Durante a maturação da semente, a partir da fertilização do óvulo, há alterações inerentes à formação da semente, com destaque para as variações do tamanho, do teor de água, das massas da matéria fresca e seca e da germinação das sementes. Paralelamente, para os frutos carnosos há alterações visíveis nos frutos relacionados à forma, à cor e à senescência. Não há, todavia, relatos de quais mudanças (morfológica, anatômica, fisiológica e bioquímica) ocorrem nas sementes que se desenvolvem no interior de frutos carnosos mantidos em repouso por diferentes períodos de tempo. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a fase final da formação das sementes de pimentão, considerando as variações da morfologia externa dos frutos e do parâmetro fisiológico, da morfologia interna, da enzima endo-?-mananase, da anatomia e do acúmulo de substâncias de reservas e do ciclo celular das sementes, visando verificar se essas mudanças explicam as alterações fisiológicas das sementes de pimentão após o repouso pós-colheita do fruto e durante o armazenamento das sementes. As sementes foram extraídas de frutos em diferentes estádios de maturação, (cores verde, verde-avermelhada e vermelha), mantidos em repouso por 3, 7 ou 14 dias ou sem repouso, e avaliadas logo após a colheita e durante o armazenamento. Os frutos foram avaliados quanto à coloração, dimensões e massa. As sementes foram avaliadas quanto ao teor de água, massa de matéria seca, massa de 1000 sementes, germinação e vigor, além da avaliação de imagens de raios X para o estudo da morfologia interna das sementes, da atividade da enzima endo-?-mananase pelo método da difusão em gel, análises histoquímicas para o estudo da anatomia e de substâncias de reserva e a avaliação do ciclo celular. A colheita das sementes de pimentão pode ser caracterizada pela coloração dos frutos. Em função do repouso há alteração da cor do fruto, do ciclo celular das sementes hidratadas, da atividade da enzima endo-?-mananase e de algumas substâncias de reserva, interferindo positivamente na qualidade das sementes de pimentão. Entretanto, o repouso de frutos, que estão em estágio avançado de desenvolvimento, causa redução da qualidade das sementes. O teor de água, a massa de matéria seca e a morfologia interna da semente, a anatomia das células do endosperma e a presença de substâncias de reservas das sementes não são alterados durante o repouso do fruto, mas estão relacionados ao estádio de formação das sementes. Na medida em que há a deterioração natural das sementes durante o armazenamento, há redução da germinação e do vigor, da atividade da endo-?-mananase, da quantidade de lipídios, proteínas e polissacarídeos das células do embrião e do endosperma. Durante o repouso do fruto por 14 dias, as sementes extraídas de frutos verdes têm tolerância à desidratação, caracterizada principalmente pelo aumento da germinação após a secagem das sementes. A maturidade fisiológica das sementes é caracterizada pela coloração verde-avermelhada dos frutos e também pela estabilização do teor de água das sementes (30%), pela quantidade de matéria seca e pelo conteúdo de DNA 4C; não há coincidência entre maturidade fisiológica e máxima germinação. / During seed maturation there are some significant alterations in seed size, moisture content, fresh and dry matter and germination. Furthermore, for fleshy fruits, visible alterations occur as the fruit shape, color and senescence. There are not reports about which morphological, anatomical, physiological and biochemical alterations occur in seeds that develop inside fleshy fruits during the rest of them, for different periods of time. The objective of this research was to evaluate the final stage of the bell pepper seed formation and it was considered the variations of the external morphology of the fruit, and the physiological parameter, internal morphology, activity of endo-?-mannanase, anatomy and the reserve substances accumulation, and cell cycle of the seeds to verify if these changes explain the physiological changes of the bell pepper seeds after the fruit resting and during the seed storage. The seeds were extracted from fruits at different maturation stages (colors green, reddish-green and red), with (3, 7 or 14 days) or without fruit resting, and during the seed storage. The fruits were evaluated by color, and the measurements and weight. The seeds were evaluated for moisture content, dry mass, mass of 1000 seeds, germination and vigor and X-ray imaging to study the internal morphology of the seeds, endo-?-mannanase activity by gel diffusion assay, histochemical analyzes to study seed anatomy and reserve substances, and flow cytometry to assess the cell cycle. The harvest of bell peppers seeds can be made by the color of the fruits. The fruit resting alters the fruit color, germination, vigor, endo-?-mannanase activity, some storage substances and cell cycle improving bell pepper seed quality. However it has a negative role when the fruits are in advanced stage of development (red fruits and resting time more than 7 days). The moisture content, dry matter and the internal morphology of the seeds do not change by the fruit resting, but because of the seed maturation stage. It was observed reduction of all the physiological parameters, including the amount of lipids in the cells and endo-?-mannanase activity. During fruit resting, the endo-?-mannanase activity and the 4C DNA content of the cells decrease and there is an increased rate of germination and vigor. The water content, dry matter, internal morphology and anatomy of the cells of the endosperm and the presence of reserves substances in the seeds are not changed due to the rest of the fruit, but are related to the seed formation stage. There is natural seed deterioration during storage and a reduction of germination and vigor, endo-?-mannanase activity, amount of lipids, proteins and polysaccharides in the embryo and endosperm cells. During the fruit resting (14 days), the seeds extracted from green fruits have desiccation tolerance, characterized by increased of the seed germination after drying. The physiological maturity is reached when the fruits are reddish-green, characterized by stabilizing the water content of the seeds (30 %), amount of dry matter and the 4C DNA content. There is not a coincidence between physiological maturity and maximum germination.

INTRODUÇÃO: A infecção por HIV-1 é um grave problema de saúde pública causando elevada taxa de morbidade e mortalidade. Entretanto, alguns indivíduos são considerados resistentes à infecção por HIV-1, mesmo após repetidas exposições ao vírus. Vários fatores imunológicos e genéticos podem estar associados a resistência à infecção, como ativação de componentes da imunidade inata e também devido ao baixo perfil de ativação das células T. É possível que nos indivíduos expostos e não infectados por HIV-1 (ENI) ocorra uma importante atuação das células T secretoras de IL-17 e IL-22, e também as células T reguladoras, pois são necessárias para a manutenção e homeostase das mucosas associadas ao intestino (GALT). OBJETIVO: Avaliar o fenótipo e a função de células TCD4+ e TCD8+ em casais sorodiscordante ao HIV-1, compostos por indivíduos ENI e os parceiros infectados por HIV-1. MÉTODOS: Os casais sorodiscordantes ao HIV-1, consistiam de 23 indivíduos expostos não-infectados (ENI), 14 mulheres e 9 homens, com mediana de 41 anos e 21 parceiros infectados por HIV-1 (HIV), 20 homens e 1 mulher com mediana de 41 anos. Os controles saudáveis foram 24 indivíduos (14 mulheres e 10 homens) com mediana de 37 anos. Os casais sorodiscordantes foram compostos por 16 heterossexuais e 7 homossexuais, com tempo de relacionamento de 13 anos. As frequências de células Th17, Th22 e Tc22, as células T polifuncionais foram analisadas em células mononucleares (CMNs) do sangue periférico, estimulados com peptídeos da região Gag do HIV-1 e da enterotoxina B do Staphylococcus aureus (SEB), a frequência de células T reguladoras, o perfil fenotípico de exaustão/diferenciação e a expressão da integrina alfa4?7 e CCR9 em células T, foram realizados por citometria de fluxo. RESULTADOS: No grupo HIV, as células T CD4+ e CD8+ do sangue periférico mostrou maior frequência de CD95 e PD-1 e baixa expressão de CD127 comparado ao grupo ENI e controle. A frequência de células Th17 em CMNs aumentou nos grupos ENI e HIV-1 na condição sem estímulo, contudo, após estímulo com os peptídeos da região p24 da Gag do HIV-1 induziu resposta somente no grupo HIV-1. O grupo ENI mostrou resposta antígeno-especifica somente para IL-22. Além disto, avaliando as células Tc22 e Th22, foi verificado aumento da resposta aos peptídeos da Gag e também ao SEB, nos grupos HIV e ENI. A presença de células T polifuncionais antígeno-especificas, secretoras de 5-4 citocinas, foi detectada apenas em células T CD38+ no grupo HIV, enquanto os indivíduos ENI mostraram resposta polifuncional por células T CD38- somente ao estímulo policlonal por SEB. Uma diminuição do número absoluto de células T reguladoras (CD4+CD25+CD127low/-Foxp3+) foi detectada no grupo HIV comparado ao ENI e controle, com maior expressão de moléculas HLA-DR e CD95. Além disto, foi detectado diminuição na frequência de células TCD8+ ?4?7+ no grupo ENI e de células TCD4+ alfa4beta7+ nos grupos ENI e HIV. Houve uma correlação positiva entre as células Tc22 e Th22 com as células TCD8+ e TCD4+ que expressam alfa4beta7, no grupo ENI e HIV-1. CONCLUSÃO: Os indivíduos ENI são capazes de desenvolver resposta antígeno-específicas relacionadas com a IL-22, que possui importante função na imunidade de mucosas. Além disto, mostram presença de células T polifuncionais com baixo perfil de ativação a estímulo policlonal. Os dados evidenciam que os indivíduos ENI, mostram indução de células Tc22, aumento de expressão de moléculas de migração para o intestino e equilíbrio entre as células efetoras e Treg, que em conjunto, devem exercer importante papel para a resistência à infecção por HIV-1 / INTRODUCTION: The HIV-1 infection is a major public health problem causing high morbidity and mortality. However, some individuals are considered resistant to HIV-1 infection even after repeated HIV-1 exposures. Several immunologic and genetic factors could be associated with the resistance to infection, such as activation of innate immunity components and due to the low profile of T-cell activation. It is possible that in HIV-1 exposed uninfected individuals (EU) occurs an important activity of the T cells secreting IL-17 and IL-22, including regulatory T cells, which are necessary to maintenance of homeostasis of gut-associated lymphoid tissue (GALT). AIM: To evaluate the phenotype and function of CD4+ and CD8+ T cells in HIV-1-serodiscordant couples, composed by the EU individuals and the infected HIV-1 partners. METHODS: The HIV-1-serodiscordant couples consisted of 23 EU individuals, 14 women and 9 men, with a median age of 41 years and 21 partners infected by HIV-1, 20 men and 1 woman, with a median of 41 years. Healthy controls consisted of 24 individuals (14 women and 10 men) with a median age of 37 years. The serodiscordant couples were composed by 16 homosexuals and 7 heterosexuals, reporting a median relationship duration of 13 years with a single partner. The frequency of Th17, Th22 and Tc22 cells, the polyfunctional T cells were assessed in mononuclear cells (MNCs) from peripheral blood, stimulated with the peptides from the gag region of HIV-1 and enterotoxin B from Staphylococcus aureus (SEB), the frequency of regulatory T cells and the exhaustion/differentiation phenotypic profile and expression of integrin alfa4beta7 and CCR9 in T cells were assessed by flow cytometry. RESULTS: In HIV group, CD4+ and CD8+ T cells from peripheral blood showed a higher frequency of PD-1, and CD95 and low expression of CD127 compared to ENI and control groups. The frequency of Th17 cells in MNCs increased in ENI and HIV-1 groups in the unstimulated conditions, however, upon stimulation with p24 peptides of HIV-1 Gag induced response only in HIV-1 group. The ENI group showed antigen-specific response only for IL-22. Moreover, evaluating the Tc22 and Th22 cells, it was found increased response to Gag peptides and also for SEB in both, HIV and ENI groups. The presence of polyfunctional antigen-specific T cells secreting 5-4 cytokines, was only detected in CD38+ T cells from HIV group, while ENI individuals showed polyfunctional CD38- T cells response only with the polyclonal stimulus with SEB. A decreased absolute number of regulatory T cells (CD4 + CD25 + CD127low /-Foxp3 +) was detected in HIV group compared to the EU and control groups, with higher expression of HLA-DR and CD95 molecules. In addition, it was detected decreased frequency of CD8+ alfa4beta7 + T cells in the ENI group and CD4+ alfa4beta7+ T cells in both, ENI and HIV groups. There was a positive correlation between Tc22 and Th22 cells with the CD8+ and CD4+ T cells expressing alfa4beta7, in the ENI and HIV-1 groups. CONCLUSION: The EU individuals are able to develop antigen-specific response related to IL-22, which has an important function in the mucosal immunity. In addition, showed presence of polyfunctional T cells with low activation profile to polyclonal stimuli. The data show that the EU individuals, showed induction of Tc22 cells, increased expression of homing molecules into the intestine and balance between effector cells and Treg cells, which together, must play an important role in the HIV-1 resistance

A hepatite C é uma doença que leva à inflamação do fígado, sendo causada pelo vírus da hepatite C (VHC). Estima-se que existam 130 a 170 milhões de casos de infecção crônica pelo VHC por todo o mundo. Apesar do VHC ser principalmente hepatotrópico, foi evidenciada a detecção de RNA viral em células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Evidências clínicas e experimentais têm demonstrado um importante tropismo do VHC por células do sistema imune, em especial por PBMCs. Apesar deste interessante achado, a importância da infecção do sistema imune na história natural da doença não é totalmente conhecida. É possível observar em alguns estudos que, em pacientes que desenvolvem infecção aguda, observa-se uma vigorosa resposta mediada por células T, específica ao VHC, mediada, por células T CD4+ e T CD8. Esta resposta é detectada na fase inicial da doença, e prolonga-se durante vários anos após a resolução do vírus. Pelo contrário, os pacientes que desenvolvem infecção crônica, apresentam, normalmente, respostas T fracas e / ou de curta duração, bem como defeitos nas funções efetoras de células T específicas. As respostas mediadas por células T com este perfil resultam, normalmente, em um baixo controlo da viremia e na sua persistência. Outra importante questão que permanece incerta até o presente momento é como a infecção das células imunes pelo VHC altera a sua função, principalmente no que concerne às PBMCs. Informações referentes às PBMCs e o VHC são pouco estudadas e referidas na literatura internacional, embora sejam de fundamental importância para a compreensão do seu peso na história natural da infecção. OBJETIVO: Baseado nessas incertezas o presente estudo tentará contribuir para a elucidação da influência do parasitismo por VHC na função de células TCD4+ e TCD8+ em pacientes naïve com indicação de tratamento com IFNpeg+RBV e comparar os dados obtidos antes, durante e pós-tratamento com os valores encontrados dos controles negativos, avaliando a influência do tratamento sobre a função dessas células. Verificar a presença do RNA-VHC nas PBMCs por RT-PCR em Tempo Real. Verificar a influência de fatores do vírus e do hospedeiro, tais como genótipo, carga viral, idade, gênero, raça, polimorfismo IL28B e biópsia hepática sobre as células parasitadas pelo VHC e sua produção de citocinas; Determinar a contagem e a função de linfócitos T CD4+ e CD8+ no sangue periférico desses pacientes; Determinar a influência do parasitismo de linfócitos pelo VHC sobre a função dos linfócitos TCD4+ e TCD8+. METODOLOGIA: Foram estudados 52 pacientes com hepatite C crônica; destes, 17 pacientes foram tratados com IFNalfa+RBV; 10 controles sadios, atendidos no Ambulatório de Hepatites da Divisão de Clínica de Doenças Infecciosas e Parasitárias do HC FMUSP. A contagem de células da subpopulação de linfócitos T CD4+ e CD8+ periféricas foram realizadas por citometria de fluxo FACSCanto II (BD) por meio do software MultiSet(BD). Foi analisada a presença/ausência do RNA-VHC em PBMC por PCR em tempo real no sistema TaqMan, no termociclador Applied Biosystems StepOne(TM). A função dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ foram avaliadas através da técnica ELISPOT utilizanso o Kit Human IFN-gamma/IL-4 Dual-Color FluoroSpot. A contagem dos spots foi realizada em um leitor automatizado CTL-ImmunoSpot® S6 FluoroSpot Line. As PBMCs foram fracionadas e depletadas, utilizando-se o Kit Dynabeads FlowComp Human CD4 (Invitrogen Life Technologies) segundo as instruções do fabricante. RESULTADOS: Foram estudados 52 pacientes com hepatite C crônica; destes, 17 pacientes foram tratados com IFNalfa+RBV; 10 controles sadios. O genótipo 1 foi o mais prevalente 61,5%. O RNA do VHC foi detectado nas PBMCS em 88,4% dos pacientes. XVII Nossos resultados mostraram um aumento de células CD4 e CD8 parasitadas pelo VHC antes do tratamento, com valores estatisticamente significantes quando comparadas aos controles normais apenas no caso das CD4. Ocorreu, porém, um nítido prejuízo na produção de interleucinas por estas células parasitadas, particularmente a produção de IFN- y, com valores altamente significantes (0,009). Na semana 12, podemos ver o aumento de células CD4 no pré-tratamento, porém com diminuição na semana 12 e no follow up; entretanto a produção de IL-4 pelas células CD4 aumenta na semana 12 e cai novamente no seguimento; com as células CD8 ocorre leve queda na semana 12 porém uma tentativa de recuperação no follow up; sua produção de IFN-y cai na semana 12 e no follow up para números estatisticamente significantes. É a chamada \"exaustão\" de função destas células já descrita in vitro por alguns autores. Estes dados poderão ser muito úteis nas futuras observações desses pacientes que serão tratados com esquemas de DAAs sem interferon alfa. CONCLUSÃO: Em conclusão, os resultados desta pesquisa confirmam a importante influência do parasitismo das células CD4 e CD8 em suas funções / Hepatitis C is a disease that causes inflammation of the liver, caused by hepatitis C virus (HCV). It is estimated that there are 130 million to 170 million cases of chronic HCV infection worldwide. Although HCV is primarily hepatotropic was evidenced by detection of viral RNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Clinical and experimental evidence have demonstrated an important tropism of HCV by immune system cells, in particular by PBMC. Despite this interesting finding, the importance of infection of the immune system in the natural history of the disease is not fully known. It can be observed in some studies in patients who develop acute infection a vigorous response is observed mediated by T cells specific to HCV mediated by CD4 + and CD8. This response is detected at the initial stage of the disease, and extends for years after the resolution of the virus. Conversely, patients who develop chronic infection, are typically in the low T responses and / or short-term as well as defects in the effector functions of specific T cells. The responses mediated by T cells with the profile usually result in a low control of viremia and its persistence. Another important issue that remains unclear to date is how the infection of immune cells by HCV alters its function, especially with regard to the PBMCs. Information relating to the PBMCs and HCV are little studied and reported in the international literature, although they are of fundamental importance for the understanding of its weight in the natural history of infection. OBJECTIVE: Based on these uncertainties the present study attempts to contribute to the elucidation of the influence of parasitism by HCV on CD4 T cell function + and CD8 + in naïve patients with treatment indication with IFNpeg + RBV and compare the data obtained before, during and after treatment with the values found negative controls, assessing the influence of treatment on the function of these cells. Verify the presence of HCV-RNA in PBMC by RT-PCR in real time. Check the influence of virus and host factors such as genotype, viral load, age, gender, race, IL28B polymorphism and liver biopsy on the parasitized cells with HCV and their cytokine production; Determine count and function of lymphocytes T CD4 + and CD8 + peripheral blood of patients; To determine the influence of parasitism lymphocytes HCV on the function of CD4 + and CD8 + T lymphocytes. METHODS: We studied 52 patients with chronic hepatitis C; of these, 17 patients were treated with IFNalpha + RBV; 10 healthy controls, treated at the Hepatitis Clinic of the Division of Clinical Infectious and Parasitic Diseases of the FMUSP. The lymphocyte subpopulation of T-cell count CD4 + and CD8 + peripheral been made by FACSCanto II flow cytometer (BD) through the multiset software (BD). the presence / absence of HCV-RNA in PBMC by real-time PCR was analyzed in the TaqMan system, Applied Biosystems thermal cycler StepOne (TM). The role of CD4 + T lymphocytes and CD8 + were assessed by ELISPOT technique utilizanso the Human Kit IFN-gamma / IL-4 Dual-Color FluoroSpot. The counting of the spots was carried out in an automated reader CTL-ImmunoSpot® S6 FluoroSpot Line. And fractionated PBMCs were depleted using Dynabeads kit is the Human CD4 FlowComp (Invitrogen Life Technologies) according to manufacturer\'s instructions. RESULTS: We studied 52 patients with chronic hepatitis C; of these, 17 patients were treated with IFNalpha + RBV; 10 healthy controls. Genotype 1 was the most prevalent 61.5%. The HCV RNA was detected in PBMC in 88.4% of patients. Our results showed an increase of CD4 and CD8 cells parasitized with HCV prior to treatment, with statistically significant amounts compared to controls only if CD4. There was however, a marked impairment in production of interleukins for these parasitized cells, particularly the production of IFN- y, with highly significant values (0.009). At week 12, we can see the increase in CD4 cells before treatment, but with decreased at week 12 and at follow up; However IL-4 production by CD4 cells increased at week 12 and again falls in the following; with the CD8 cells is slightly lower at week 12 but a recovery attempt at follow up; their IFN-y production drops at week 12 and follow up to statistically significant numbers. It is called \"exhaust\" function of these cells in vitro been described by some authors. This data is very useful in future observations of these patients are treated with AADs regimens without interferon alfa. CONCLUSION: In conclusion, the results confirm the important influence of the parasitism of CD4 and CD8 cells in their functions

O objetivo do trabalho foi avaliar a utilização da metodologia de citometria de fluxo na determinação da contagem bacteriana total (CBT) do leite cru. No primeiro estudo foi avaliado o efeito da temperatura de armazenamento, da idade da amostra e do tipo conservante sobre a CBT. Também foi estudada a possibilidade de se utilizar uma única amostra de leite para a realização das análises previstas na Instrução Normativa 51 (IN-51). Foram testadas, três temperaturas de armazenamento (0oC – congelado, 7oC – resfriamento e 24 oC – ambiente), três conservantes (bronopol, azidiol e sem conservante) e quatro tempos entre a coleta e a análise (idade da amostra) (um (D1), três (D3), cinco (D5) e sete (D7) dias). Foi considerado tratamento controle para análise de CBT, amostras refrigeradas, com azidiol e com um dia de idade. Para as análises de composição e CCS, o tratamento controle foram amostras refrigeradas, com bronopol e com um dia de idade. Os resultados indicaram que será necessária a coleta de duas amostras, uma destinada à determinação de CCS e composição, contendo bronopol e, outra, para CBT, contendo azidiol. A amostra para CBT poderá ser analisada em até sete dias após a coleta, desde que mantida sob refrigeração à 7ºC. Deve-se evitar o aquecimento ou o congelamento da amostra para CBT, bem como garantir a adição do azidiol. O segundo estudo teve como objetivo estabelecer a correlação entre os métodos de referência e de citometria de fluxo na determinação da CBT. Amostras coletadas nos meses de junho à setembro (n=155) foram agrupadas considerando-se estação da seca e as coletadas nos meses de novembro e dezembro (n=68), estação das águas. Foram realizadas análises simultâneas pelos métodos de referência (contagem padrão em placas) e de citometria de fluxo (equipamento Bactocount), sendo os resultados expressos em unidades formadoras de colônia (UFC) e contagem individual de bactérias (CIB), respectivamente. As equações lineares de correlação entre a CIB e UFC foram semelhantes nas estações, indicando que uma única equação pode ser utilizada ao longo do ano para transformar os resultados de CIB para UFC. A equação linear obtida foi: log(UFC) = log(CIB) x 0,7224 + 1,4617 com coeficiente de correlação de 0,8125. A acurácia do equipamento Bactocount na estimativa do valor de referência, expressa pelo erro padrão (s(y,x)), foi de 0,309 log UFC/mL. Os resultados mostraram que o equipamento Bactocount pode ser calibrado para expressar os resultados em UFC e com isso ser utilizado no monitoramento da qualidade do leite. / The objective of this study was to evaluate the utilization of electronic flow cytometry to determine total bacterial count (TBC) of raw milk. In the first experiment, the effect of storage temperature, sample age and milk preservative type on TBC were evaluated. Additionally, the use of a single milk sample to performance regulatory milk analysis under the Normative Instruction 51 (NI-51) was tested. Effects were standardized as: three storage temperatures (0ºC – freezer, 7ºC – refrigerator and 24ºC – room temperature), four sample ages (1 (D1), 3 (D3), 5 (D5) and 7 (D7) days) and three milk preservatives (bronopol, azidiol and no preservative). Control treatment for TBC analysis was defined as refrigerated milk samples containing azidiol with 1 day of storage. For determination of milk components and somatic cell count (SCC), control treatment was defined as refrigerated milk samples containing bronopol with 1 day of storage. Results of the first experiment showed that two milk samples are necessary to performance regulatory milk analysis under the NI-51; one containing bronopol should be used for determination of milk components and SCC, and other containing azidiol for TBC. Milk samples used for TBC can be tested until 7 days after sampling when they are kept at 7ºC. Freezing or heating milk samples for TBC analysis should be avoided and addition of azidiol is always necessary. The second experiment was designed to determine a correlation between two methods of TBC, electronic flow cytometry and standard plate count. Milk samples collected from June to September (n = 155) were named as dry season samples and milk samples collected in November and December (n = 68) were named as rainy season samples. Each milk sample was used to run both methods of TBC. Results were expressed as individual bacterial count (IBC) and colony forming unit (CFU) for electronic flow cytometry (Bactocount) and standard plate count, respectively. The linear equations of correlation between IBC and CFU had similar patterns in both seasons, dry and rainy, indicating that a single equation can be used to transform IBC results in CFU along the year. The linear equation was defined as log(CFU) = 0.7224 x log(IBC) + 1.4617 with coefficient of correlation of 0.8125. The accuracy of Bactocount in estimating reference values, denoted by the standard error (s(y,x)), was 0.309 log CFU/mL. The results showed that Bactocount can be calibrated to express TBC readings in CFU and, consequently, be used to monitor milk quality.

A criopreservação dos espermatozóides eqüinos gera alterações nas membranas semelhantes às que ocorrem durante o processo de capacitação (criocapacitação). Sabe-se que o plasma seminal possui fatores decapacitantes. Além disso, é citado na literatura a possibilidade melhorar a preservação dos espermatozóides com membrana plasmática íntegra e motilidade, após refrigeração ou criopreservação, quando adicionado plasma seminal de animais que apresentam boa resposta à congelação ao sêmen de animais que apresentam espermatozóides com baixa capacidade de congelação. Assim, o presente experimento verificou se a criopreservação gera modificações semelhantes à capacitação e se a adição ao sêmen pós-descongelação de plasma seminal autólogo ou adquirido de um animal com boa resposta à congelação (homólogo) diminuía estes efeitos. Para isso, foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 4 garanhões. O sêmen in natura foi avaliado e então, processado e submetido à congelação. Após a descongelação o sêmen foi novamente avaliado e então dividido em três tratamentos: adicionado de diluidor de criopreservação sem crioprotetor (DIL), deste com 20 % (v/v) de plasma seminal homólogo (PH) ou com 20 % (v/v) de plasma seminal autólogo (PA). Em seguida, o sêmen foi incubado em banho-Maria (37°C) e submetido as avaliações nos três diferentes períodos de amostragem (0, 60 e 120 minutos de incubação). As avaliações do sêmen consistiram na análise computadorizada das características da motilidade (CASA) e nas análises por citometria de fluxo da reação acrossomal, do potencial de membrana mitocondrial, da estabilidade da membrana plasmática, da peroxidação lipídica e na detecção da fosforilação do aminoácido tirosina presente na superfície da célula espermática. As variáveis foram submetidas à análise de variância e ao teste LSD para comparação das médias, ao nível de 5 % de significância. A criopreservação não aumentou a população de células viáveis com membrana acrossômica reagida, nem a população de células viáveis com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitadas). Entretanto, a criopreservação levou a uma redução na quantidade de células com potencial de membrana mitocondrial e aumentou a peroxidação das membranas, além de induzir o aumento na fosforilação de proteínas presentes na superfície da célula. A criopreservação ocasionou uma redução de todas as variáveis analisadas pelo CASA, incluindo a população identificada como hiperativada. A adição do plasma seminal, indiferentemente da origem, melhorou a integridade da membrana plasmática, reduziu a população com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitados), além de reduzir a quantidade de proteínas fosforiladas na superfície do espermatozóide. Porém esta melhora só foi encontrada nas análises iniciais (tempo 0), com o tempo o plasma seminal mostrou não ser um meio adequado para se manter o sêmen armazenado levando a um prejuízo na maioria das variáveis estudadas. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a adição de plasma seminal com o intuito de reduzir os efeitos da criocapacitação. Contudo, ao adicionar o plasma seminal ao sêmen, este deve ser depositado no trato reprodutivo da fêmea o mais breve possível. / Cryopreservation of equine spermatozoa leads to capacitation-like changes (cryocapacitation). Seminal plasma contains decapacitating factors. Moreover, it has been known that addition of seminal plasma from stallions with good post-thaw semen quality to semen of stallions with low post-thaw semen quality preserve progressive motility and membrane integrity better. Therefore, this study was intended to find out whether the cryopreservation process induces capacitation-like changes and if addition of autologous seminal plasma or seminal plasma from stallion with good post-thaw semen quality (homologous) reduces cryocapacitation effects. For this, five ejaculates were obtained from each of four mature stallions. Samples of in natura semen were analyzed, and submited to cryopreservation. Post-thawed semen was analyzed again so divided in three treatments: only cryopreservation media without cryoprotectants, cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma homologous, and cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma autologous. All samples were maintained in water bath (37°C) for 120 minutes, while semen analyzes were assessed at time 0, 60 and 120 min. The assessment of each sample was determined by computer-assisted sperm analyses of motility (CASA) and flow cytometry analyzes of acrosome reaction, mitochondrial potential, increased membrane fluidity, lipid peroxidation and degree of protein tyrosine phosphorylation in sperm surface. The variables were submitted to analysis of variance and LSD test at 5% level of significance. Cryopreservation did not increase viable cells with acrosome reaction, neither viable cells with increased membrane fluidity (capacitated). However, cryopreservation led an decrease of cell with mitochondrial potential and an increased in lipid peroxidation, besides increase tyrosine phosphorylation of the equine sperm surface proteins. The cryopreservation caused a reduction of all variables assessed by CASA, including hyperactivated cells. Seminal plasma addition, regardless of origin, improved integrity of plasma membrane, reduced number of viable cells with increased membrane fluidity, besides decrease phosphorylation of sperm surface proteins. Nevertheless, the improved created only was found in the initial analysis (time 0), seminal plasma shown a harmful effect in maintenance of sperm during incubation. Incubation of sperm in seminal plasma damaged majority of variables assessed. Based on results, seminal plasma could be added to post-thawed semen to decrease the cryocapacitation effects. However, post-thawed semen has to be deposited as soon as possible in female reproductive tract when the seminal plasma is added.

O quelônio Phrynops geoffroanus aparece freqüentemente associado a cursos d\'água poluídos, sem que, no entanto, sejam conhecidos aspectos que descrevam sua atividade imune celular frente situações adversas (efeitos antrópicos). A citometria de fluxo permite mensurar características estruturais e imunológicas de células em suspensão submetidas a um fluxo contínuo, sendo capaz de analisar inúmeros tipos celulares. Neste trabalho foi desenvolvida metodologia para estudar e avaliar a função celular de leucócitos sangüíneos do Phrynops geoffroanus através da fagocitose e burst oxidativo espontâneo e induzido utilizando a citometria de fluxo. Para definir a metodologia foram utilizadas 86 amostras sangüíneas de Phrynops geoffroanus encontrados em ambientes antrópicos do rio Piracicaba, ribeirão Piracicamirim e Fundação Parque Zoológico de São Paulo como grupo de comparação. Estes resultados foram complementados pelo perfil hematológico. O processamento incluiu transporte e conservação das amostras em RPMI 1640 Gibco® para posterior utilização de Ficoll-PaqueTM PLUS como agente separador entre leucócitos e hemácias, utilizando-se centrifugações refrigeradas (18°C) com acelerações e desacelerações graduais. Amostras com porcentagens de viabilidade inferiores a 90 % não foram utilizadas na realização dos estímulos: Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate para induzir fagocitose e miristato acetato de phorbol (PMA) e Saccharomyces cerevisiae (Zymosan) na indução do burst oxidativo. Condições ambientais, espécie específica e da metodologia da citometria de fluxo determinaram uma melhor resposta para realização da fagocitose em comparação com o burst oxidativo dos leucócitos aqui avaliados. / The freshwater turtle Phrynops geoffroanus is frequently associated with polluted waters; however, the aspects that describe the cellular immune activity against adverse situations (anthropogenic effects) are still unknown. Flow cytometry allows us to measure and analyze the characteristics of the suspended cells when submitted to a continuous flow; it is capable of analyzing a number of different types of cells. In this study, it designed a methodology in order to study and evaluate the cellular function of blood leucocytes, through phagocytosis and spontaneous or induced oxidative bursts, using flow cytometry. This methodology, was designed with 86 blood samples, collected from Phrynops geoffroanus in anthropogenic environments of the river Piracicaba and its tributary Piracicamirim and the Sao Paulo Zoological Park Foundation, as a comparison group, all in Sao Paulo State, Brazil. These results were complemented with the blood profile. The samples were stored in RPMI 1640 Gibco®, medium for transportation. Initially, it was used Ficoll-PaqueTM PLUS, as a separator of leucocytes and red blood cells. Later the samples were centrifuged at 18°C, with gradual break and speed. Samples with viability percentage under 90% were not used. The agents used for stimulation were Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate to induce phagocytosis and phorbol miristate-acetate (PMA) and Saccharomyces cerevisiae (Zymosan) to induce oxidative burst. Environmental, species-specific and cytometric methodology conditions determined a better response for the occurrence of phagocytosis in comparison with oxidative burst of the leucocytes analyzed.

A citometria de fluxo é um método preciso, rápido e eficaz na avaliação de múltiplos parâmetros celulares, tanto estruturais como funcionais, propiciando a separação e o estudo de diferentes populações e sub-populações de células. No presente estudo, foram empregados métodos citométricos para caracterização dos diferentes tipos celulares sangüíneos de Centropomus parallelus, assim como para verificação da viabilidade celular, avaliação da atividade fagocítica e ativação do burst respiratório. Foram identificadas três sub-populações representativas de leucócitos: linfócitos, monócitos e trombócitos. Estas células foram estimuladas, in vitro, com Staphylococcus aureus, marcado com iodeto de propídeo (SAPI), lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS) e zymosan, partículas de Saccharomyces cerevisiae. As respostas frente aos estímulos foram distintas de acordo com o tipo celular e o estímulo apresentado. Os monócitos apresentaram maiores percentuais de fagocitose frente ao estímulo provocado pela SAPI e pelo Zymosan; já a população que continha trombócitos entre outros tipos celulares (por exemplo: linfócitos), apresentou \"fagocitose\" significativa apenas para SAPI. O burst oxidativo detectado pela fluorescência emitida pelo diacetato 2´7´diclorofluoresceína (DCFH) foi significativo apenas quando estimulado com PMA (miristato-acetato de forbol), não apresentando resposta estatisticamente significante para os estímulos SAPI e LPS. Após a exposição ao naftaleno nas concentrações 10-3, 10-6, 10-9 M durante quatro horas, in vitro, houve um aumento na fagocitose realizado pelos monócitos e trombócitos, porém uma diminuição no burst oxidativo apresentado nas concentrações 10-6 e 10-9 M de naftaleno. Este resultado reflete, in vitro, uma resposta ao contaminante com significado imunológico desfavorável para o peixe, já que as células estão aumentando a atividade fagocítica sem conseguirem, teoricamente, destruir o agente invasor. A partir desses resultados preliminares, podemos avaliar melhor, algumas características da resposta imune inata desta espécie de peixe, presente na costa litorânea brasileira. Estes parâmetros imunofisiológicos podem servir como base para futuros estudos ecotoxicológicos tanto em laboratório mas também a campo. Estudos que utilizam a imunidade inata como indicador biológico de alterações ambientais causadas por poluentes diversos, podem evidenciar o grau de impacto toxicológico sobre esta espécie e agregar valor a sua importância econômica e ecológica. / Flow cytometry is a precise, fast, and effective method for the evaluation of several cellular parameters, both structural and functional, allowing the sorting and analysis of particular populations and sub-populations of cells. In this study, we employed cytometric methods on the caractherization of different blood cell types from Centropomus parallelus, and also verified cell viability, phagocytic activity and oxidative burst in these cells. Three sub-populations were identified: lymphocytes, monocytes, and trombocytes. These cells were stimulated in vitro with propidium iodide-conjugated Staphylococcus aureus (SAPI), Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS), or zymosan (Saccharomyces cerevisae particles). Responses to each individual stimulus differed according to cell type. Monocytes displayed the higher percentages of phagocytosis in presence of SAPI or zymosan; on the other hand, the population that included trombocytes, among other cell types (such as lymphocytes) only performed phagocytosis in a relevant level in the presence of SAPI. The oxidative burst, detected by fluorescence emitted by 2´7´dichlorofluorescein diacetate (DCFH) was significant only after stimulation with PMA (phorbol myristate-acetate), but not when the stimulus was SAPI or LPS. Based on these preliminary results, the innate immune response in these animals (ubiquitous coastal waters of the Brazilian shore) can be further evaluated. Immunophysiological parameters in these species can build a solid ground for future ecotoxicological studies. Approaching innate immunity as a biological indicator of environmental changes induced by pollutants may support the degree of toxicological impact over these animals, and aggregate value to its current ecological and economical importance.

A cavidade peritoneal de camundongos abriga uma variedade de células do sistema imune. Inicialmente, devido as limitações metodológicas, acreditava-se que, aproximadamente, 90% das células peritoneais era representada por macrófagos. Em seguida, graças aos extensos estudos com células peritoneais, observou-se que, além dos macrófagos, o peritônio abrigava muitos linfócitos B, principalmente do subtipo B-1. Utilizando metodologias contemporâneas de FACS - citometria de fluxo, este trabalho mostra que, aproximadamente, 30% das células peritoneais são macrófagos, 55% são linfócitos B-1, dos quais 40% pertencem ao subtipo B-1a e 15% ao subtipo B-1b. Os 15%-20% restantes representam outros subtipos celulares, como linfócitos T, linfócitos B-2, linfócitos NK, eosinófilos, além da presença de outras populações de células que não foram possíveis de ser identificadas com os marcadores de superfície utilizados neste trabalho. Em contraste com a literatura, nossos estudos mostraram que os macrófagos da cavidade peritoneal de camundongos representam uma população heterogênea. Por meio da co-expressão de CD11b e F4/80, foi possível descrever dois subtipos funcionais de macrófagos, denominados aqui de PM-1 (CD11bhigh, F4/80high) e PM-2 (F4/8010W, CD11bint). As células PM-2 encontram-se em menor abundância (-10% do total de macrófagos) no peritônio não estimulado e, diferentemente de células PM-1, espraiam-se de forma alongada (bipolar) quando colocadas em cultura. Curiosamente, PM-2 são os únicos macrófagos peritoneais que expressam MHC-II e, ainda, 30% dessa população expressa CD11c, o marcador típico de células dendríticas. Já as células PM-1 possuem morfologia arredondada, estão em abundância no peritônio e produzem altas doses de NO após estímulo com LPS. Ambas as células são capazes de fagocitar bactérias in vivo, no entanto, as células PM-2 parecem mais eficientes, sendo capazes de internalizar quantidades maiores de bactérias. Após infecção in vivo, o número absoluto e a porcentagem de PM-2 aumenta muito no peritônio, chegando a representar metade dos fagócitos da cavidade peritoneal. Os macrófagos PM-1 e PM-2 parecem não representar monócitos já que não compartilham do fenótipo de monócitos presentes no sangue periférico. Deve-se ressaltar que, além das células PM-1 e PM-2, outras subpopulações do peritônio também expressam CD11b e F4/80. Com base na literatura atual, acredita-se que todas as células B-1 do peritônio expressam CD11b, uma molécula que é co-expressa com CD18 para formar o receptor de complemento e a molécula de adesão Mac-1. Entretanto, os estudos, apresentados neste trabalho, mostram que metade de cada subtipo de B-1 (B-1a e B-1b) não expressa CD11b. As células B-1 CD11b+ são maiores, mais granulosas e expressam quantidades maiores de IgM de superfície. As células CD11b+ possuem uma curiosa tendência de se juntar e formar duplas (doublets) fortemente ligadas entre si que estão presentes em abundância no peritônio de camundongos adultos. Além de ligarem entre si, as células B-1 podem formar duplas com macrófagos PM-1 e PM-2. Durante a ontogenia, as células CD11b- surgem primeiro no peritônio e são as progenitoras das células B-1 CD11b+. Após estímulo inflamatório (LPS í. v.) os linfócitos B-1 CD11b+ migram do peritônio para o baço, onde proliferam e transformam-se em células secretoras de anticorpos (plasmócitos). No peritônio, as células B-1 não são capazes de se diferenciar em plasmócitos (células CD138high). Os resultados apresentados aqui mostraram que, diferentemente dos macrófagos PM-2, os PM-1 são os responsáveis por inibir a formação de células secretoras de anticorpos derivadas de B-1. Em suma, nossos dados sugerem que, mediante estímulo inflamatório, as células B-1 maduras (CD11b+) migram do peritônio para o baço, afastandose de macrófagos PM-1. Já no baço, as células B-1 encontram um micro-ambiente favorável para se proliferarem e diferenciarem-se em plasmócitos, secretando a maioria dos anticorpos naturais vistos logo nas primeiras horas pós-estímulo. / Mouse peritoneal cavity (PerC) represents the source for a variety of cellular subsets of the immune system. In early studies, marred by Iimited methodological tools, it was thought that macrophages comprise roughly 90% of total PerC cells. Shortly thereafter, it was recognized that, beside macrophages, the mouse peritoneal cavity shelters large amount of B-lymphocytes, specially the B-1 subset. In essence, by applying contemporary technology, studies presented here show that, roughly 30% of PerC cells comprise macrophages, 55% comprise B-1 cells, which 40% represents the B-1 a subset and roughly 15% are B-1b cells. The remaining 15%-20% of PerC cells comprise a variety of known immune cells, including B-2, T, NK and eosinophils. In addition, there were some other cellular subsets that could not be identified in these studies, probably due to limited cell surface molecules analyzed. Surprisingly, the data presented here show that peritoneal macrophages represent a highly heterogeneous population. Based on the co-expression of both CD11b and F4/80, we have identified two functionally distinct subsets of peritoneal macrophages, named here as PM-1 (CD11bhigh, F480high) and PM-2 (CD11bint, F4/80low). PM-2 are less abundant (-10% within total macrophages) in the PerC of unstimulated mouse, however, unlike PM-1, these cells are able to spread in spindle (bipolar) morphology upon sorting and in vitro culture. Curiously, PM-2 is the only PerC macrophage that expresses surface MHC-II. In addition, one third of PM-2 population expresses CD11c, a universal marker for dendritic cells. In turn, PM-1 cells are round shaped cells, represent the majority of PerC macrophages (-90%) and secrete high amounts of NO upon LPS stimulation. In vivo phagocytosis assay revealed that both cells could internalize bacteria, however, PM-2 cells showed to be more efficient, in that it was able to phagocyte higher amounts of bacteria when compared to PM-1. After i.p. in vivo stimulation, the absolute number and percentage of PM-2 cells increase drastically in the peritoneum, reaching almost half of the total PerC macrophages. Importantly, PM-1 and PM-2 macrophages seem not to represent PerC monocytes since it does not share any of the phenotype expressed by blood monocytes. Interestingly, in addition to PM-1 and PM-2, some other cellular subsets in the PerC, such as eosinophils, are able to express CD11b and F4/80. PerC B-1 cells have long been known to express CD11b, which is co-expressed with CD18 to form the Mac-1/CR3 complement receptor and adhesion molecule. However, although all PerC B-1 cells are commonly believed to express CD11b, we show here that nearly half of the cells in each of the PerC B-1 subsets (B-1a and B-1b) do not express this surface receptor. The CD11b+ cells in each B-1 subset are larger, more granular and express higher levels of surface IgM than the CD11b- B-1 cells. Surprisingly, the CD11b+ B-1 subset has the curious tendency to initiate the formation of tightly associated doublets that are present at high frequency in adult PerC. In addition to binding to each other, B-1 cells can also form doublets with PM-1 and PM-2. During ontogeny, CD11b- B-1 cells arise earlier in the mouse PerC and are the progenitors of CD11b+ B-1 cells. Upon LPS stimulation, PerC CD11b+ B-1 cells migrate to the spleen where they proliferate and differentiate into antibody-secreting cells (plasma cells). Within the PerC, B-1 cells are not able to differentiate into plasma cells (CD138high cells). The data shown in here reveal that, unlike PM-2, PM-1 macrophages are the cellular subset responsible for inhibiting the formation of B-1-derived antibody-secreting cells. Altogether, our data suggest that, upon inflammatory stimuli, mature CD11b+ B-1 cells migrate from the PerC to the spleen, avoiding the inhibitory effect of PM-1 cells. In the spleen, B-1 cells find an appropriate environment to proliferate and terminally differentiate into antibody-secreting cells, thus, secreting the majority of immunoglobulin seen in few hours after in vivo stimulation.

Immunotoxins (ITs), which consist of antibodies conjugated to toxins, have been proposed as a treatment for cancer and chronic infections. To develop and improve the ITs, different toxins such as ricin, have been used, aiming for higher efficacy against target cells. The toxin pulchellin, isolated from the Abrus pulchellus plant, has similar structure and function as ricin. Here we have compared two plant toxins, recombinant A chains from ricin (RAC) and pulchellin (PAC) toxins, for their ability to kill HIV Env-expressing cells. Briefly, RAC and PAC were produced in E. coli, and chromatographically purified, then chemically conjugated to two different anti-HIV monoclonal antibodies (MAbs), anti-gp120 MAb 924 or anti-gp41 MAb 7B2. These conjugates were characterized biochemically by microcapillary electrophoresis and BCA assay and immunologically by a variety of ELISA tests. We performed a side-by-side comparison of their ability to bind, enter and kill HIV infected cells (H9/NL4-3) or Env-transfected 293T cells, as well as their non-specific toxicity on uninfected or non-transfected parental cells. Cell binding and internalization were studied by flow cytometry and confocal microscopy. Results showed that PAC can function within an effective IT. The ITs demonstrated specific binding against native antigens on persistently HIV-infected cells and recombinant antigens on Env-transfected cells. An irrelevant antibody conjugated to either RAC or PAC had no effect. PAC cytotoxicity appears somewhat less than RAC, the standard for comparison. This is the first report that PAC may have utility for the design and construction of therapeutic ITs, highlighting the potential role for specific cell targeting not only for AIDS also for cancer therapy. / As toxinas imunológicas (TIs), que consistem em anticorpos conjugados com toxinas, foram propostas como tratamento para câncer e infecções crônicas. Para desenvolver e melhorar as TI, diferentes toxinas, como a ricina, foram usadas, visando uma maior eficácia contra células alvo. A toxina pulchellina, isolada da planta de Abrus Pulchellus, tem estrutura e função semelhantes à da ricina. Aqui, comparamos duas toxinas de plantas, cadeias A recombinantes de toxinas de ricina (RAC) e pulchellina (PAC), por sua capacidade de matar células que expressam HIV. Resumidamente, RAC e PAC foram produzidos em E. coli e purificados por cromatografia, depois conjugados quimicamente com dois anticorpos monoclonais anti corpo-HIV diferentes (MAcs), MAc 924 anti-gp120 ou MAc 7B2 anti-gp41. Estes conjugados foram caracterizados bioquimicamente por eletroforese microcapilar e teste BCA e imunologicamente por uma variedade de testes ELISA. Realizamos uma comparação lado-a-lado de sua capacidade de ligar, entrar e matar células infectadas pelo HIV (H9 / NL4-3) ou células 293T transfectadas com Env, bem como a sua toxicidade não específica em parentes não infectados ou não transfectados Células. A ligação celular e a internalização foram estudadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Os resultados mostraram que PAC pode funcionar dentro de uma TI efetiva. As TI demonstraram ligação específica contra antígenos nativos em células persistentemente infectadas pelo HIV e antígenos recombinantes em células transfectadas com Env. Um anticorpo irrelevante conjugado com RAC ou PAC não teve efeito. A citotoxicidade de PAC aparece um pouco menor que o RAC, o padrão de comparação. Este é o primeiro relatório que o PAC pode ter utilidade para o projeto e a construção de TI terapêuticas, destacando o papel potencial para o direcionamento celular específico, não apenas para a AIDS, também para a terapia do câncer.

Os benzodiazepínicos (BDZ) são amplamente utilizados no tratamento da ansiedade. Aumentam a neurotransmissão GABAérgica por ação em sítios receptores específicos para BDZ presentes no complexo ionóforo no canal do receptor GABAA, onde modulam alostericamente suas atividades. Porém, além de atuar nesses receptores, têm sido relatado, também, a existência de receptores periféricos para benzodiazepínicos (PBR). Evidências sugestivas de uma ação imunomodulatória direta para os BZD emergem de estudos que demonstraram a presença de PBR em células imunes/inflamatórias. Este trabalho avaliou os efeitos da administração de diazepam sobre parâmetros imunológicos de ratos e desenvolveu um método para dosagem plasmática desse benzodiazepínico utilizando a técnica de microextração em fase líquida. Foram realizados tratamentos agudo e prolongado (21 dias) com as doses de 1 e 10 mg/kg. Os resultados mostraram que a dose de 1 mg/kg não alterou qualquer um dos parâmetros imunes analisados; porém, diminuiu a quantidade de hemoglobina e de hemácias, assim como o valor de hematócrito, quando administrado prolongadamente. Entretanto, a dose de 10 mg/kg, após ambos os tratamentos, foi capaz de diminuir as células apoptóticas e, conseqüentemente, de aumentar a porcentagem de células viáveis, aumentar a porcentagem de células Thelper e Tcitotóxicas, diminuir a porcentagem de células B e aumentar os níveis séricos de corticosterona. Além destes, observou-se, também, um aumento do número de reticulócitos e um aumento do número das células segmentadas no sangue periférico, após administração prolongada do diazepam, assim como um aumento do número de células segmentadas no baço, após administração aguda. A menor dose de diazepam (1 mg/kg) também não foi capaz de induzir tolerância, diferente da maior dose (10 mg/kg), que levou ao desenvolvimento de tolerância funcional. Esses resultados sugerem que a administração de diazepam em baixas doses (< 1mg/kg) não interfira com os parâmetros imunes analisados. Entretanto, o uso de diazepam em doses mais elevadas (> 10 mg/kg) é capaz de alterar tais parâmetros. Muito provavelmente esses efeitos tenham a ver com o número de receptores PBR presentes nas células imunes avaliadas e/ou com a dose de diazepam administrada. Com relação ao método analítico, encontrou-se linearidade na faixa de interesse (intervalo dinâmico de 25 a 2000 ng/mL) para o diazepam e o desmetildiazepam. Os limites de detecção e quantificação foram de 20 e 25 ng/mL, respectivamente, e os parâmetros analisados mostraram-se satisfatórios. Desta forma, o método desenvolvido utilizando a técnica de microextração em fase líquida mostrou-se prático, de baixo custo e com grande potencial para extração prévia à injeção no CG. / Benzodiazepines (BZD) are widely used for the treatment of anxiety. They enhance GABA-ergic neurotransmission through binding on specific BDZ recognition sites, within the GABAA receptor-ion channel complex, where they allosterically modulate its activity. However, recents studies showed that BZD also act on peripheral benzodiazepine receptor sites (PBR). Evidence for a direct immunomodulatory action for BZD emerged from studies that demonstrated the presence of PBR on immune/inflammatory cells. The present experiment was designed to analyze the effects of diazepam on rat immune parameters and to develop a method to detect diazepam on rat plasma through a liquid-phase microextraction technique (LPME). The effects of both acute and long-term (21 days) diazepam (1 and 10 mg/kg/day) administrations were evaluated. Results showed that diazepam (1 mg/kg) treatment did not change the immune parameters analyzed; however, long-term diazepam treatment decreased erytrocytes, hemoglobin and hematocrit values. Both diazepam (10mg/kg) acute and long-term treatments decreased the number of apoptotic cells and, consequently, enhanced the percentage of viable cells; they also increased the percentage of Thelper and Tcitotoxic cells; decreased the percentage of B cells and increased the corticosterone serum levels. Long-term diazepam (10 mg/kg) treatment enhanced reticulocytes and segmented cells in the peripheric blood; however, only acute diazepam (10mg/kg) treatment increased the number of segmented cells on spleen. The low dose of diazepam used (1 mg/kg) was unable to induce tolerance, differently of that found after the high dose of diazepam (10 mg/kg). This latter treatment indicated the development of functional tolerance, at least for diazepam effects on corticosterone serum levels. These results suggested that low doses of diazepam (< 1 mg/kg) were not able to change the immune parameters analyzed; however, high doses of diazepam (> 10 mg/kg) changed many of these immune parameters. It is possible that the observed effects were related to the number of PBR receptor sites present on immune cells and/or to the levels of serum diazepam after the treatments used. The analytical method provided to be linear in the interest range (dynamic range from 25 to 2000 ng/mL) for diazepam and its main metabolite, desmethyldiazepam. The limits of detection and quantification were 20 and 25 ng/mL, respectively, and the parameters analyzed provided to be satisfactory. Finally, the method developed utilizing the liquid-phase microextraction technique showed to be practical, with low costs and thus presenting potential to be used previously to the extraction procedures, i.e., prior to the injection into the gas-chromatography apparatus.