A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

Durante a maturação da semente, a partir da fertilização do óvulo, há alterações inerentes à formação da semente, com destaque para as variações do tamanho, do teor de água, das massas da matéria fresca e seca e da germinação das sementes. Paralelamente, para os frutos carnosos há alterações visíveis nos frutos relacionados à forma, à cor e à senescência. Não há, todavia, relatos de quais mudanças (morfológica, anatômica, fisiológica e bioquímica) ocorrem nas sementes que se desenvolvem no interior de frutos carnosos mantidos em repouso por diferentes períodos de tempo. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a fase final da formação das sementes de pimentão, considerando as variações da morfologia externa dos frutos e do parâmetro fisiológico, da morfologia interna, da enzima endo-?-mananase, da anatomia e do acúmulo de substâncias de reservas e do ciclo celular das sementes, visando verificar se essas mudanças explicam as alterações fisiológicas das sementes de pimentão após o repouso pós-colheita do fruto e durante o armazenamento das sementes. As sementes foram extraídas de frutos em diferentes estádios de maturação, (cores verde, verde-avermelhada e vermelha), mantidos em repouso por 3, 7 ou 14 dias ou sem repouso, e avaliadas logo após a colheita e durante o armazenamento. Os frutos foram avaliados quanto à coloração, dimensões e massa. As sementes foram avaliadas quanto ao teor de água, massa de matéria seca, massa de 1000 sementes, germinação e vigor, além da avaliação de imagens de raios X para o estudo da morfologia interna das sementes, da atividade da enzima endo-?-mananase pelo método da difusão em gel, análises histoquímicas para o estudo da anatomia e de substâncias de reserva e a avaliação do ciclo celular. A colheita das sementes de pimentão pode ser caracterizada pela coloração dos frutos. Em função do repouso há alteração da cor do fruto, do ciclo celular das sementes hidratadas, da atividade da enzima endo-?-mananase e de algumas substâncias de reserva, interferindo positivamente na qualidade das sementes de pimentão. Entretanto, o repouso de frutos, que estão em estágio avançado de desenvolvimento, causa redução da qualidade das sementes. O teor de água, a massa de matéria seca e a morfologia interna da semente, a anatomia das células do endosperma e a presença de substâncias de reservas das sementes não são alterados durante o repouso do fruto, mas estão relacionados ao estádio de formação das sementes. Na medida em que há a deterioração natural das sementes durante o armazenamento, há redução da germinação e do vigor, da atividade da endo-?-mananase, da quantidade de lipídios, proteínas e polissacarídeos das células do embrião e do endosperma. Durante o repouso do fruto por 14 dias, as sementes extraídas de frutos verdes têm tolerância à desidratação, caracterizada principalmente pelo aumento da germinação após a secagem das sementes. A maturidade fisiológica das sementes é caracterizada pela coloração verde-avermelhada dos frutos e também pela estabilização do teor de água das sementes (30%), pela quantidade de matéria seca e pelo conteúdo de DNA 4C; não há coincidência entre maturidade fisiológica e máxima germinação. / During seed maturation there are some significant alterations in seed size, moisture content, fresh and dry matter and germination. Furthermore, for fleshy fruits, visible alterations occur as the fruit shape, color and senescence. There are not reports about which morphological, anatomical, physiological and biochemical alterations occur in seeds that develop inside fleshy fruits during the rest of them, for different periods of time. The objective of this research was to evaluate the final stage of the bell pepper seed formation and it was considered the variations of the external morphology of the fruit, and the physiological parameter, internal morphology, activity of endo-?-mannanase, anatomy and the reserve substances accumulation, and cell cycle of the seeds to verify if these changes explain the physiological changes of the bell pepper seeds after the fruit resting and during the seed storage. The seeds were extracted from fruits at different maturation stages (colors green, reddish-green and red), with (3, 7 or 14 days) or without fruit resting, and during the seed storage. The fruits were evaluated by color, and the measurements and weight. The seeds were evaluated for moisture content, dry mass, mass of 1000 seeds, germination and vigor and X-ray imaging to study the internal morphology of the seeds, endo-?-mannanase activity by gel diffusion assay, histochemical analyzes to study seed anatomy and reserve substances, and flow cytometry to assess the cell cycle. The harvest of bell peppers seeds can be made by the color of the fruits. The fruit resting alters the fruit color, germination, vigor, endo-?-mannanase activity, some storage substances and cell cycle improving bell pepper seed quality. However it has a negative role when the fruits are in advanced stage of development (red fruits and resting time more than 7 days). The moisture content, dry matter and the internal morphology of the seeds do not change by the fruit resting, but because of the seed maturation stage. It was observed reduction of all the physiological parameters, including the amount of lipids in the cells and endo-?-mannanase activity. During fruit resting, the endo-?-mannanase activity and the 4C DNA content of the cells decrease and there is an increased rate of germination and vigor. The water content, dry matter, internal morphology and anatomy of the cells of the endosperm and the presence of reserves substances in the seeds are not changed due to the rest of the fruit, but are related to the seed formation stage. There is natural seed deterioration during storage and a reduction of germination and vigor, endo-?-mannanase activity, amount of lipids, proteins and polysaccharides in the embryo and endosperm cells. During the fruit resting (14 days), the seeds extracted from green fruits have desiccation tolerance, characterized by increased of the seed germination after drying. The physiological maturity is reached when the fruits are reddish-green, characterized by stabilizing the water content of the seeds (30 %), amount of dry matter and the 4C DNA content. There is not a coincidence between physiological maturity and maximum germination.

Um modelo de indução de estresse/ansiedade é a separação materna. Sabe-se, a este respeito, que o desenvolvimento do comportamento emocional normal em mamíferos jovens depende da interação entre a mãe e o filhote. Além disso, eventos estressantes na infância e interrupções no cuidado materno podem levar a efeitos deletérios na resposta imune e na resistência a doenças ao longo da vida. Buscamos neste trabalho estudar os efeitos da separação materna sobre o comportamento, imunidade inata e crescimento tumoral de uma prole de camundongos machos adultos. Nossos resultados mostraram que a separação materna, em camundongos A/J, (1) não produziu alterações robustas no comportamento e em parâmetros hematológicos (antes e após o crescimento tumoral), (2) aumentou a atividade de neutrófilos sanguíneos e macrófagos alveolares (antes e após o crescimento tumoral), (3) aumentou os níveis estriatais de serotonina, seu metabólito 5-HIAA e o turnover de dopamina, (4) diminuiu os níveis séricos de corticosterona e (5) não influenciou a incidência tumoral. Em camundongos C57BL/6, a separação materna produziu um comportamento ansioso e um aumento na atividade de neutrófilos sanguíneos. Tomados em seu conjunto, parece-nos possível afirmar que a separação materna tenha produzido alterações na atividade neuroimune dos animais, modificando, nos mesmos a atividade do eixo HPA e essas alterações foram influenciadas pelas características individuais das linhagens. / Maternal separation is one model of stress/anxiety induction. We know about it that the mammals normal emotional behavior development depends on the interaction between mother and younglet. Beside this, early life stressed events can induce deletery effects in immune response and to illness resistance for all life long. In this work we searched for the maternal separation effects on the behavior, innate immunity and tumor growth in an adult male mice offspring. Our results showed that the maternal separation, in A/J mice (1) had no big effects in the behavior and in the hematological parameters (before and after the tumor growth), (2) increased the neutrophil and alveolar macrophages activity (before and after the tumor growth), (3) increased the serotonin striatum levels, the 5-HIAA metabolite and the dopamine turnover (4) decreased the corticosterone serum levels and (5) had no effects on tumor incidence. In the C57BL/6 mice, the maternal separation induced an anxiety behavior and increased the neutrophil activity. These results suggest that the maternal separation could have produced alterations in neuroimmune activity, modifying the HPA axis activity and these alterations could be influenced by individual strains characteristics.

Evidências experimentais sugerem que uma variedade de estressores ativa o controle hipotalâmico das respostas neuroendócrinas e autonômicas que estão envolvidas na produção de células do sangue e na liberação destas células da medula óssea para a circulação. A alga Chlorela vulgaris (CV) exibe várias atividades imunomoduladoras como, por exemplo, a capacidade de estimulação das células hematopoéticas e de ativação de leucócitos maduros. No presente trabalho analisamos o efeito imunoprotetor da CV em animais submetidos aos estressores físicos (estresse por choque escapável - CE e inescapável - CI) e ao estressor psicogênico (grupo de animais que testemunhou a exposição ao choque inescapável - T) e inoculados com a bactéria Listeria monocytogenes (LM). Os parâmetros imunológicos observados foram: 1) Crescimento e diferenciação de progenitores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) da medula óssea; 2) Atividade funcional (burst e fagocitose) de neutrófilos circulantes avaliados por citometria de fluxo; 3) Sobrevida de animais inoculados com dose letal de LM e/ou submetidos aos estressores físicos e psicogênico. Nos grupos CI e T observamos uma redução no número de CFU-GM na medula óssea. Por outro lado, não houve redução deste parâmetro nos animais do grupo CE quando comparado ao medido no grupo controle. Observamos uma maior susceptibilidade do organismo a infecção por LM quando o estresse foi aplicado previamente à inoculação com dose subletal desta bactéria. No entanto, o tratamento com 200 mg/Kg/dia de CV por 5 dias consecutivos mostrou uma ação protetora, restabelecendo a mielossupressão induzida pelo choque inescapável ou pelo estressor psicogênico e/ou pela infecção. A aplicação de choques escapáveis não alterou significativamente o perfil da resposta hematopoética produzida pela infecção. O estudo da eficácia terapêutica de alga, avaliada pelo tratamento de animais infectados com dose letal de LM, demonstrou uma sobrevida de 50% no grupo infectado e de 20% nos grupos infectados e submetidos aos diferentes tipos de estresse, inclusive naquele exposto ao estresse escapável. Ao considerarmos os efeitos dos estressores sobre a atividade funcional de neutrófilos sanguíneos, observamos uma redução na capacidade de fagocitose nos grupos CI e T, e um aumento do burst induzido pela fagocitose. No grupo CE houve um aumento na capacidade de fagocitose destas células, enquanto que o burst não foi alterado. O estudo dos efeitos da CV sobre a atividade funcional de neutrófilos demonstrou uma capacidade da alga de impedir a redução da fagocitose produzida pelo estresse físico por choque inescapável e psicogênico, sem interferir com o burst oxidativo, que estava aumentado nestes grupos. Impediu também o aumento da capacidade de fagocitose verificado no grupo CE. Esses resultados sugerem que a CV possua propriedades protetoras contra os efeitos induzidos pelo diferentes tipos de estressores sobre a série granulocítica/macrofágica, a atividade funcional de neutrófilos e sobre a sobrevida de animais estressados e infectados com dose letal de LM. / Evidence suggests that a variety of stressors can activate the hypothalamic control of the neuroendocrine and autonomic responses involved in the production´s control of blood cells and their release from bone marrow to circulation. The algae Chlorella vulgaris (CV) has several imunomodulatory activities, as the stimulation of hematopoietic cells and the activation of mature leukocytes. The present study evaluated the mieloprotective effects of CV in rats exposed to physical stressors (inescapable - CI and escapable footshock - CE) and to psychogenic stressors (animals that witnessed the inescapable shock application - T), which were inoculated or not with a sublethal dose of the bacterium Lysteria monocytogenes (LM). The immunologic parameters observed were: 1) The growth and differentiation of bone marrow progenitors into granulocytes and macrophages (CFU-GM); 2) the functional activity (oxidative burst and phagocytosis) of blood neutrophils, using flow citometric methods; 3) The rate of survival of animals infected with lethal dose of LM and submitted or not to the stressors. The CI and T groups were mielossupressed. On the other hand, in the CE group, no differences in the number of CFU-GM were observed, when compared to controls. An increase in the susceptibility of the organism was observed when the animals received the inescapable shock application and the psychogenic stressor before the inoculatium of sublethal dose (7,8x108) of the 15 bacterium. However, this mielopoietic response was recovered with the pre-treatment with 200 mg/Kg/day for 5 consecutive days of CV, reestablishing the mielossupression caused by the stress and the infection. The escapable shock didn´t produce any significant difference in the hematopoetic response observed in the infection. The study of the survival rate of rats infected with the letal dose of LM showed that the pre-treatment with CV protected 50% of the animals that were only infected with LM, whereas in the group previously stressed the protection was of 20%. Here, the same response was observed in the animals submitted to the different types of stressors evaluated in this work. To assess the effect of CV treatment in the response of mature blood cells, we considered the functional activity of neutrophils of animals submitted to the stressors. We observed a reduction in phagocytosis in the CI and T groups, and an increase in the oxidative burst induced by the phagocytosis. In the CE group there was an increase in the blood neutrophil phagocytosis, while the production of oxidative burst remained equal to that of control group. The treatment with CV reestablished the changes in phagocytosis to normal values in all the groups, but it produced no changes in the respiratory burst, which was increased in the circunstances of the inescapable shock and of the psychogenic stressor, when compared to the values of control group. Considering our results, we suggest that CV has protective properties against the effects produced by the different types of stressors on the CFU-GM, the functional activity of neutrophils and on the rate of survival of animals stressed and infected with lethal dose of LM.

Orientador: Edgard Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_LucianaYamamotode_M.pdf: 2240916 bytes, checksum: ea05e547ca468707eb304c81344a3fbf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A enzima ácido graxo sintase (FASN), responsável pela síntese endógena de ácidos graxos, está presente em grande quantidade em diversas neoplasias malignas e lesões pré-malignas. Sua inibição farmacológica parece estar relacionada com a morte celular seletiva de células tumorais. Orlistat (Xenical®), uma droga anti-obesidade, que possui também propriedades anti-neoplásicas por inibir irreversivelmente FASN, sendo estes efeitos claramente demonstrados em cânceres de mama, próstata, estômago e melanoma. Embora as propriedades antitumorais do Orlistat ocorram devido a um efeito direto sobre as células malignas, até o momento, possíveis mecanismos indiretos sobre o sistema imunológico não foram estudados. Células imunes, como linfócitos T CD8+ (LTCD8+), células natural killer (NK) e células dendríticas (CD), estão envolvidas no processo de defesa antitumoral, por promover a morte de células neoplásicas. Como não há informações na literatura sobre uma possível relação entre FASN e o sistema imunológico, nosso trabalho teve como objetivo principal estudar o efeito da inibição da enzima FASN com Orlistat sobre o fenótipo e porcentagem de LTCD8+, células NK e CDs presentes nos tumores primários e suas respectivas metástases para linfonodos mediastínicos, em modelo de melanoma murino (B16-F10 / C57/Bl6). Adicionalmente, avaliou-se o estado de ativação das CDs CD11c+ presentes nos linfonodos mediastínicos metastáticos, através da expressão de MHC I (complexo maior de histocompatibilidade de classe I) e das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 na superfície destas células. Através de citometria de fluxo, foram analisadas as porcentagem de LTs CD3+CD8+, células NK CD3-CD49b+ e CDs CD11c+ nos tumores e metástases. A ativação dos LTCD8+ e células NK foi avaliada pela expressão de granzima b e perforina em RNA total obtido dos linfonodos mediastínicos metastáticos, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). Além disso, as células NK presentes nas metástases linfonodais também foram avaliadas quanto à expressão do receptor inibitório Ly49A, através de citometria de fluxo. Após o tratamento com Orlistat, houve redução de cerca de 30 % na quantidade de metástases, em comparação com os grupos controle. Os tumores primários do grupo controle apresentaram um baixo percentual de LTs CD3+CD8+ (0,36%) e de células NK CD3-CD49b+ (0,27%). No grupo tratado, não foi possível detectar a presença destas células na massa tumoral, sugerindo uma supressão desta população pelo Orlistat. Além disso, CDs CD11c+ não puderam ser avaliadas nestes tumores. Nos linfonodos mediastínicos metastáticos, houve um discreto aumento de CDs CD11c+, acompanhado de menor expressão das proteínas de superfície MHC I, CD80 e CD86, além de uma redução percentual das células T CD3+CD8+ e NK CD3-CD49b+. A expressão de RNAs mensageiros para granzima b e perforina também foi menor no grupo de camundongos tratados. Finalmente, em relação a Ly49A, sua expressão foi maior nas NKs dos linfonodos metastáticos de animais tratados. Em conjunto, nossos resultados indicam que a inibição de FASN com Orlistat interfere no fenótipo, porcentagem e estado de ativação das células imunológicas intratumorais e dos linfonodos metastáticos, sugerindo possível atividade imunossupressora / Abstract: Fatty acid synthase (FASN), the enzyme responsible for the endogenous synthesis of fatty acids, is highly expressed in several malignant neoplasms and premalignant lesions. Its pharmacological inhibition promotes apoptosis in tumor cells. Orlistat (Xenical ®), an anti-obesity drug, has anti-neoplastic properties by irreversibly inhibiting FASN, which were demonstrated in malignant neoplasms from breast, prostate and stomach and melanoma. Although the known antitumor properties of Orlistat are consequence of a direct effect on malignant cells, indirect mechanisms on the immune system were not described. Immune cells, such as CD8+ T lymphocytes (CD8+ TL), natural killer (NK) and dendritic cells (DC) are involved in the defense against cancer cells. Since there is no information in literature about a relationship between FASN activity and the immune system, our work aimed to study the effect of Orlistat on the phenotype and percentage of CD8+TL, NK and DC present in the primary tumors and their metastases to mediastinal lymph nodes in a experimental model of spontaneous melanoma metastasis (B16-F10 / C57/Bl6). Additionally, we evaluated the activation of CD11c+ DCs present in the metastatic mediastinal lymph nodes, through the expression of MHC I (major histocompatibility complex class I) and costimulatory molecules CD80 and CD86 on cell surface. By using flow cytometry, we analysed the effects of Orlistat on the percentage of CD3+CD8+ TLs, CD3-CD49b+ NK cells, and CD11c+ DCs in primary tumors and lymph node metastases. Activation of CD8+ TLs and NK cells was evaluated through the expression of granzyme b and perforin in the metastatic mediastinal lymph nodes by quantitative RT-PCR. In addition, NK cells present in lymph node metastases were also evaluated regarding the expression of Ly49A by flow cytometry. Orlistat was able to reduce in aproximately 30% the number of metastatic lymph nodes. Control primary tumors had a low percentage of CD3+CD8+ TLs (0.36%) and CD3-CD49b+ (0.27%), which were not detected in the treated tumors, suggesting a supression of this population. In addition, CD11c+ DCs could not be assessed in both treated and control tumors. Regarding metastatic lymph nodes, there was a slight increase of CD11c+ DCs, associated with a lower expression of the surface proteins MHC I, CD80 and CD86. CD3+CD8+ TLs and CD3-CD49b+ NK cells were reduced in the metastases from the treated animals. Moreover, the expression of granzyme b and perforin was lower in the metastases of treated mice. Finally, the expression of of Ly49A on NK cells was higher in metastatic lymph nodes of treated animals. Taken together, our results indicate that inhibition of FASN with Orlistat changes the phenotype, percentage and activation state of intratumoral and lymph node immune cells, suggesting a immunosuppressive activity / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima, produzida pelas células trofoblásticas e, por sua capacidade de catabolizar o triptofano, inibe a proliferação das células T maternas, participando desta forma como importante mecanismo da tolerância materno-fetal. Contudo, pouco se sabe se a ação da IDO é influenciada por outras substâncias presentes no micro-ambiente uterino e, por esta razão, formulou-se a hipótese de que esta enzima poderia ter sua ação alterada nesse contexto e, desta forma, avaliou-se o comportamento da expressão da IDO frente à adição de alguns desses componentes presentes no útero gestante. Neste trabalho, células uterinas, de placentas e de embriões de ratas e camundongos fêmeas prenhes e não prenhes foram mantidas em cultivo e a elas adicionadas estradiol, progesterona, interferon , triptofano e 1-metil-D- triptofano, avaliando-se a expressão da IDO pela técnica de citometria de fluxo nos períodos de 4, 24 e 48 horas. Os resultados demonstraram que as diferenças mais significativas na expressão da IDO entre as ratas prenhes e não prenhes, foram observadas após a adição de progesterona (19,24%), interferon (11.22%) e triptofano (23,53%), nas ratas prenhes. Já nos camundongos fêmeas prenhes e não prenhes, as maiores expressões de IDO foram observadas no primeiro grupo pela adição de progesterona (11,33%), estradiol (9,98%) e interferon (21,78%). Considerando esses resultados, podemos concluir que a expressão da IDO pelas células uterinas, placentárias e embrionárias em cultivo sofre influência dos fatores testados, o que permite novas hipóteses para melhor compreensão da participação dessa enzima na tolerância materno-fetal, particularmente em relação a sua interação com hormônios e citocinas presentes no útero gestante. Além disso, poderá colaborar na elaboração de possíveis tratamentos de enfermidades, relacionadas à manutenção e sucesso da gestação onde haja envolvimento do sistema imunológico materno e dos mecanismos de tolerância. / Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is an enzyme produced by trophoblast cells and due to its ability to catabolize tryptophan, inhibits the proliferation of maternal T cells, thus playing an important role as one of the mechanisms of maternal-fetal tolerance. However, little is known whether the action of IDO is influenced by substances present in the pregnant uterine microenvironment. This study evaluated the behavior of the IDO expression in cultured placental and embryonic cells from mice and rats in face of the addition of estradiol, progesterone, interferon, tryptophan and 1-methyl-D-tryptophan, by flow cytometry, at 4, 24 and 48 hours periods. The results showed that high expressions of IDO were observed in pregnant rats cells after the addition of progesterone (19.24%), interferon (11.22%) and tryptophan (23.53%). In mice, high expressions of IDO were observed in the pregnant group cells by the addition of progesterone (11.33%), estradiol (9.98%) and interferon- (21.78%). Considering these results, we may conclude that the expression of IDO by cultured placental and embryonic cells from mice and Wistar rats is indeed influenced by factors present in pregnant uterus, which provides additional information to better understand IDO role in the maternal-fetal tolerance, particularly on its interactions with reproductive hormones and cytokines. Additionally, it may contribute to the establishment of possible treatments for pregnancy-losses related to the maternal immune system response and mechanisms of tolerance.

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No. of bitstreams: 1 natanachavesrabelo.pdf: 1986585 bytes, checksum: 916ff1701b2aae3c4a92119e278425b5 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Erros na reprogramação epigenética no embrião reconstruído pela técnica de Transferência Nuclear de Célula Somática (TNCS) reduzem sua taxa de sucesso. A sincronização do ciclo do oócito receptor com o da célula doadora foi descrito como um dos principais fatores que contribuem para uma reprogramação adequada. Extratos da planta Azadirachta indica A. Juss (Nim) demonstraram potencial para inibir o ciclo de células cancerígenas e o crescimento de tumores, o que levou a hipótese de que ele pode ser efetivo, também, em células somáticas doadoras de núcleo para a clonagem. O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos de extratos de Nim sobre o ciclo de fibroblastos bovinos, bem como verificar se tais tratamentos diminuem a viabilidade das células ou alteram a expressão de genes de estresse e apoptose. Foram testadas quatro concentrações (50, 100, 200 e 300 oso, etanólico e hexânico, por 12 ou 24 horas de exposição, utilizando um controle positivo (soroprivação) e um controle com do ciclo e a reversibilidade foram analisadas por Citometria de Fluxo, a expressão dos genes HSP70.1A, HSBP1, HSP27.P1, BAX, BCL-2 e WNT5A avaliada por PCR em tempo real e a viabilidade celular por Azul de Tripan. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Student Newman Keuls, com valores de P<0,05 considerados significativos. Os tratamentos de 100 e os únicos capazes de sincronizar o ciclo das células em G0/G1 de forma reversível (88,59 ± 0,26% e 88,36 ± 0,32%, respectivamente), quando comparadas ao controle com mL (81,89 ± 0,43%), apresentando redução de células em G0/G1 dentro das 12 horas seguintes à exposição ao extrato. Apenas para estes tratamentos, portanto, foi realizada a análise de viabilidade celular e expressão gênica. Para o grupo de fibroblastos tratados com houve redução da viabilidade (50,16 ± 2,76%) em relação aos demais, que foram semelhantes (P>0,05) entre si. Para os dois tratamentos correu sub-expressão da maior parte dos genes, com exceção de HSP27 HSP70 mL, quando estes foram comparados ao controle com . Com isso, conclui-se que, dentre os tratamentos testados, o melhor seria o extrato etanólico, a . Portanto, este tratamento tem potencial para ser testado na produção de embriões pela técnica de TNCS e contribuir para melhorar sua eficiência. / Errors in epigenetic reprogramming in reconstructed embryos by technique Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) reduce your success rate. The synchronization of the receiver oocyte cycle with the donor cell was described as one of the main factors that contribute to an appropriate reprogramming. Extracts of Azadirachta indica A. Juss (Neem) have demonstrated potential to inhibit the cell cycle of cancerigens cells and growth of tumors, which led to the hypothesis that it may be effective also in nucleus donor somatic cell for cloning. This study aimed to evaluate the effects of Neem extracts on cell cycle of bovine fibroblasts and verify if these treatments reduce the viability of cells and change the expression of stress and apoptosis genes. Were tested four concentrations (50, 100, 200 and 300 μg/mL) of the aqueous, ethanolic, and hexane extract, by exposure to 12 or 24 hours, using a positive control (inhibition serum starvation) and a control with 0 μg/ml . The inhibition and reversibility of cycle were analyzed by Flow Cytometry, the expression of genes HSP70.1A, HSBP1, HSP27.P1, BAX, BCL-2 and WNT5A evaluated by real-time PCR, and cell viability by Trypan Blue. The results were subjected to analysis of variance and means were compared by the Student Newman Keuls test, with values P<0.05 considered significant. The treatments of 100 and 200 μg/ml of the ethanol extract, for 24 hours of exposure, were able to synchronize the cell cycle in the G0/G1 (88,59 ± 0,26% and 88,36 ± 0,32%, respectively), compared to the control with 0 μg/ml (81.89 ± 0,43%), being the only ones that were reversible, returning to cycle within 12 hours after the removal of extract. Just these treatments, therefore, cell viability and gene expression analysis was performed. For the group of fibroblasts treated with 200 μg/mL was reduced the viability (50,16 ± 2,76%) compared to the others, which were similar (P>0.05) between them. For both treatments ran under expression of most genes, with the exception of HSP27 to 100 μg/mL and HSP70 to 200 μg/mL, when they have been compared to the control with 0 μg/mL. In conclusion, among the treatments tested, the best was the ethanol extract, 100 μg/mL, for 24 hours of exposure. Therefore, this treatment have potential to be tested in the production of embryos by SCNT technique and helping to improve their efficiency.

Muitas evidências indicam que a tumorigênese em humanos é um processo com várias etapas. A progressão de um tumor em direção a malignidade ocorre de maneiras muito distintas entre os diferentes tipos de câncer. Entender os processos celulares que levam a tumorigênese é importante para se delinear tratamentos mais adequados contra os diversos tipos de câncer. Drogas antimitóticas (ou venenos de fuso) são utilizadas no tratamento de alguns cânceres, e entre eles está o câncer de mama. A ação dessas drogas reside sobre a mitose, e têm como alvo os fusos mitóticos, estruturas essenciais que dirigem o ciclo celular na divisão das células. Recentemente, pesquisadores têm delineado possíveis respostas da célula aos venenos de fuso, e essas respostas são dependentes da concentração da droga. Baixas concentrações de venenos de fuso provocam o aparecimento de populações celulares aneuplóides, que ocorrem quando a célula sai do bloqueio mitótico. O presente trabalho utilizou as drogas vincristina e paclitaxel sobre linhagens celulares de mama humana (células normais e tumorais) para pesquisar se as drogas são capazes de induzir células aneuplóides. Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que baixa concentração de vincristina e paclitaxel pode induzir o aparecimento de população aneuplóide através de mitoses aberrantes. Os venenos de fuso induzem a formação de mitoses contendo múltiplos fusos mitóticos, e essas mitoses não ficam bloqueadas, dando origem a células aneuplóides. O papel da aneuploidia na tumorigênese não foi ainda estabelecido, mas indiferente da sua importância no desenvolvimento do tumor, encontrar maneiras de inibir sua formação ou de super induzir seu aparecimento podem ter implicações significativas para as terapias contra o câncer. / Several lines of evidence indicate that tumorigenesis in humans is a multistep process and that these steps reflect genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into highly malignant derivatives. Understanding the cellular processes that lead to tumorigenesis is important to devise more appropriate treatments against various types of cancer. Antimitotic drugs are used in the treatment of some cancers, and among them is breast cancer. The action of these drugs lies on the mitotic spindles, essential structures that drive the cell cycle in the division of cells. Recently, researchers have outlined possible responses to the antimitotic drugs on cells, and these responses are dependent on the concentration of the drug. Low concentrations of drugs can cause the appearance of aneuploid population, which occur when a cell leaves the mitotic block. This study used the drug vincristine and paclitaxel on human breast cancer cell lines (normal and tumoral cells) to find if the drugs are capable of inducing cell aneuploidy. The results of this study indicate that low concentration of vincristine and paclitaxel can induce the emergence of aneuploidy population through aberrant mitosis. The drugs induce the formation of mitosis containing multiple mitotic spindles, resulting in aneuploidy population of cells. The role of aneuploidy in tumorigenesis has not yet been established, but indifferent to this is important find ways to inhibit its formation or the super-induce their appearance. These questions may have significant implications for therapies against cancer.

Este trabalho objetivou avaliar os efeitos imunomoduladores das células-tronco imaturas da polpa dentária (CTIPD) sobre a diferenciação, maturação das células dendríticas derivadas de monócitos (mo-DC), sua capacidade para ativar linfócitos T (Lin T), bem como verificar fatores solúveis liberados nos cocultivos celulares. As analises foram feitas por citometria de fluxo. Foi observado que mo-DC tiveram a diminuição de moléculas relacionadas à diferenciação para mo-DC e o aumento de moléculas relacionados ao estado precursor, o que parece ter refletido na maturação para mDC, verificado pela diminuição das moléculas de maturação. As mo-DC tiverem sua função em induzir a proliferação de Lin T reduzida, além, de favorecer o aumento da proporção de Lin T CD4+FoxP3+IL-10+ e Lin T CD4+FoxP3+IFN-<font face=\"Symbol\">g+. A mensuração dos fatores solúveis dos cocultivos mostrou que houve aumento de fatores anti-inflamatórios e redução de fatores pró-inflamatórios. Futura investigações podem suportar o uso das CTIPD em uma abordagem imunomoduladora utilizando DC em aplicações clínicas. / This study aimed to evaluate the immunomodulatory effects of immature stem cells from dental pulp on differentiation, maturation of monocyte-derived dendritic cells (mo-DC), their ability to activate T cells, as well as identify soluble factors released in cellular cocultures. The analyzes were performed by flow cytometry. It was observed a decrease of molecules related to mo-DC differentiation and an increase of molecules related to precursor state, which seems to have reflected to mDC maturation verified by reduction of maturation molecules. The mo-DC have their role in inducing T cells proliferation reduced, in addition, favored increase CD4+FoxP3+IL-10+ and CD4+FoxP3+IFN-<font face=\"Symbol\">g+ T cells population proportion. The measurement of soluble factors from coculture showed an increase of anti-inflammatory factors and a reduction of pro-inflammatory factors. Future research may support the use immature stem cells from dental pulp in an immunomodulatory approach using DC in clinical applications.

Em aplicações biotecnológicas, a estabilização de informações e a expressão gênica em bactérias Gram-negativas são fundamentais. Neste trabalho, analisou-se o efeito de estabilização plasmidial promovido pelo lócus parB (hok/sok) nas bactérias E. coli, C. metallidurans e C. necator transformadas com os plasmídeos pCM2, pBBR1MCS e seus respectivos derivados contendo o lócus parB, pCM3 e pBBPAR. As bactérias transformadas com pCM2 exibiram perda plamidial acentuada após 50 gerações, e as bactérias transformadas com pCM3 e pBBPAR exibiram estabilidade próxima a 100%, após 100 gerações. Também foi avaliada a força relativa de expressão dos promotores hok e sok em relação ao promotor lac, inseridos no plasmídeo pBBEGFP. Por microscopia de fluorescência, foi observado que regulado pelos promotores sok e hok, os transformantes expressaram EGFP. Utilizando citometria de fluxo, foi observado que o promotor hok apresentou maior força de expressão nas bactérias transformantes de E. coli e C. metalliduras; já o promotor sok apresentou maior força de expressão em C. necator. / In biotechnological applications, stabilization of information and gene expression in Gram-negative bacteria are important. In this work, we analyzed the effect of plasmid stabilization promoted by locus parB (hok/sok) in the bacteria E. coli, C. metallidurans and C. necator transformed with the plasmids pCM2, pBBR1MCS, and their derivatives containing the parB locus, pCM3 and pBBPAR. The Bacteria transformed with pCM2 showed a pronounced plasmidial loss after 50 generations, and bacteria transformed with pCM3 and pBBPAR exhibited stability close to 100 % after 100 generations. We also evaluated the relative expression strength of hok and sok promoters relative to the lac promoter, inserted into plasmid pBBEGFP. For fluorescence microscopy, it was observed that regulated by hok and sok promoter, transformants expressed EGFP. Using flow cytometry, it was observed that the hok promoter showed higher expression levels in E. coli and C. metallidurans transformants; as sok promoter showed higher expression level in C. necator.