewer collections was determined to obtain the value needed for the transplantation, in addition to the association with clinical and laboratory data. Results: Out of the 34 patients, 85% had more than 20,000 leukocytes / μl. Of the patients who presented failure during mobilization, all presented < 20,000 leukocytes / μl. There was a statistically significant difference in the association between pre-apheresis CD34+ and the variables age (p = 0.025), leukocyte count (p <0.001) and mononuclear cells (p = 0.001) in peripheral blood. Pre-apheresis CD34+ ≥14 cells/μl was related to better yield of these cells in the final product and with the need for only one collection to obtain the minimum cumulative yield of 2 x 106 CD34+/Kg. Conclusion: This study demonstrates that the age-related CD34+ cell count and patient pre-apheresis leukocyte count was the only factor statistically associated with the number of collections and yield of the final product.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Proenca-Ferreira_Renata_D.pdf: 5501623 bytes, checksum: d6f51a08081eca63858550d8e3d423fd (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma doença causada por uma mutação de ponto (troca do aminoácido glutâmico pela valina), que resulta na síntese de uma hemoglobina anômala, a hemoglobina S (HbS). A principal causa de morbidade para portadores de AF é a vaso-oclusão, que resulta da adesão anormal de células vermelhas e brancas ao endotélio, e consequêntemente diminui o fluxo sanguíneo. As plaquetas de pacientes AF apresentam um aumento das suas propriedades adesivas, e por isso, sugere-se a sua participação no processo de vaso-oclusão. Nossos dados mostraram que essas plaquetas são capazes de ativarem células endoteliais, in vitro, em ensaios de co-culturas com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) com plaquetas. A expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a da E-selectina das células HUVEC aumentou significativamente na sua superfície, após a sua co-incubação com plaquetas de pacientes AF. A ativação das moléculas de adesão depende do contato físico entre plaquetas e células HUVEC, pois a utilização de insertos de transwell inibiu significativamente a expressão de ICAM-1 e E-selectina na superfície das HUVEC. A co-incubação de plaquetas de pacientes AF com as células HUVEC resultou em uma maior produção e liberação de mediadores inflamatórios (citocinas); a interleucina 8 (IL-8) e da interleucina 1 beta (IL-1?) quantificadas do sobrenadante das co-culturas com essas células. As plaquetas desses pacientes possuem propriedades inflamatórias, pois liberaram mais fator plaquetário 4 (PF4), uma quimiocina pró-agregante, quantificada do sobrenadante de cultura dessas plaquetas, em relação às plaquetas de indivíduos saudáveis. O aumento na expressão das moléculas de adesão, integrina ?IIb?3 e P-selectina, na superfície das plaquetas de pacientes AF, podem indicar que há um aumento na sua ativação plaquetária, favorecendo a sua adesão ao endotélio inflamado. O fator nuclear-?B (NF-?B) é um fator de transcrição nuclear muito importante envolvido na ativação de genes, como genes que codificam de moléculas de adesão endotelial, e os nossos resultados de expressão gênica mostraram que há um aumento na expressão do gene NF?BIA (subunidade p50 do NF-?B), em associação com o aumento na expressão do gene ICAM1 (que codifica a molécula de adesão ICAM-1) em HUVEC, após co-cultura dessas células com plaquetas de pacientes AF. A presença do inibidor BAY 11-7082 (inibe a via de sinalização NF-?B), diminuiu a expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e E-selectina na superfície das células HUVEC, quando co-incubadas com plaquetas de pacientes AF. Os nossos dados são importantes e corroboram com a nossa hipótese de que as plaquetas participam no processo de vaso-oclusão na anemia falciforme, pois apresentam a capacidade de ativar células endoteliais (in vitro) tornando-as inflamatórias e mais adesivas. Portanto, sugerimos que as plaquetas representam um importante alvo para novas abordagens terapêuticas na anemia falciforme / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is a disease caused by a point mutation (causing the exchange of glutamic acid for valine), which results in the synthesis of an abnormal hemoglobin, hemoglobin S (HbS). The principal cause of morbidity in patients with SCA is vaso-occlusion, which results from the abnormal adhesion of red blood cells and white cells to blood vessel walls, leading to decreases in blood flow. Platelets from SCA patients present an increase in their adhesive properties and, therefore, we have previously suggested that they may participate in the vaso-occlusive process. Our current data show that platelets from SCA patients are able to activate endothelial cells, in vitro, in co-culture assays using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) that were co-incubated with platelets from SCA patients. The expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-selectin was significantly increased on the surface of HUVEC cells after their co-incubation with platelets from SCA patients (SCA platelets). The activation of adhesion molecule expression observed depended on the physical contact between platelets and HUVEC cells, as transwell inserts were able to significantly inhibit the expression of ICAM-1 and E-selectin on HUVEC following their culture in the presence of SCA platelets. The co-incubation of SCA platelets with HUVEC cells also resulted in a higher production and release of inflammatory mediators (cytokines), such as interleukin 8 (IL-8) and interleukin 1 beta (IL-1?) in the supernatant of these co-cultures. Platelets from SCA patients have inflammatory properties, releasing more platelet factor 4 (PF4), a pro-aggregating chemokine, than platelets from healthy subjects. The increased expression of the adhesion molecules, integrin ?IIb?3 and P-selectin, on the surface of platelets from SCA patients, may also indicate an increased platelet activation, favoring their adhesion to the inflamed endothelium. Nuclear factor-?B (NF-?B) is an important nuclear transcription factor involved in the activation of genes, including endothelial adhesion molecules genes. We found an increased gene expression of NF?BIA (encoding the p50 subunit of NF-kB), in association with increased gene expression of ICAM1 (encodes ICAM-1) in HUVEC, following the co-culture of these cells with platelets from SCA patients. The presence of the BAY 11-7082 inhibitor (inhibits the NF-?B signaling pathway) decreased the expressions of the ICAM-1 and E-selectin adhesion molecules on the surface of HUVEC cells when co-incubated with platelets from SCA patients. Our data corroborate our hypothesis that platelets probably participate in the process of vaso-occlusion in sickle cell anemia, since they have the ability to activate endothelial cells (in vitro), in turn, making them more inflammatory and adhesive. As such, we suggest that platelets represent an important target for new therapeutic approaches in sickle cell anemia / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

As células-tronco são capazes de se diferenciarem em praticamente todos os tipos celulares, podendo ser utilizadas em terapias de substituição em várias doenças. Células de linhagens hepáticas embrionárias e fetais pode ser uma fonte importante para a terapia celular em indivíduos com doenças hepáticas, pois possuem um alto índice de diferenciação em hepatócitos e células do ducto biliar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial e o controle da resposta proliferativa de células do broto hepático de ratos Fischer 344 em cultura. A obtenção das células do broto hepático foi realizada nos períodos 12,5; 14,5 e 16,5 dias de gestação e os fragmentos foram cultivados em meio DMEM-F12. A caracterização morfológica foi realizada em microscopia invertida de luz e eletrônica de varredura. A caracterização dos marcadores de células mesenquimais, do citoesqueleto, progressão e fases do ciclo celular, morte celular, e do potencial elétrico mitocondrial foram realizadas por citometria de fluxo. A função bioquímica foi realizada pela análise das transaminases hepáticas e pela produção de radicais livres lipoperoxidados. Os resultados encontrados no acasalamento dos ratos isogênicos da linhagem Fischer 344 seguiu o protocolo de 12 h de luz, alcançando o índice reprodutivo satisfatório e reprodutível. O isolamento e separação do broto hepático desta linhagem de ratos permitiu a obtenção, expansão e caracterização de uma cultura primária nos diferentes dias de gestação 12,5; 14,5 e 16,5. Os aspectos morfológicos encontrados foram de células fusiformes do tipo fibroblast-like para todos os períodos de gestação em cultura. As análises das transaminases hepáticas TGO e TGP, mostraram se em concentrações menores no período 12,5 dias de gestação. A expressão dos marcadores de células-tronco de origem mesenquimais (CD90, Nanog, Oct ¾ e STRO1), marcadores do citoesqueleto (CK8, CK18 e Desmina), marcadores envolvidos na checagem e progressão do ciclo celular (P53, P21, P27 e Ciclina D1) e marcadores envolvidos na morte celular (Anexina V/PI, Caspase 3, Bax, Bad e Bcl2) mostraram diferencialmente expressos, nos diferentes períodos gestacionais. A análise do potencial elétrico mitocondrial nos períodos de gestação de 14,5 e 16,5 dias, foi maior na proporção de células inativas com menor capacidade funcional ou metabólica, quando comparada ao período de 12,5 dias ou mesmo em relação ao hepatócito normal de um rato adulto. Análise das fases do ciclo celular observou-se uma concentração de célula na fase G0/G1, repercutindo na modulação da capacidade de proliferação e aumento na proporção de células com DNA fragmentado, nas CBH no período de 16,5 dias em comparação aos demais períodos e ao hepatócito normal. O aumento da fragmentação do DNA em média de 3,5 e 2,3 vezes, respectivamente nos períodos de 12,5 e 14,5 dias de gestação. A capacidade de síntese e de divisão celular das CBH foi mantida em todos os períodos de gestação. Os radicais livres lipoperoxidados mostraram quantidades insignificantes em CBH nos diferentes dias de gestação. / Stem cells are able to differentiate into virtually all cell types and can be used in replacement therapies in various diseases. Cells of embryonic and fetal liver lines can be an important source for cell therapy in patients with liver disease because they have a high rate of differentiation into hepatocytes and biliary duct cells. The aim of this study was to evaluate the potential and control of the proliferative response of liver bud cells during the maturation of hepatocytes in culture. The acquirement of liver bud cells was performed for 12.5, 14.5 and 16.5 days of gestation and the fragments were cultured in DMEM-F12. Morphological characterization was performed on inverted light microscopy and scanning electron microscopy. The characterization of mesenchymal cell markers, cytoskeleton, and progression stages of the cell cycle, cell death and mitochondrial electric potential were performed by flow cytometry. The biochemical function was performed by analysis of liver transaminases and the production of free radicals lipoperoxidados. The results found in rats\' mating isogenic Fischer 344 followed the protocol of 12 hours of light reaching the reproductive rate satisfactory. The isolation and separation of the liver bud of this strain of mice allowed the isolation, expansion and characterization of a primary culture at different days of gestation, 12.5, 14.5 and 16.5 days. The morphological features were found of spindle cell type to fibroblast-like cells of the liver bud in culture. Analyses of hepatic transaminases GOT and GPT showed lower concentrations in the period 12.5 days of gestation. The expression of stem cell markers of mesenchymal origin (CD90, Nanog, Oct STRO1 and ¾), cytoskeletal markers (CK8, CK18 and desmin) markers involved in checking and cell cycle progression (P53, P21, P27 and Cyclin D1) and markers involved in apoptosis (Annexin V / PI, caspase 3, Bax, Bad and Bcl2) showed differentially expressed in different gestational periods. In the analysis of mitochondrial electrical potential in the gestation periods of 14.5 and 16.5 days, it was observed the higher proportion of quiescent cells with lower metabolic of functional capacity when compared to the periodo of 12.5 days or even compared to a normal hepatocyte adult rat. In the analysis of cell cycle phases it was observed the concentration of cell in the G0/G1 phase, resulting in modulation of proliferation capacity and the increase in the proportion of cells with fragmented DNA, CBH in the period 16.5 days compared to other periods and the normal hepatocyte. The increase of DNA fragmentation on average 3.5 and 2.3 times respectively in the periods of 12.5 and 14.5 days of gestation. The synthesis and cellular division of CBH was maintained in all stages of pregnancy. The free radicals lipoperoxidados showed insignificant amounts of CBH in the days of gestation.

Infectious bovine keratoconjunctivitis (IBK) is the main ocular disease of cattle. Highly contagious, it is responsible for significant economic losses of livestock worldwide. Moraxella bovis is recognized as the primary agent of the disease in cattle. However, the occurrence of other similar species, including M. ovis and M. bovoculi, recently described, have been common in outbreaks of the disease and are suspected to be causally related to the limited success of preventive measures, especially the use of bacterins containing only strains of M. bovis. This dissertation describes the antigenic characterization of M. bovis, M. bovoculi and M. ovis strains and a commercial vaccine by cross-reactivity using flow cytometry analysis and identification of immunodominant conserved antigens by Western blotting. Antisera against strains of the three species were obtained from immunization of New Zealand rabbits and challenged before a panel of strains isolated from cattle and sheep clinically affected by the disease between 1983 and 2013 as well as reference strains of each species. Field strains of M. bovoculi (Mbv2 and Mbv3) recognized satisfactorily all heterologous strains. However, Mbv3 (M. bovoculi), Mov2 (M. ovis) and Mov3 (M. ovis) strains stood out as the most intense recognition strains of their respective species and suggest that species-specific antigens play an important role in the host immune response. The association of reactivity percentage with the antigenic profiles, evidenced by Western blotting analysis, indicates that the immune response induced by Moraxella spp. appears to be mediated by multiple surface antigens of which many are shared between the three species. Among 32 different proteins identified, 22 (68.7%) were recognized by at least one antiserum in the protein extracts of all strains analyzed by Western blotting. Our study suggests (1) the selection and combination of M. bovis, M. bovoculi and M. ovis strains to be used in the composition of antigenic unit vaccines as IBK control strategy and (2) the use of flow cytometry as the most appropriate methodology for this selection. / Ceratoconjuntivite infecciosa bovina (CIB) é a principal doença ocular de bovinos. Altamente contagiosa, é responsável por significativas perdas econômicas para a pecuária no mundo inteiro. Moraxella bovis é, reconhecidamente, o agente primário da enfermidade em bovinos. Contudo, a ocorrência de outras espécies do gênero, incluindo M. ovis e M. bovoculi, recentemente descrita, têm sido comuns em surtos da doença e são suspeitas de serem causalmente associadas ao sucesso limitado de medidas preventivas, sobretudo do uso de bacterinas contendo apenas cepas de M. bovis. Esta dissertação descreve a caracterização antigênica de cepas de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis e de uma vacina comercial através da análise de reatividade cruzada por citometria de fluxo e da identificação de antígenos imunodominantes e conservados através de Western blotting. Antissoros contra cepas das três espécies foram obtidos a partir da imunização de coelhos Nova Zelândia e desafiados frente a um painel de cepas isoladas de bovinos e ovinos clinicamente acometidos pela doença entre 1983 e 2013 assim como cepas de referência de cada espécie. Cepas de campo de M. bovoculi (Mbv2 e Mbv3) reconheceram satisfatoriamente todas as cepas heterólogas. Contudo, as cepas Mbv3 (M. bovoculi), Mov2 (M. ovis) e Mov3 (M. ovis) destacaram-se pela maior intensidade de reconhecimento de cepas de suas respectivas espécies e sugerem que antígenos espécie-específicos desempenham importante papel na resposta imune do hospedeiro. A associação dos percentuais de reatividade aos perfis antigênicos evidenciados através da análise por western blotting indica que a resposta imune induzida por Moraxella spp. parece ser mediada por múltiplos antígenos de superfície dos quais, diversos são compartilhados entre as três espécies. Entre 32 diferentes proteínas detectadas, 22 (68,7%) foram reconhecidas por pelo menos um antissoro nos extratos protéicos de todas as cepas analisadas por western blotting. Nosso estudo sugere a seleção e combinação de cepas de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis circulantes para composição da unidade antigênica de vacinas como estratégia de controle de IBK e a utilização de citometria de fluxo como metodologia mais adequada para esta seleção.

INTRODUÇÃO: A Leucemia/Linfoma de células T do adulto (ATL) é uma doença linfoproliferativa crônica com transformação clonal predominantemente de linfócitos TCD4+, causada pelo vírus linfotrópico T humano do tipo I (HTLV-I). A ATL se desenvolve em 3-5% dos portadores do vírus HTLV-I, após longo período de latência clínica, acompanhado de expansão clonal dos linfócitos infectados. As células da ATL apresentam várias anormalidades cromossômicas, semelhantes àquelas resultantes de disfunção telomérica e a instabilidade genômica contribui para o desenvolvimento da ATL. Para entender o papel do encurtamento telomérico na oncogênese da ATL, avaliamos o comprimento dos telômeros de linfócitos TCD4 e TCD8 em portadores do vírus HTLV-I e em portadores de ATL. RESULTADOS: Não foi evidenciada diferença significativa no comprimento de telômero dos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ entre portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis, assim como, entre portadores de ATL e indivíduos saudáveis. Entretanto, quando incluímos na análise a variável idade, evidenciamos redução significativa do comprimento do telômero com a idade em portadores do vírus HTLV-I e maior perda telomérica nos portadores do vírus HTLV-I e portadores de ATL em relação aos indivíduos saudáveis de mesma idade, embora a diferença entre os grupos não atinja o nível de significância estatística. Estes resultados podem ser explicados pelo fato de que as células dos indivíduos infectados pelo vírus HTLV-I apresentam maior taxa proliferativa devido à ação viral, mesmo em estado de latência clínica. A perda telomérica em função da idade nos portadores de ATL não demostrou-se significativa devido ao pequeno número de casos analisados em decorrência da raridade da doença. Entretanto, quando analisamos o comprimento telomérico nos subtipos linfocitários de portadores de ATL, evidenciamos acentuada perda telomérica na célula maligna e valores próximos ao limite superior esperado para a idade no subtipo linfocitário não transformado, demonstrando que a disfunção telomérica deve estar associada à transformação celular. Estabelecemos valores de referência de comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ de indivíduos saudáveis, definidos por faixa etária. CONCLUSÃO: Nossos resultados demonstram que portadores do vírus HTLV-I apresentam maior perda telomérica em função da idade que indivíduos saudáveis, mas, sem refletir significância estatística e clínica. Entretanto, portadores de ATL apresentam perda acentuada de comprimento de telômero na célula maligna, demonstrando que a determinação do comprimento de telômero pode auxiliar futuramente o monitoramento dos indivíduos infectados pelo HTLV-I, indicando conversão à doença / INTRODUCTION: Adult T-cell Leukemia/Lymphoma (ATL) is a chronic lymphproliferative disease with clonal transformation predominantly of the TCD4+ lymphocytes, caused by the Human T lymphotropic virus type-I (HTLV-I). ATL develops itself in 3-5% of HTLV-I carriers after a long period of clinical latency accompanied by clonal expansion of the infected lymphocytes. The ATL cells present several chromosomic abnormalities, similar to those resulting from telomere dysfunction and the genomic instability contributes to the development of ATL. In order to understanding the role of telomeric shortening in the ATL oncogenesis, we assessed the length of telomeres of lymphocytes TCD4 and TCD8 in HTLV-I carriers and in ATL carriers. RESULTS: No significant difference was evidentiated in the telomere length of lymphocytary subtypes TCD4+ and TCD8+ between HTLV-I carriers and healthy subjects, as well as, between ATL carriers and healthy subjects. However, when the age variable was included in the analysis, we observed significant decrease of telomeric length with age progression in HTLV-I carriers and higher telomeric loss in HTLV-I carriers and ATL carriers when compared to healthy subjects of the same age, although the difference between groups does not reach the level of statistic relevance. These results may be explained by the fact that the cells of HTLV-I infected subjects present higher proliferative rate due to the viral action, even during clinical latency. Age-related telomeric loss in ATL carriers did not manifest itself as significant due to the small number of analyzed cases as a consequence of the diseases rareness. However, when the telomere length on the lymphocytary subtypes of ATL carriers was analyzed, we evidentiated accentuated telomeric loss in the malignant cell and values close to the age-expected upper limit in the nontransformed lymphocytary subtype, demonstrating that the telomere dysfunction may be associated to the cellular transformation. We have determined reference values of telomere length for lymphocytary subtypes TCD4+ and TCD8+ on healthy subjects, defined by age range. CONCLUSION: Our results demonstrate that HTLV-I carriers present higher telomeric loss due to age than healthy subjects, however, with no reflection in clinical and statistical significance. Nevertheless, ATL carriers present accentuated loss of telomere length in the malignant cell, demonstrating that the telomere length determination may, in the future, assist in the monitoring of HTLV-I infected subjects, indicating conversion to the disease

A atividade do sistema nervoso central (SNC) afeta aquela do sistema imune e esta por sua vez, através de produtos originados em células imunes, como por exemplo, as citocinas modificam a atividade cerebral e, portanto, alguns comportamentos. O ato de conviver com pessoas portadoras de um tumor ou de patologias crônicas debilitantes tem sido estudado por vários pesquisadores, os quais têm relatado evidencias que mostram ser algumas condições psicológicas experimentadas por ?caregivers? associadas com variações de comportamento e de imunidade. Manifestações de estresse têm sido intensamente estudadas nestas pessoas. Neste sentido, e guardado os devidos cuidados com as extrapolações, não existe um modelo animal especificamente desenvolvido para analisar, em laboratório, as eventuais alterações imunes que possam ocorrer em animais que convivem com um outro doente. Este foi o objeto do presente trabalho. Mais especificamente, avaliou-se a existência de uma possível interação neuroimune em camundongas que coabitaram com outras portadoras de um tumor de Ehrlich, através da análise de parâmetros hematológicos, imunológicos, hormonais, comportamentais e neuroquímicos. Os resultados obtidos mostraram que a convivência por 11 dias com um animal portador do tumor de Ehrlich produziu em camundongas: 1) leucopenia; 2) diminuição do burst oxidativo induzido por PMA e por S. aureus e da porcentagem e, também da intensidade de fagocitose de neutrófilos sanguíneos; 3) aumento do burst oxidativo e redução da porcentagem, mas não alterou a intensidade de fagocitose de macrófagos ativados pelo ONCO-BCG; 4) diminuição da resistência ao crescimento de um tumor de Ehrlich, isto é, aumentou a concentração de células tumorais/ml de líquido ascítico e o número total de células tumorais; 5) redução do número de leucócitos circulantes em animais inoculados com o tumor de Ehrlich; 6) diminuição dos níveis hipotalâmicos de noradrenalina e aumento daqueles de dopamina e de MHPG; 7) aumento do ?turnover? de noradrenalina no hipotálamo e de dopamina no córtex frontal; 8) aumento dos efeitos da anfetamina sobre alguns parâmetros da atividade locomotora dos animais observados no campo aberto; 9) potenciou os efeitos de um tratamento com diazepam, reduzindo ainda mais o burst oxidativo induzido por PMA e por S. aureus assim como os efeitos do fármaco sobre a porcentagem e a intensidade de fagocitose de neutrófilos sanguíneos. No entanto, esta convivência não modificou a média do número de eritrócitos, a porcentagem do hematócrito e o volume corpuscular médio, assim como a atividade de macrófagos peritoneais residentes e, não interferiu com os níveis de corticosterona sérica dos animais. Em seu conjunto, os presentes resultados mostraram que a convivência com animais portadores de um tumor ascítico de Ehrlich produziu alterações comportamentais, neuroquímicas e imunológicas, que guardam grande similaridade com sinais e sintomas relatados em caregivers. Estas alterações foram interpretadas como decorrentes de uma situação de estresse psicológico prolongado vivenciado pelas camundongas companheiras de conspecíficas portadoras de um tumor. Mais especificamente, postulou-se, neste trabalho, sejam as alterações observadas decorrentes de um aumento de atividade catecolaminérgica no SNC e/ou de ativação do SNAS. A semelhança dos resultados obtidos em companheiras de animais doentes com aqueles de caregivers permitiu sugerir, tomados os devidos cuidados com extrapolações, seja o modelo experimental agora usado de alguma utilidade para a compreensão da situação vivenciada por estes caregivers / The activity of the central nervous system (CNS) affects the immune system, which by means of products molecules synthesized by its cells, modify the activity of the CNS, and, consequently, animal behavior. People that care for and support the needs of patients bearing tumors or with chronic, debilitating diseases, have been studied by many groups, with evidences pointing towards an association between some psychological conditions experienced by caregivers and changes in behavior and immunity. Stress-associated symptoms have been intensely studied in these people. Thus, taking into account the required grounds reasonable comparisons, there was no description of a suitable model for laboratory analysis of possible changes in immunity of animals cohabiting with a sick cage-mate. Therefore, the objective of this study was to establish a suitable model for this purpose. We particularly aimed on possible neuroimmune interaction in female mice that had cohabited with Ehrlich tumor-bearing mice, using for comparison hematological, immune, hormonal, behavioral, and neurochemical parameters. The results of this study show that cohabiting with a sick mate - mice bearing the Ehrlich tumor - for 11 days induced, in female mice: 1) leukopenia; 2) decrease in PMA- or S. aureus-induced oxidative burst, and also of the percentage and intensity of phagocytosis by circulating neutrophils; 3) increase in oxidative burst and reduction in the percentage, but did not influence intensity of phagocytosis by ONCO-BCG-activated macrophages; 4) decrease in the resistance to the progression of the Ehrlich tumor, shown by the enhanced concentration of tumor cells per ml of the ascitic fluid, and total number of tumor cells; 5) reduction in the number of circulating leukocytes in animals injected with the Ehrlich tumor; 6) diminished hypothalamic levels of noradrenaline and increased those of dopamine and MHPG in the same region; 7) increased the turnover of noradrenaline in the hypothalamus, and of dopamine in the frontal cortex; 8) enhanced the effects of amphetamine on several parameters of motor activity observed in the open field arena; 9) potentiated the effects of diazepam, reducing the PMA- or S. aureus-induced oxidative burst, and on the percentage and intensity of phagocytosis by circulating neutrophils even further. Nonetheless, cohabiting with the sick mate did not alter the red cell count, the hematocrit, or the mean cell volume, nor did it influence the activity of resident peritoneal macrophages or interfere with serum corticosterone levels. Altogether, these findings show that cohabiting with animals bearing the ascitic Ehrlich tumor caused behavioral, neurochemical, and immunological changes compatible with those presented and described by caregivers. These changes are interpreted as related to a sustained, long-term situation of psychological stress experienced by the conspecific female healthy mates of the tumor-bearing mice. In particular, we postulate in this study that the changes observed might be driven by the increased cathecolaminergic activity in the CNS and/or by the activation of the sympathetic branch of the autonomic nervous system (SANS). The resemblance of the results obtained here and those seen in human caregivers allows the careful suggestion that this model may be relevant to help understanding the situation experienced by caregivers

A HAM/TSP é uma doença de caráter neurológico que acomete aproximadamente 5% dos infectados pelo vírus HTLV, afetando-os principalmente em sua capacidade locomotora. Não são conhecidos até o momento os fatores que fazem o indivíduo infectado desenvolver ou não as patologias associadas ao vírus. Nesse contexto, estudamos a participação das células natural killer T (NKT) visando contribuir na elucidação da patogênese da paraparasia espática tropical HAM/TSP. As células natural killer T (NKT) são um subtipo de linfócitos T, com capacidade efetora e auxiliar, e está associado à doenças infecciosas, alergias e a doenças autoimunes, e a hipótese deste trabalho é que elas participem da progressão da HAM/TSP. Após realizarmos testes para avaliação da ativação das NKT (PD-1), bem como avaliar sua capacidade de secretar IFN- y e Granzima B concluimos que as mesmas não possuem potencial de ativação na periferia e pressupomos que estas podem estar no sítio acometido pela patologia, o SNC. Neste contexto, nosso estudo acrescenta informações quanto à patogenia da HAM/TSP e contribui com conhecimento para a futura elucidação da doença / The HAM/TSP is a neurological disease that affects approximately 5% of HTLV infected individuals, especially in their locomotor capacity. They are not known yet the factors that make the infected individual to develop or not the pathologies associated with virus. In this context, we study the participation of natural killer T cells (NKT), trying to contribute to clarify the HAM/TSP pathogenesis. NKT cells are a subtype of lymphocytes with effector and helper capacities, and are associated with infectious, allergies and autoimmune diseases. Our hypothesis is that they participate in the progression of HAM/TSP. After evaluate the activation of NKT through PD-1 marker, as well evaluate assess their ability to secrete IFN-y and Granzyme B, we conclude that the NKT cells lack periphery in activation potential, and presuppose that they are present at the central nervous system, the site affected by the disease. In this context, our study adds information on the pathogenesis of HAM / TSP and contributes knowledge for future elucidation of disease