Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Mestrado (Priscila dos Santos).pdf: 1949971 bytes, checksum: 5d2bfc6944be7acb2dd8d954eea44bdd (MD5) Previous issue date: 2010-03-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da toxoplasmose baseia-se principalmente, na detecção de anticorpos específicos em soro de pacientes, por meio de ensaios sorológicos. As maiores limitações referem-se à alta prevalência de anticorpos de IgG e IgM persistentes por longos períodos, dificultando o diagnóstico da infecção aguda. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho da imunofluorescência indireta por citometria de fluxo para a pesquisa de anticorpos anti-taquizoítas fixados (AATF) de T. gondii e avidez de IgG no sorodiagnóstico da toxoplasmose aguda humana. Foram analisadas amostras de pacientes com toxoplasmose aguda (AG), crônica (CR), indivíduos não-infectados (NI) e pacientes portadores de outras doenças. A pesquisa de AATF IgM permitiu segregar os grupos AG e CR utilizando a diluição de soro 1:32.000 e ponto de corte (PC) de 40% de porcentagem de parasitos fluorescentes positivos (PPFP), com sensibilidade de 100% e especificidade de 90%. Na avaliação da reatividade cruzada de IgM foram encontrados resultados falso-positivos, apenas para pacientes portadores de malária e mononucleose infecciosa. Entretanto, a pesquisa de AATF IgG, utilizando PC de 10% PPFP e diluição do soro de 1:32.000 permitiu segregar apenas os grupos AG e NI, com 93,3% de sensibilidade e 100% de especificidade. Quanto à pesquisa de AATF subclasses de IgG, as diluições séricas escolhidas aplicadas no diagnóstico da toxoplasmose aguda, utilizando como controle o grupo NI foram 1:32.000 para IgG1, 1:400 para IgG2, 1:2.000/1:8.000 para IgG3 e 1:400/1:1.600 para IgG4 e PC de 10% PPFP, para todas as subclasses. Entretanto, apenas AATF IgG2 e AATF IgG4 apresentaram 100% de sensibilidade e especificidade. A pesquisa da avidez de IgG quando aplicada na segregação dos grupos AG e CR, apresentou 100% de sensibilidade e especificidade. Utilizando-se a pesquisa de AATF IgM como ensaio inicial, e avidez de IgG como ensaio confirmatório, foi possível estabelecer o diagnóstico da toxoplasmose aguda. Os índices de desempenho demonstraram melhor desempenho da pesquisa de anticorpos IgM anti-T. gondii e avidez de IgG por citometria de fluxo do que pelo sistema VIDAS® TOXO (ELFA Enzyme Linked Fluorescente Assay) no diagnóstico da toxoplasmose aguda. Esses resultados demonstram a aplicabilidade da citometria de fluxo para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii, como uma importante ferramenta no diagnóstico da toxoplasmose aguda. / The diagnosis of toxoplasmosis is based mainly on the detection of specific antibodies in sera of patients by serological tests. The major limitations of these tests are the high prevalence of IgG and IgM antibodies, which persist for long periods of time, hampering the diagnosis of acute infection. Therefore, the objective of this study was to evaluate the performance of an indirect immunofluorescence assay based on flow cytometry for the detection of the reactivity of anti-fixed tachyzoites antibodies (AFTA) of T. gondii and IgG avidity in the serodiagnosis of human acute toxoplasmosis. Serum samples from patients with acute toxoplasmosis (AC), chronic toxoplasmosis (CHR), non-infected individuals (NI), and patients with other diseases were analyzed. The analysis of AFTA IgM allowed to segregate groups AC and CHR using a serum dilution of 1:32,000 and a percentage of positive fluorescent parasites (PPFP) of 40% as cut off, resulting in 100% and 90% of sensitivity and specificity, respectively. However, the analysis of AFTA IgG using a PPFP of 10% as cut off and a serum dilution of 1:32,000 allowed to segregate only the group AC and NI, with 93,3% of sensitivity and 100% of specificity. The serum dilutions applied on the study of AFTA IgG subclasses in the diagnosis of acute toxoplasmosis using NI as control group were: 1:32,000 for IgG1, 1:400 for IgG2, 1:2,000 and 1:8,000 for IgG3, and 1:400 and 1:1,600 for IgG4. It was used a PPFP of 10% as a cut off for all subclasses. Moreover, only AFTA IgG2 and AFTA IgG4 showed 100% of sensitivity and specificity. The analysis of IgG avidity when to groups AC and CHR, showed 100% of sensitivity and specificity. Using the AFTA IgM as the initial test and IgG avidity as a confirmatory test, it was possible to establish the diagnosis of human acute toxoplasmosis. The evaluation of IgM cross-reactivity demonstrated false-positive results only for patients with malaria and infectious mononucleosis. The detection of IgM anti-T. gondii antibodies and IgG avidity by flow cytometry showed a better performance in comparison to the VIDAS® TOXO (ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay) in the diagnosis of acute toxoplasmosis. These results demonstrate the applicability of the detection of anti-T. gondii antibodies by flow cytometry and its importance in the diagnosis of human acute toxoplasmosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:46:29Z : No. of bitstreams: 1 murador_p_dr_botfm.pdf: 1737625 bytes, checksum: 382b432b89ced80d3363c6e9187d9d58 (MD5) / A engenharia de tecidos tem se mostrado promissora para o tratamento de lesões e doenças da uretra. No presente estudo, foi demonstrada a caracterização das células de músculo liso de bexiga de coelhos e seu implante em matrizes acelulares de aorta de suínos para reparo de lesão na uretra de coelhos. Aortas de dez suínos foram obtidas, descelularizadas e colocadas em cultura com células de músculo liso provenientes de bexiga de dez coelhos, para servirem como modelo no reparo de tecido uretral. As aortas foram descelularizadas com sodium dodecyl sulfate (SDS) a 0,1% e tiveram seu coeficiente de rigidez testado, cujos resultados demonstraram a mesma resistência antes e depois do processo. As células de músculo liso cultivadas foram caracterizadas por citometria de fluxo com o anticorpo anti-CD90 e por imunocitoquímica usando o anticorpo Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (- SMA). Com os resultados da citometria de fluxo excluiu-se a possibilidade da presença de células-tronco mesenquimais ou fibroblastos junto à cultura de células de músculo liso, enquanto que com a imunocitoquímica comprovou-se o perfil das células de músculo liso. A viabilidade das células foi mantida em 99,31% quando em contato com a matriz, demonstrando que o modelo proposto é um excelente biomaterial para uso como scaffold de células. Seu uso na reconstrução de uretra com lesões complexas pode ser considerado com otimismo, podendo resolver problemas relacionados à quantidade insuficiente de tecido na região / Tissue engineering has shown promise for treatment in urethras injuries and diseases. In the present study, we demonstrated the rabbits smooth muscle cells of the bladder characterization and their implantation in an acellular porcine aorta for repairing injuries in rabbits urethras. Ten porcine abdominal aortas were obtained and placed in culture with rabbit bladders smooth muscle cells from ten animals to serve as a template for the repair of urethral tissue. The aortas were deccelularized with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and had a coefficient of stiffness test, whose results showed the same resistance before and after the process. The smooth muscle cultured cells were characterized by flow cytometry with anti-CD90 antibody and by immunocytochemistry using Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (-SMA) antibody. The results of flow cytometry excluded the possibility of the presence of mesenchymal stem cells or fibroblasts by the smooth muscle cells culture, whereas immunocytochemistry confirmed the profile of smooth muscle cells. When in contact with the matrix, cell viability was maintained at 99.31%, demonstrating that the proposed model is an excellent biomaterial for use as cell scaffold. Its use in urethral complex lesions reconstruction can be seen with optimism and solve problems related to insufficient quantities of urinary tissue

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 638342 bytes, checksum: 8e72262147ec2f82c5e75db8ecf80969 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Somatic embryogenesis is an alternative technique of clonal micropropagation in Carica papaya, taking into account the problems generated by the conventional seed propagation and the absence of an effective method for early sex determination of this trioecious species. Considering the interest in large-scale seedlings production of papaya, liquid system and the use of immature zygotic embryos as explant source have proved to be more efficient for the somatic embryos generation in quickly way and in relatively high amount. However, tissue culture techniques are frequently associated with somaclonal variation ocorrence. Therefore, detection and selection of somaclones become necessary, and different methodologies have been employed for this purpose. In this perspective, this study adapted a protocol for mass production of somatic embryos in liquid medium and adopted cytometry and cytogenetics strategies for monitoring somaclonal variation in papaya. Firstly, immature zygotic embryos, which show a high embryogenic potential, were cultured in semi-solid médium, in the presence of 2,4-D, for friable embryogenic callus induction. The transfering of these callus to a liquid system, under the 2,4-D and BAP regulators action, allowed the increase of the cell aggregates proliferation. This auxin and cytokinin ratio was ideal for allowing only cell proliferation rather than differentiation of the suspensions in somatic embryos. These were converted and matured after inoculation of aggregates in liquid medium supplemented with ABA. In this condition, somatic embryos suspensions were obtained, in the early heart, torpedo, pre-cotyledonary and cotyledonary stages. Direct somatic embryogenesis, without callus formation, was also observed from the primary somatic embryos. Cotyledonary embryos were extracted and germinated on semi-solid medium containing GA3. About 80% of plantlets were regenerated and subjected to in vitro acclimatization. The potential of the flow cytometry technique could be demonstrated by verifying the ploidy level of regenerants and, thus, the evaluation of somaclonal variation occurrence. In this screening, diploid (88%), tetraploid (6%) and aneuploid (6%) seedlings were detected. For cytogenetic methodology, known diploid seedlings had their karyograms assembled, in which it did not observe any numerical or structural change. The association of flow cytometry and cytogenetics methodologies has proven effective for somaclonal variants characterization and the interest diploid seedlings selection for clonal propagation. Mainly, flow cytometry can be considered a viable technique for commercial purposes. / A embriogênese somática é uma técnica alternativa de micropropagação clonal em Carica papaya, tendo em vista os problemas gerados pela propagação convencional, via seminífera, e a ausência de um método eficaz para determinação sexual precoce dessa espécie trióica. Considerando o interesse pela produção em larga escala de plântulas do mamoeiro, o sistema líquido e o uso de embriões zigóticos imaturos como fonte de explante têm se mostrado mais eficientes para a geração de embriões somáticos de forma rápida e em quantidade relativamente elevada. Entretanto, técnicas de cultura de tecidos estão, frequentemente, associadas com a ocorrência de variação somaclonal. Portanto, a detecção e a eliminação de somaclones tornam-se necessárias, e diferentes metodologias têm sido empregadas para tal fim. Nesta perspectiva, este estudo adaptou um protocolo para produção em massa de embriões somáticos em meio líquido e adotou estratégias citométricas e citogenéticas para o monitoramento de variação somaclonal, em mamoeiro. Inicialmente, embriões zigóticos imaturos, que apresentam alto potencial embriogênico, foram cultivados em meio semi-sólido, na presença de 2,4-D, para indução de calos embriogênicos friáveis. A transferência desses calos para um sistema líquido, sob a ação dos reguladores 2,4-D e BAP, possibilitou a ampliação da proliferação de agregados celulares. Esta combinação de auxina e citocinina foi ideal por possibilitar somente a proliferação celular e não a diferenciação das suspensões em embriões somáticos. A conversão e a maturação destes ocorreram após a inoculação dos agregados em meio líquido suplementado com ABA. Nesta condição, foram obtidas suspensões de embriões somáticos, nos estágios cordiforme, torpedo, pré-cotiledonar e cotiledonar. Embriogênese somática direta, sem a formação de calos, também foi observada a partir dos embriões somáticos primários. Embriões no estágio cotiledonar foram extraídos e germinados em meio semi-sólido contendo GA3. Cerca de 80% de plântulas foram regeneradas e submetidas à aclimatização in vitro. A potencialidade da técnica de citometria de fluxo pôde ser demonstrada pela verificação do nível de ploidia dos regenerantes e, consequentemente, pela avaliação da ocorrência de variação somaclonal. Neste escaneamento, foram detectadas plântulas diplóides (88%), tetraplóides (6%) e aneuplóides (6%). Pela metodologia citogenética, plântulas conhecidamente diplóides tiveram seus cariogramas montados, nos quais não foi observada nenhuma alteração numérica ou estrutural. A associação de metodologias citométricas de fluxo e citogenéticas se mostrou eficaz para a caracterização de variantes somaclonais e para a seleção das plântulas diplóides de interesse para a propagação clonal. Principalmente, a citometria de fluxo pode ser considerada uma técnica viável para fins comerciais.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881362 bytes, checksum: 0e498263c87a06e3c091110afa80ddfe (MD5) Previous issue date: 2012-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Tissue culture techniques are often associated with the occurrence of somaclonal variation, characterized by a genetic/epigenetic alteration found in cells, embryos, organs or in vitro grown plants, due to stress conditions imposed by the system. The propagation process involving the calogenesis step has a higher susceptibility to variation, because of many cell divisions. Calli are disorganized cell masses, whose cells divide at different rates depending on where they are located in relation to the culture medium, therefore, they are not considered homogeneous materials. Flow cytometry is a tool that has been used to evaluate the competence of somatic embryogenesis in callus, both to identify the different types as possible and to detect early changes in DNA content of their cells. However, there are no reports in the literature of the flow cytometry use to determine the existence of heterogeneity in relation to the DNA content in callus. In this perspective, the present work adapted this methodology for friable Passiflora cincinnata calli in order to verify the existence of vertically regionalized heterogeneity in relation to DNA ploidy level, and relate it to factors inductors of somaclonal variation, such as cultivation time and subculture numbers. Initially, P. cincinnata cotyledonary leaves were inoculated onto semi-solid medium containing 2, 4-D and BA, for friable embryogenic callus induction. The calli were multiplied and subcultured at different times, thus generating three callus types: new, intermediate and old. Twenty calli of each type were subjected to sagittal cuts resulting two layers (I, II) in new calli, and three layers (I, II and III) in intermediate and old calli, totalizing 160 layers, which were analyzed by flow cytometry. Six different DNA ploidy levels and multiploidies were detected in the layers. In new calli, 25% were heterogeneous, i.e. at least one callus layer showed different DNA ploidy level from the others, differently from intermediate and old calli, which 75% and 63% were heterogeneous, respectively. The homogeneous new calli were predominantly diploid. The highest DNA ploidy levels were observed in the layers in contact with the culture medium on intermediate calli, and 4C and 4C/8C cells were more evident in older calli. These observations suggest that the appearance of new DNA ploidy levels between the layers and between the different callus types is related to the exposure time to the medium containing relatively high concentration of 2,4-D. It was also possible to verify that the layer in contact with the culture medium is more proliferative when compared the percentages of the G2 peaks in homogeneous diploid calli. The heterogeneity in DNA ploidy level between the layers was observed, and it implies that parts of a callus cannot infer about a whole callus. This work suggests that time influences the appearance of different DNA ploidy levels in calli induced in vitro. / Técnicas de cultura de tecidos estão frequentemente associadas com a ocorrência de variação somaclonal, caracterizada pela alteração genética e/ou epigenética encontrada em células, embriões, órgãos ou plantas cultivadas in vitro, em decorrência das condições de estresse impostas pelo sistema. O processo de propagação que envolve a etapa de calogênese apresenta maior susceptibilidade à ocorrência de variação, em função das inúmeras divisões celulares. Calos são massas celulares não organizadas, cujas células se dividem a diferentes velocidades dependendo de onde se localizam em relação ao meio de cultura; portanto, não são considerados materiais homogêneos. A citometria de fluxo é uma ferramenta que tem sido utilizada para avaliar a competência da embriogênese somática em calos, tanto para identificar seus diferentes tipos quanto para detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA de suas células. No entanto, não há relatos na literatura da utilização da citometria de fluxo para verificar a existência da heterogeneidade quanto ao conteúdo de DNA em calos. Nesta perspectiva, o presente trabalho adaptou essa metodologia para calos friáveis de Passiflora cincinnata, a fim de verificar a existência de heterogeneidade verticalmente regionalizada, em relação à ploidia de DNA, e relacioná-la com fatores de indução de variação somaclonal, como tempo de cultivo e número de subcultivos. Inicialmente, folhas cotiledonares de P. cincinnata foram inoculadas em meio semissólido contendo 2,4-D e BA, para indução de calos embriogênicos friáveis. Os calos foram multiplicados e subcultivados em diferentes tempos, gerando, assim, três tipos de calos, denominados como novos, intermediários e velhos. Vinte calos de cada tipo foram submetidos a cortes sagitais que resultaram duas camadas (I e II) em calos novos, e três camadas (I, II e III) em calos intermediários e velhos, totalizando 160 amostras que foram analisadas por citometria de fluxo. Seis diferentes ploidias de DNA e multiploidias foram detectadas nas camadas. Em calos novos, 25% deles foram heterogêneos, ou seja, pelo menos uma camada apresentou nível de ploidia de DNA diferente das demais, diferentemente dos calos intermediários e velhos, os quais 75% e 63% foram heterogêneos, respectivamente. Os calos novos homogêneos foram predominantemente diploides. As ploidias de DNA mais altas foram observadas nas camadas em contato com o meio de cultura em calos intermediários, e células 4C e 4C/8C foram mais evidentes em calos velhos. Essas observações sugerem que o surgimento de novos níveis de ploidia entre as camadas e entre os calos de diferentes tipos está relacionado com o tempo de exposição ao meio contendo concentração relativamente alta de 2,4-D. Foi possível, também, verificar que a camada em contato com o meio é mais proliferativa quando se comparou os percentuais dos picos G2 de calos diploides homogêneos. A heterogeneidade quanto ao nível de ploidia de DNA entre as camadas foi constatada e isto implica que partes de um calo não podem inferir sobre um calo inteiro. Esse trabalho sugere que o tempo influenciou o surgimento de diferentes ploidias de DNA em calos induzidos in vitro.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1076965 bytes, checksum: 39f371186cedd4587ea0ad27b341a26b (MD5) Previous issue date: 2012-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The anther culture has been applied in tomato as an attempt to induce callogenesis followed by regeneration of haploid and doubled haploid plants. By this technique, homozygous lines can be obtained, which has been considered relevant to breeding programs and molecular techniques. The androgenetic response can be influenced by several factors, especially the development stage of microsporogenesis. In this perspective, this study adapted a protocol by associating of flow cytometry and cytogenetic techniques in order to relate the development stages of microsporogenesis in tomato anthers to their size, aiming to select anthers profiles to be inoculated into culture medium. After a flow cytometry protocol was adapted for calli obtained in vitro, in order to monitor the DNA ploidy level. The nuclear suspensions analyzed by flow cytometry were obtained from digestion of anther cells and further homogenization using a mini mixer. The histograms showed low CV s, being considered suitable for cytometric analysis. Thus, anthers small (0.5 0.7 mm), showing cells in interphase/prophase I, exhibited a histogram profile similar to that observed in diploid leaf, and anthers large (1.6 1.9 mm), containing tetrad and microspores, showed an haploid peak and a G2 peak enlarged due to the presence of tetrads. From these analyzes, anthers of flower buds 1 5 mm, with size corresponding to those analyzed by flow cytometry and cytogenetics (0.5 1.9 mm), were inoculated in the callogenesis induction medium, to identify the phases more responsive to the condition in vitro. The basal MS medium supplemented with 2 mg L-1 AIA and 1 mg L-1 2 ip, induced 21.7% of callogenesis, and the highest percentage of calli was obtained from anthers of flower buds 2.0 3.9 mm, corresponding to the phases prophase I to anaphase II. The calli were analyzed by flow cytometry to identify the DNA ploidy. The chopping performed on calli afforded the nuclei isolation, and histograms with CV s considered suitable were obtained. The cytometric analysis revealed that the all calli were multiploids, each of which presented one of five classes of DNA ploidy levels, namely: 2C-4C-8C-16C; 2C-4C-8C-16C-32C; 4C-8C; 4C-8C-16C; 8C-16C-32C. A total of 44.4% of calli analyzed showed five levels of DNA ploidy. A statistical test of interaction showed that the size of flower buds had no effect on polyploidization occurred in the calli. These data evidence the somaclonal variation occurrence, which, probably, results from the interaction of genotype with growth regulators added to the induction medium. / A cultura de anteras tem sido aplicada em tomate como tentativa à indução de calogênese seguida da regeneração de plantas haplóides e duplo-haplóides. Por meio desta técnica, linhas homozigóticas podem ser obtidas, o que tem sido considerado relevante para programas de melhoramento e técnicas moleculares. A resposta androgenética pode ser influenciada por diversos fatores, destacando-se, dentre eles, o estádio de desenvolvimento da microsporogênese. Nesta perspectiva, este estudo adaptou um protocolo associando técnicas de citometria de fluxo e citogenética para relacionar as fases de desenvolvimento da microsporogênese em anteras de tomate com o tamanho das mesmas. O objetivo desta associação foi selecionar perfis de anteras a serem inoculadas em meio de cultura. Posteriormente, adaptou-se um protocolo de citometria de fluxo para os calos obtidos in vitro, a fim de monitorar o nível de ploidia de DNA. As suspensões nucleares analisadas pela citometria de fluxo foram obtidas com digestão das anteras e posterior homogeneização das células usando um mini mixer. Os histogramas obtidos mostraram baixos CV s, sendo considerados adequados para a análise citométrica. Dessa forma, anteras pequenas (0,5 0,7 mm), na fase de intérfase/prófase I, apresentaram um perfil de histograma semelhante ao observado em folha diplóide, e anteras grandes (1,6 1,9 mm) na fase de tétrades e micrósporos apresentaram um pico haplóide e um aumento em G2 em função da presença de tétrades. A partir destas análises, as anteras de botões florais de 1 5 mm, com tamanho correspondente aos daquelas analisadas por citometria de fluxo e citogenética (0,5 1,9 mm) foram inoculadas em meio de indução de calogênese, visando identificar as fases mais responsivas a esta condição in vitro. O meio MS basal, suplementado com 2 mg L-1 de AIA e 1 mg L-1 de 2 ip, induziu 21,7% de calogênese, e o maior percentual de calos foi obtido a partir de anteras de botões florais com 2,0 3,9 mm, correspondendo às fases prófase I a anáfase II. Os calos foram analisados pela citometria de fluxo a fim de identificar a ploidia de DNA. O chopping realizado nos calos proporcionou o isolamento dos núcleos, e histogramas com CV s considerados adequados foram obtidos. A análise citométrica evidenciou que todos os calos eram multiplóides, sendo que cada um apresentou uma das cinco classes de níveis de ploidia de DNA, a saber: 2C-4C-8C-16C; 2C-4C-8C-16C-32C; 4C-8C; 4C-8C-16C; 8C-16C-32C. Um total de 44,4% dos calos analisados apresentaram cinco níveis de ploidia de DNA. Um teste estatístico de interação mostrou que o tamanho dos botões florais não influenciou na poliploidização ocorrida nos calos. Estes dados evidenciam a ocorrência de variação somaclonal que, provavelmente, é resultado da interação do genótipo com os reguladores de crescimento acrescidos ao meio de indução.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-28. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:49Z : No. of bitstreams: 1 000864246_20170424.pdf: 489469 bytes, checksum: c19a08a315ad19ed3168af383d6f2c4c (MD5) Bitstreams deleted on 2017-04-24T11:16:42Z: 000864246_20170424.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-04-24T11:17:27Z : No. of bitstreams: 1 000864246.pdf: 2233958 bytes, checksum: ab77439a6a7146a93b82b0e490020b02 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A prematuridade é a principal causa de mortalidade neonatal e os riscos de complicações decorrentes são inversamente proporcionais à idade gestacional na qual o parto ocorre. Diversos estudos na literatura demonstram o papel da resposta imune inata e dos receptores Toll-like (TLRs) durante a gestação normal e na presença de complicações gestacionais. A expressão de TLRs vem sendo avaliada principalmente nos tecidos da interface materno-fetal e os resultados de tais estudos são conflitantes. A investigação da expressão de TLRs em tecidos gestacionais é de grande importância para o entendimento da participação da imunidade inata em gestações normais e com desfechos gestacionais adversos, porém tais tecidos permitem análise somente após a resolução da gestação. Nesse contexto, uma possível fonte de estudo para análise de TLRs no decorrer da gestação em curso são as células do sangue periférico materno, uma vez são facilmente obtidas por punção venosa, além de possuírem papel fundamental na reposta imune inata e expressarem diversos tipos de TLRs. Objetivo: Traçar o perfil de expressão gênica e proteica de receptores Toll-like 1, -2, -4 e -6 em células mononucleares (PBMCs) e em neutrófilos do sangue periférico materno ao longo da gestação normal e na prematuridade. Materias e métodos: Foram incluídas no estudo 119 gestantes normais, as quais foram subdivididas em trimestres de acordo com sua idade gestacional. Além disso, foram avaliadas 20 gestantes em trabalho de parto pré-termo e 18 gestantes de termo. A análise de expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real e a avaliação da expressão proteica por citometria de fluxo. Para a análise dos dados foram empregados os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney através do software SigmaStat 3.1. Resultados: Em relação às PBMCs, não foram observadas diferenças significativas nas expressões gênica e... / Introduction: Prematurity is the leading cause of neonatal mortality and serious neonatal morbidity worldwide and the risk is inversely proportional to gestational age at birth. Several studies demonstrate the role of innate immune response and Toll-like receptors (TLRs) in normal and complicated pregnancies, however most studies have focused on the tissues of the maternal-fetal interface. Research of the expression of TLRs in gestational tissues is of great importance for understanding the involvement of innate immunity in normal pregnancies and adverse pregnancy outcomes, but the analysis of these tissues allows for results only after the complete resolution of gestation. In this scenario, a potential biological sample of interest for analysis of TLRs in the ongoing gestation are maternal peripheral blood cells, since they play a crucial role in the immune system and express high levels of many of the TLRs. Main: Evaluate the profile of gene expression of TLR-1, -2, -4 and -6 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and polymorphonuclear cells (PMNs) and compare these expressions between preterm and term pregnancies. Materials and methods: 119 normal pregnant women were included in the study, subdivided into three groups according to the gestational trimester. In addition, 20 pregnant women in preterm labor and 18 pregnant women at term were evaluated. Gene expression analysis was performed by real-time PCR and protein expression evaluation by flow cytometry. Statistical analyses were performed using the nonparametric Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests by SigmaStat 3.1 software. Results: Regarding PBMCs, there were no significant differences in gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 among the trimesters. The same was observed when comparing PBMCs of preterm and term pregnancies. In relation to neutrophils, gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 remained unchanged throughout normal ...

FAPESP - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo / Os macrófagos desempenham papéis importantes na mediação de respostas imunes inatas induzidas pelo Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV) e são protagonistas da conexão entre estas respostas com a imunidade adaptativa. O IBV se replica nas células epiteliais e em macrófagos residentes nos órgãos respiratórios do Gallus gallus domesticus, no entanto, os mecanismos de geração da resposta imune inata contra a infecção viral nesses tecidos, bem como, as alterações morfológicas dos macrófagos aviários, não estão caracterizados totalmente. Este estudo possuiu como objetivo analisar as respostas imunes inata e adaptativa humoral ao IBV por meio da detecção da disfunção mitocondrial de macrófagos aviários da linhagem HD11 infectados pela estirpe viral Mass-41 e da investigação da soroprevalência do IBV em planteis de hospedeiros não vacinados. As investigações foram realizadas com o uso das técnicas de Citometria de Fluxo e ELISA, de acordo com as instruções técnicas dos fabricantes. A expressão mais pronunciada de alterações nas células do sistema fagocítico mononuclear foi a de um número elevado de células apoptóticas precoces em todos os períodos pós-infecção. A infecção viral foi associada à despolarização da membrana mitocondrial e à produção de espécies reativas de oxigênio. No teste sorológico, foi observada uma positividade para anticorpos Anti-IBV de 34% no total dos planteis estudados. Este estudo demonstrou que a replicação viral leva à disfunção mitocondrial de macrófagos e, consequentemente, à imunossupressão dos hospedeiros. Além disso, evidenciou a importância da vacinação, visto que o IBV afeta diretamente a produção e viabilidade das aves, podendo levar à morbidade e mortalidade graves no rebanho. / The macrophages play an important role in mediating innate immune responses induced by the Infectious Bronchitis Virus (IBV) and are protagonists in the connection between these responses and adaptive immunity. The IBV replicates in epithelial cells and macrophages resident in the respiratory organs of Gallus gallus domesticus; however, the mechanisms of generation of innate immune response against viral infection in these tissues, as well as, the morphological alterations of the avian macrophages, have not been fully characterized. Therefore, this study aimed to analyze the innate immune and humoral adaptive responses to IBV through the detection of mitochondrial dysfunction of HD11 avian macrophages infected by the Mass-41 viral strain and the investigation of IBV seroprevalence in flocks of non-vaccinated hosts. The investigations were performed with the use of Flow Cytometry and ELISA techniques, according to the technical instructions of the manufacturer. The most pronounced expression of changes in mononuclear phagocytic system cells was that of a high number of early apoptotic cells, in all postinfection periods. Viral infection was associated with mitochondrial membrane depolarization and the production of reactive oxygen species. In the serological test, a positivity was observed for Anti-IBV antibodies of 34% in the total of the studied subjects. This study demonstrated that viral replication leads to mitochondrial dysfunction of macrophages and, consequently, host immunosuppression. In addition, it showed the importance of vaccination, since the IBV directly affects the production and viability of the birds, which can lead to serious morbidity and mortality in the flock. / Tese (Doutorado)

Orientador: Márcia Guimarães da Silva / Banca: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Banca: Roseane Mattar / Banca: Leandro Oliveira / Banca: Gisele Alborghetti Nei / Resumo: Introdução: A prematuridade é a principal causa de mortalidade neonatal e os riscos de complicações decorrentes são inversamente proporcionais à idade gestacional na qual o parto ocorre. Diversos estudos na literatura demonstram o papel da resposta imune inata e dos receptores Toll-like (TLRs) durante a gestação normal e na presença de complicações gestacionais. A expressão de TLRs vem sendo avaliada principalmente nos tecidos da interface materno-fetal e os resultados de tais estudos são conflitantes. A investigação da expressão de TLRs em tecidos gestacionais é de grande importância para o entendimento da participação da imunidade inata em gestações normais e com desfechos gestacionais adversos, porém tais tecidos permitem análise somente após a resolução da gestação. Nesse contexto, uma possível fonte de estudo para análise de TLRs no decorrer da gestação em curso são as células do sangue periférico materno, uma vez são facilmente obtidas por punção venosa, além de possuírem papel fundamental na reposta imune inata e expressarem diversos tipos de TLRs. Objetivo: Traçar o perfil de expressão gênica e proteica de receptores Toll-like 1, -2, -4 e -6 em células mononucleares (PBMCs) e em neutrófilos do sangue periférico materno ao longo da gestação normal e na prematuridade. Materias e métodos: Foram incluídas no estudo 119 gestantes normais, as quais foram subdivididas em trimestres de acordo com sua idade gestacional. Além disso, foram avaliadas 20 gestantes em trabalho de parto pré-termo e 18 gestantes de termo. A análise de expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real e a avaliação da expressão proteica por citometria de fluxo. Para a análise dos dados foram empregados os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney através do software SigmaStat 3.1. Resultados: Em relação às PBMCs, não foram observadas diferenças significativas nas expressões gênica e... / Abstract: Introduction: Prematurity is the leading cause of neonatal mortality and serious neonatal morbidity worldwide and the risk is inversely proportional to gestational age at birth. Several studies demonstrate the role of innate immune response and Toll-like receptors (TLRs) in normal and complicated pregnancies, however most studies have focused on the tissues of the maternal-fetal interface. Research of the expression of TLRs in gestational tissues is of great importance for understanding the involvement of innate immunity in normal pregnancies and adverse pregnancy outcomes, but the analysis of these tissues allows for results only after the complete resolution of gestation. In this scenario, a potential biological sample of interest for analysis of TLRs in the ongoing gestation are maternal peripheral blood cells, since they play a crucial role in the immune system and express high levels of many of the TLRs. Main: Evaluate the profile of gene expression of TLR-1, -2, -4 and -6 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and polymorphonuclear cells (PMNs) and compare these expressions between preterm and term pregnancies. Materials and methods: 119 normal pregnant women were included in the study, subdivided into three groups according to the gestational trimester. In addition, 20 pregnant women in preterm labor and 18 pregnant women at term were evaluated. Gene expression analysis was performed by real-time PCR and protein expression evaluation by flow cytometry. Statistical analyses were performed using the nonparametric Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests by SigmaStat 3.1 software. Results: Regarding PBMCs, there were no significant differences in gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 among the trimesters. The same was observed when comparing PBMCs of preterm and term pregnancies. In relation to neutrophils, gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 remained unchanged throughout normal ... / Doutor

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-01-04T19:56:36Z No. of bitstreams: 1 AndreaLucianaAraujoDaCunha_TESE.pdf: 62271689 bytes, checksum: f3e505d6758068c74606405cf05b2b9c (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-01-05T19:52:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AndreaLucianaAraujoDaCunha_TESE.pdf: 62271689 bytes, checksum: f3e505d6758068c74606405cf05b2b9c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-05T19:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaLucianaAraujoDaCunha_TESE.pdf: 62271689 bytes, checksum: f3e505d6758068c74606405cf05b2b9c (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Despite the advances in the cure rate for acute myeloid leukemia, a considerable number of patients die from their disease due to the occurrence of multidrug resistance (MDR). Overexpression of the transporter proteins P-glycoprotein (Pgp) and multidrug resistance-associated protein (MRP) confer resistance to the treatment these leukemias. OBJECTIVE: To analyze the expression of the Gpp and MRP1 in patients with AML by flow cytometry (FC) and to determine the correlation between expression and demographic and also clinical and laboratorial variables. METHODS: Bone marrow and peripheral blood samples from 346 patients with a diagnosis of AML were assessed for the expression of Pgp and MRP1 by FC. RESULTS: The expression of Pgp and MRP1 was found in 111 (32.1%) and 133 (38.4%) patients, respectively, with greater prevalence in older patients and lower in adolescents, observing also a high incidence in patients with refractory disease, recurrence and secondary in comparison with the cases of de novo AML. Regarding the laboratory findings, we observed a higher correlation statistically significant between the expression of Pgp and MRP1 in AML CD34+ and FAB AML M7, M5A and M2 and lower the M3 subtype, not observed statistically significant correlation between the phenotype MDR and other laboratory data such with hemoglobin, leukocyte count, platelet count, aberrant expression of lymphoid antigens (CD2, CD7 and CD19) and clinical signs related to the disease. CONCLUSIONS: The results showed that the detection of MDR phenotype by flow cytometry can be a molecular marker for prognosis independent patients diagnosed with AML.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2254071 bytes, checksum: 5ef1f814625ed46426cc35ec211b8399 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Root bark infusions of the plant Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) are used in folk medicine, in Northeast Brazil, for the treatment of diseases of the respiratory and digestive tracts. Previous studies showed that the hydroalcoholic extract of the leaves (AFL) of the plant and warifteine (W), alkaloid bisbenzylisoquinolinic, presented anti-inflammatory and anti-allergic effects. This study evaluated the effect of the oral treatment of mice with W and methyl warifteine (MW) in the paw edema formation induced by phlogistic agents, vascular leakage and cell migration in acute inflammatory models and the effect of oral treatment with AFL and its alkaloids (W and MW) in chronic inflammation represented by the experimental model of food allergy (BALB / c mice sensitized with ovalbumin - OVA). Oral treatment with W reduced the paw edema induced by carrageenan, histamine and prostaglandin E2, an effect not presented in MW treatment. The warifteine and methyl-warifteine also reduced the vascular leakage, however without inhibiting cell migration associated with inflammation. In the experimental model of food allergy the treatment with W induced weight gain in animals with decreased of diarrhea. Methylation of warifteine did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea during the allergen challenge. However treatment with AFL did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea. In contrast, treatment with the AFL or its alkaloids reduced the IgE specific for ovalbumin (OVA) titer, increased the proportion of CD4 + or CD8+ T lymphocytes in mesenteric lymph nodes. The proportion of regulatory T lymphocytes in the mesenteric lymph nodes was also increased by the treatments. In vitro experiments, with cells from mesenteric lymph nodes of sensitized animals, demonstrated that W and MW inhibited the secretion of interleukin (IL-) 12 and IL-10 with no change in the interferon-γ (IFN-γ) and IL- 13 levels. These results demonstrated that the oral treatment with warifteine presented anti-inflammatory activity by inhibiting the action of mediators of inflammation and the methylation of the molecule did not improve this effect. Also, the treatment with AFL, W and MW showed immunomodulatory effects in food allergy with increased of Treg cells and decreased of cytokines derived from cells of the innate immune mechanism independent of that of the adaptive immune mechanism. / Infusões das raízes da planta Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) são utilizadas, pela medicina popular, no Nordeste Brasileiro, para o tratamento de doenças do trato respiratório e digestório. Estudos prévios demonstram que o extrato hidroalcoólico das folhas (AFL) da planta e a warifteina (W), alcaloide bisbenzilisoquinolínico, apresentam efeitos anti-inflamatórios e antialérgicos. Esse estudo avaliou, portanto, o efeito do tratamento oral de camundongos com W e a metil-warifteina (MW) na formação do edema de pata induzido por agentes flogísticos, no extravasamento vascular e na migração celular em modelos de inflamação aguda e o efeito do tratamento oral com a AFL e seus alcaloides (W e MW) na inflamação crônica representada pelo modelo experimental de alergia alimentar (camundongos BALB/c sensibilizados com ovalbumina - OVA). O tratamento com a W reduziu o edema de pata induzido por carragenina, por histamina ou prostaglandina E2, efeito esse não observado com o tratamento com MW. A warifteina e a metil-warifteina também reduziram o extravasamento vascular, contudo sem inibir a migração celular associada à inflamação. No modelo experimental de alergia alimentar o tratamento com W induziu ganho de peso dos animais com diminuição da diarreia. A metilação da warifteina, embora não tenha induzido o ganho de peso diminuiu a diarreia durante os desafios com o alérgeno. Todavia o tratamento com AFL não induziu o ganho de peso e nem inibiu a diarreia alérgica. Diferentemente, os tratamentos com o AFL e com os alcaloides reduziram os títulos de IgE específica para ovalbumina (OVA), aumentaram a proporção de linfócitos T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico. A proporção de linfócitos T reguladores foi aumentada no linfonodo mesentérico pelos tratamentos em estudo. Os experimentos in vitro, com células do linfonodo mesentérico de animais sensibilizados, demonstraram que W e MW inibiram a secreção de interleucina (IL-)12 e IL-10, sem alteração nos níveis de interferon-γ (IFN-γ) e IL-13. Esses resultados demonstraram que o tratamento oral com warifteina apresentou atividade anti-inflamatória por inibir a ação de mediadores da inflamação e que a metilação da molécula não potencializou seu efeito. Também, os tratamentos com AFL, W e MW apresentaram efeitos imunomoduladores na alergia alimentar com aumento de células Treg e com diminuição de citocinas oriundas de células do mecanismo imune inato independente das do mecanismo imune adaptativo.