Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327726.pdf: 2295961 bytes, checksum: c15e851f205c598b58bb4eaa370c09f8 (MD5) Previous issue date: 2014 / O sequenciamento do genoma plastidial de coníferas vem sendo realizado por meio do isolamento do DNA total, seguido por amplificações do DNA plastidial através de PCR de longo alcance. Esse método de sequenciamento é mais trabalhoso do que o sequenciamento a partir DNA plastidial. O sequenciamento do genoma plastidial permite a realização de várias análises comparativas, como estudos filogenéticos, filogeografia, evolução e estrutura, localização de regiões repetidas, identificação de sítios de edição de RNA, entre outras. Dessa forma, o presente trabalho visou desenvolver um protocolo de isolamento de cloroplastos e DNA plastidial em coníferas e sequenciar o genoma plastidial do Podocarpus lambertii. O protocolo foi desenvolvido a partir da Araucaria angustifolia e Araucaria bidwilli (Araucariaceae), P. lambertii (Podocarpaceae) e Pinus patula (Pinaceae). O protocolo se baseia no isolamento plastidial a partir de um tampão salino, seguido por gradiente salino de Percoll. Essas duas estratégias combinadas, reduziram a contaminação e aumentaram o rendimento do DNA plastidial. O DNA plastidial foi sequenciado em sequenciador Illumina MiSeq, obtendo-se uma cobertura média do genoma de: 24,63 para A. angustifolia, 135,97 para A. bidwilli, 1196,10 para P. lambertii e 64,68 para P. patula. O genoma plastidial do P. lambertii é formado por 133.734 pb e apresentou a perda de uma das regiões invertidas repetidas. O genoma contém 118 genes únicos e 1 tRNA duplicado (trnN-GUU). Estruturalmente, o genoma plastidial do P. lambertii apresenta quatro grandes inversões de aproximadamente 20.000 pb quando comparado ao Podocarpus totara. O genoma plastidial do P. lambertii apresenta um total de 28 repetições em tandem e 156 simple sequence repeat (SSRs). Os resultados obtidos são inovadores uma vez que um protocolo viável para o isolamento de DNA plastidial de coníferas com alta qualidade e quantidade de DNA foi obtido. Adicionalmente, a sequência do genoma plastidial do P. lambertii revelou diferenças estruturais significativas, mesmo em relação à outra espécie do mesmo gênero. Os diversos SSRs encontrados no genoma plastidial do P. lambertii podem ser avaliados como regiões polimórficas intraespecíficas, que podem levar, entre outros, a estudos filogenéticos com maior sensibilidade.<br> / Abstract : Plastid genome sequencing protocols for conifer species have been based mainly on long-range PCR, which is known to be time-consuming and difficult to implement than sequencing from isolated plastid DNA. Plastid genome sequencing are useful for several comparative analyzes, as phylogeny, phylogeography, evolution and structure, location of repeated regions, identification of RNA editing sites, among others. Thus, this study aimed to develop a protocol for chloroplast and plastid DNA isolation in conifers and sequence the chloroplast genome of Podocarpus lambertii. The protocol was developed using Araucaria angustifolia and Araucaria bidwilli (Araucariaceae), P. lambertii (Podocarpaceae) and Pinus patula (Pinaceae) species. The protocol is based on plastid isolation with saline buffer followed by saline Percoll gradient. These two combined strategies reduced contamination and increased the plastid DNA yield. The plastid DNA was sequenced in MiSeq Illumina sequencer, and the average genome coverage were 24.63 to A. angustifolia, 135.97 to A. bidwilli, 1196.10 to P. lambertii, and 64.68 to P. patula. The chloroplast genome of P. lambertii is 133.734 bp in length and lacks one of the inverted repeat regions. The genome contains 118 unique genes and one duplicated gene, the tRNA (trnN-GUU). Structurally, the plastid genome of P. lambertii shows four large inversions of approximately 20,000 bp compared to Podocarpus totara. The plastid genome of P. lambertii shows a total of 28 tandem repeats and 156 simple sequence repeat (SSR). Results show that this improved protocol is suitable for enhanced quality and yield of chloroplasts and cpDNA isolation from conifers. Additionally, the sequence of the plastid genome of P. lambertii revealed significant structural differences, even in relation to other species of the same genus. The various SSRs found in the plastid genome of P. lambertii can be evaluated for intraspecific polymorphic regions, which may allow highly sensitive phylogeographic and population structure studies, as well as phylogenetic studies of species of this genus.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2013-06-25T19:28:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 308005.pdf: 1979576 bytes, checksum: 2732ed8feeacc3e70b995871beaf8ba7 (MD5) / O Pinheiro Brasileiro (Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze), é uma das quatro coníferas nativas do Brasil, e a mais ameaçada após décadas de exploração massiva. Estudos filogeográficos ajudam a esclarecer aspectos espaciais e temporais da dispersão pós-glacial de diversas espécies vegetais. Neste trabalho foram caracterizadas as relações filogeográficas utilizando a variação nas sequências de DNA cloroplastidial (cpDNA) de três espaçadores intergênicos (trnD-trnT, psbC-trnS e trnS-trnfM) em 510 indivíduos de 34 populações de Araucaria angustifolia com ocorrência nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e no município de San Pedro, Argentina. Dezesseis haplótipos foram detectados na análise de 2.508 pb das sequências não codificantes. Os índices de diversidade genética foram h=0,823 e ?=0,00068. Foi encontrada média diferenciação genética dentro da maioria das populações (Fst 0,269) e alta diferenciação genética entre as populações mais distanciadas geograficamente (Fst 0,431). A rede de haplótipos e a distribuição geográfica dos haplótipos mostraram a formação de três grupos filogeográficos (GS- Grupo Sul, GC- Grupo Centro e GN- Grupo norte), sugerindo preliminarmente a existência passada de três refúgios glaciais. Entre os grupos GS e GC foi observada a existência de uma zona secundária de mistura. O padrão encontrado de divergência genética se encaixa na categoria filogeográfica I de Avise, na qual a separação espacial provocou uma descontinuidade na distribuição dos haplótipos. Estes resultados preliminares sugerem que a partir do Holoceno mediano (4.320 A.P.), as populações de Araucaria angustifolia se expandiram dos possíveis refúgios até os limites geográficos atualmente conhecidos. Portanto, estas informações fornecerão subsídios para o planejamento mais adequado das ações para a conservação desta espécie.

Submitted by AMANDA CRISTINA BALDASSI null (amanda_baldassi@hotmail.com) on 2018-03-12T13:58:08Z No. of bitstreams: 1 AmandaBaldassi_final_corrigida.pdf: 1978602 bytes, checksum: 10397a5b59a6e3e263d85dd4e9677785 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-03-12T18:57:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 baldassi_ac_me_jabo.pdf: 1978602 bytes, checksum: 10397a5b59a6e3e263d85dd4e9677785 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-12T18:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 baldassi_ac_me_jabo.pdf: 1978602 bytes, checksum: 10397a5b59a6e3e263d85dd4e9677785 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As mudanças climáticas globais podem alterar significativamente o metabolismo das células vegetais. Um cenário com alta concentração de CO2 atmosférico pode ser benéfico para plantas do tipo C3 devido ao estímulo à fixação de carbono. No entanto, esse aumento esperado na taxa de assimilação de carbono também pode aumentar a atividade e a expressão das enzimas envolvidas na cadeia de transporte de elétrons, resultando em maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Nesse trabalho, foi estudada a resposta do sistema antioxidante em cloroplastos de Eucalyptus urophylla cultivados sob altas concentrações de CO2. As plantas de E. urophylla expostas a alta concentração de CO2 (980 ppm) mostraram um aumento no fechamento estomático e pequena, mas significativa, indução do estresse oxidativo em relação as plantas cultivadas em concentração atmosférica de CO2. Entretanto, essas respostas não foram observadas quando as plantas foram cultivadas em concentração de CO2 igual a 680 ppm, cujo tratamento induziu abertura estomática. Através de uma abordagem de proteômica de descoberta, foram identificadas e detectadas 19 proteoformas antioxidantes cloroplastidiais e 2 proteoformas diferencialmente reguladas. Dentre essas, destacam-se uma proteoforma de ascorbato peroxidase e uma de superóxido dismutase, as quais estão possivelmente envolvidas na neutralização de espécies reativas de oxigênio após cultivo em atmosfera enriquecida com CO2, e que podem ser utilizadas como marcadores bioquímicos de estresse abiótico ou como alvos em programas de engenharia genética. / Global climate change can significantly alter plant cell metabolism. A higher atmospheric CO2 scenario may be beneficial for C3 plants through the stimulation of carbon fixation. However, this predicted increase in the rate of carbon assimilation may also increase the activity and expression of enzymes involved in the electron transport chain, resulting in higher accumulation of reactive oxygen species. Here, we studied the responses of the chloroplast antioxidant system of Eucalyptus urophylla plants cultivated under high-CO2 conditions. E. urophylla plants exposed to a high concentration (980 ppm) of CO2 showed an increase in stomatal closure and a small, but significant, induction of oxidative stress in relation to plants grown at atmospheric CO2 concentration. However, these responses were not observed at a CO2 concentration equal to 680 ppm, which induced stomatal aperture. With the discovery proteomics approach used herein, we identified 19 chloroplast antioxidant proteoforms and pinpointed 2 differentially regulated antioxidants proteoforms. We highlight an isoform of ascorbate peroxidase and one of superoxide dismutase, which are possibly involved in the neutralization of reactive oxygen species upon cultivation in a high CO2 atmosphere and could be used as biochemical markers of abiotic stress or as targets in genetic engineering programs. / FAPESP: 2015/23354-8

Orientador: Tiago Santana Balbuena / Banca: Gilberto Barbosa Domont / Banca: Pedro Luís da Costa Aguiar Alves / Resumo: A emissão de dióxido de carbono (CO2) pelas atividades humanas vem aumentando desde a revolução industrial. Previsões indicam que ocorrerá um aumento expressivo da concentração atmosférica deste gás nos próximos anos. Este fato deve resultar em alterações metabólicas nas plantas e, por consequência, impactar o setor florestal brasileiro. Os cloroplastos são as organelas-chave na fixação do CO2 e início do particionamento do carbono nas plantas. Alterações na disponibilidade de CO2 podem afetar o metabolismo dessas organelas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar se o cultivo de plantas jovens de Eucalyptus urograndis em ambiente enriquecido com CO2 resulta em alterações no proteoma cloroplastidial. Para tanto, primeiramente foram avaliados diferentes métodos de isolamento de cloroplastos quanto aos seguintes parâmetros: morfologia dos cloroplastos observada em microscopia de luz (1); rendimento protéico após isolamento plastidial (2); grau de contaminação por proteínas não cloropastidiais (3); e abundância em número de proteínas identificadas e já descritas como plastidiais (4). Após a definição da melhor metodologia para obtenção do proteoma cloroplastidial, mudas de Eucalyptus urograndis de aproximadamente três meses de idade foram cultivadas sob concentrações atmosféricas controladas de CO2 (400 e 1000 ppm) durante dez semanas. A avaliação do proteoma plastidial, por buscas restringentes contra um banco de dados de sequências protéicas de Eucalyptus grandis, resultou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Carbon dioxide (CO2) emissions from human activities have increased since the industrial revolution. Global projections indicate that there will be a significant increase in the atmospheric concentration of this gas in the coming years. This fact can result in metabolic changes in plants and, consequently, affect the Brazilian forest sector. Chloroplasts are key organelles in carbon fixation and early carbon partitioning in plants. Changes in the availability of CO2 may affect the metabolism of these organelles. The goal of the present study was to assess whether the cultivation of seedlings of Eucalyptus urograndis under a CO2 enriched environment could result in changes in the chloroplast proteome. For this purpose, different chloroplast isolation methods were evaluated to the following parameters: chloroplast morphology observed in bright-field microscopy (1); protein yield after plastid isolation (2); degree of contamination by non-plastidic proteins (3); and abundance in the number of identified proteins described as plastidic (4). After determining the best methodology for the isolation of the chloroplast proteome, E. urograndis seedlings about three months old were grown under CO2 controlled atmospheric concentrations (400 and 1000 ppm) for ten weeks. Evaluation of the plastid proteome, using stringent search against a protein sequence database from Eucalyptus grandis, resulted in the identification of 816 proteins in E. urograndis, from which 80% were already describe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O oxigênio atua como substrato ou cofator numa série de reações bioquímicas do metabolismo primário e secundário das plantas. Várias estratégias têm sido utilizadas no sentido de interferir neste metabolismo aeróbico, visando, entre outras possibilidades, reduzir a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). A fim de alterar a disponibilidade de oxigênio no interior da organela, foram produzidas plantas de fumo (Nicotiana tabacum) expressando a leghemoglobina de soja no interior das mitocôndrias. Para tanto, as plantas foram transformadas, via Agrobacterium tumefaciens, com uma construção quimérica, onde o gene da Lba de soja foi fusionado a uma seqüência de direcionamento mitocondrial. A expressão do gene quimérico foi assegurada pela presença do promotor constitutivo 35S, do vírus do mosaico da couve-flor. A proteína foi corretamente importada e processada no interior das mitocôndrias. Entretanto, não foi possível detectar alterações significativas na função mitocondrial. Numa segunda etapa do presente trabalho, plantas transgênicas de batata (Solanum tuberosum cv Bintje) expressando a leghemoglobina de soja no interior dos cloroplastos, foram caracterizadas do ponto de vista molecular e fenotípico. Observou-se que as plantas apresentaram um fenótipo semelhante àquelas deficientes na biossíntese de giberelina / not available

Ao longo dos últimos anos, o radical livre gasoso óxido nítrico (NO) vem ganhando destaque como uma importante molécula sinalizadora em respostas fotomorfogênicas em plantas. Sua produção e dagradação parecem incluir uma diversificada gama de rotas bioquímicas, entretanto, a importância relativa de cada um dos sistemas capazes de regular sua disponibilidade e toxidade nos tecidos vegetais ainda permanece pouco compreendida. Dentre as possíveis rotas de conjugação e degradação do NO em tecidos vegetais, postula-se que a glutationa (GSH) desempenhe um papel de destaque no armazenamento desse radical livre por meio da formação reversível da S-nitrosoglutationa (GSNO), sendo possível sua subsequente degradação através da ação da enzima S-nitrosoglutationa redutase (GSNOR). No presente trabalho investigamos a influência da luz sobre o metabolismo de NO em duas etapas de desenvolvimento vegetal caracterizados pela ocorrência de eventos de diferenciação plastidial: (I) o desestiolamento de plântulas e (II) o amadurecimento de frutos carnosos de tomateiro (Solanum lycopersicum). Além do genótipo selvagem Micro-Tom (MT), também foram utilizados os mutantes fotomorfogênicos aurea (au) e high pigment 1 e 2 (hp1 e hp2). Durante o desestiolamento das plântulas de tomateiro constatou-se um incremento progressivo tanto nos teores endógenos quando nas taxas de degradação de NO, bem como na atividade da enzima GSNOR. Sob condições luminosas similares, mutantes com respostas exageradas à luz apresentaram incrementos ainda mais evidentes nesses parâmetros do que aqueles observados no genótipo selvagem. A aplicação de inibidores de S-nitrosilação de proteínas, bem como a avaliação do conteúdo de espécies reativas de oxigênio (ROS) indicaram que tanto a formação de S-nitrosotiois quanto a interação do NO com ROS contribuíram para a determinação da capacidade de remoção de NO nos tecidos fotossinteticamente ativos de tomateiro. Em frutos, observou-se uma correlação positiva entre a atividade da enzima nitrato redutase (NR) e o padrão temporal de produção de NO, uma vez que ambos os parâmetros apresentaram maiores níveis em frutos imaturos. O amadurecimento desses frutos foi acompanhado por uma diminuição transitória dos conteúdos de NO ao passo que as taxas de degradação de NO mantiveram-se bastante reduzidas durante todo o processo de amadurecimento, sugerindo a existência de um estoque de NO na forma de GSNO ou algum outro S-nitrosotiol. A sinalização luminosa influenciou positivamente tanto a produção quanto a degradação de NO em frutos imaturos de tomateiro. Em conjunto, os resultados obtidos permitem concluir que o metabolismo do NO em tomateiro é fortemente controlado pela luz, a qual é capaz de modular conjuntamente as taxas de produção e degradação desse importante composto sinalizador. / In recent years, the gaseous free radical nitric oxide (NO) has emerged as an important signaling molecule in plant photomorphogenic response. NO production and degradation seems to include a wide range of biochemical routes; however, the relative importance of which one of the systems capable of regulating NO availability and toxicity in plant tissues remains elusive. Among all potential NO degradation and conjugation routes in plant tissues, it has been suggested that gluthathione (GSH) plays a key role in NO storage due to the formation of S-nitrosogluthathione (GSNO), being possible its subsequent degradation by the action of enzyme S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR). In this work, we have investigated the light influence on NO metabolism during two plant developmental events characterized by the occurrence of plastidial differentiation: (I) seedling de-etiolation and (II) fruit ripening of tomato (Solanum lycopersicum). Besides the wild-type Micro-Tom (MT) genotype, the tomato photomorphogenic mutants aurea (au) and high pigment 1 and 2 (hp1 and hp2) were also employed in this study. During the de-etiolation of tomato seedlings, a progressive increment was observed in the NO endogenous levels and degradation rates as well as in the GSNOR activity. Under similar light conditions, light hypersensitive mutants exhibited more conspicuous increases in these parameters than those detected in the wild-type genotype. Feeding protein S-nitrosylation inhibitors and measurements of reactive oxygen species (ROS) production indicated that both S-nitrosothiols formation and NO interaction with ROS may to contribute for determining the NO removal capacity in photosynthetically active tissues of tomato. In fruits, a positive correlation was observed between nitrate reductase (NR) activity and the temporal pattern of NO production since both parameters exhibited increased levels in immature fruits. The ripening of theses fruits was accompanied by a transitory reduction in endogenous NO levels whereas its degradation rates were maintained reduced all over the ripening process, thereby suggesting the existence of a more stable NO reservoir such as GSNO or some other S-nitrosothiol. In general light signaling positively influenced both NO production and degradation in mature green tomato fruits. Altogether, the data obtained indicated that tomato NO metabolism is significantly influenced by light, which is able to simultaneous modulate both the production and degradation of this important signaling compound.

Ribulose-1,5-Bifsfosfato (RuBP) carboxilase/oxigenase (RuBisCO) é a enzima chave para a fixação do carbono atmosférico e para a produtividade das plantas. Não há, até o momento, uma metodologia estabelecida para otimizar o processo de fixação do CO2 nas diferentes espécies de plantas. Entretanto, a disponibilidade de um protocolo de transformação genética de cloroplasto de tabaco permite tentativas de manipulação da enzima RuBisCO visando aumento da eficiência fotossintética. Nas plantas, esta proteína é formada por 8 subunidades menores codificadas pelo gene rbcS localizado no genoma nuclear e por 8 subunidades maiores codificadas pelo gene rbcL localizado no genoma de cloroplastos. Neste trabalho, dois genes rbcL-sintéticos, um com a substituição da alanina (A) 378 por uma valina (V) (A378V) e outro sem a substituição foram utilizados para a construção dos vetores pTT629, pTT630, pTT632 e pTT633. Estes vetores foram usados para transformar o cloroplasto de folhas de tabaco, pelo método de biolística. Um total de 35 plantas transplastômicas se desenvolveram sob seleção dos antibióticos espectinomicina (500 mg/L) e estreptomicina (500 mg/L) e a análise molecular dos sítios de restrição AccI, EcoRI, NdeI e NsiI, de fragmentos amplificados da sequência codante atpB::rbcL:: aadA:: accD demonstrou a integração dos genes rbcL-sintéticos em 11 linhagens transplastômicas. Sementes F1 destas plantas demonstraram ser homoplásmicas pela germinação na presença do antibiótico espectinomicina (500 mg/L). Análises fisiológicas das taxas de fotossíntese (A), condutância estomática (gs) e de transpiração (E) das plantas transplastômicas (A378V) mantidas em casa-de-vegetação produziram valores maiores e significativos, quando comparados com as plantas sem a mutação e controle não transgênicos. O aumento da taxa de fotossíntese das linhagens transplastômicas indicam a possibilidade de aumento da atividade catalítica da RuBisCO. A compreensão da interação fotossintética com a atividade fotorrespiratória poderá permitir explorar e estender possíveis benefícios, como o aumento da produtividade em cultivares de interesse agronômico. / Ribulose-1,5-Bifsfosfato (RuBP) carboxylase/ oxygenase (RuBisCO) is the key enzyme for the fixation of atmospheric carbon and productivity of plants. At moment, no single solution to optimize the CO2 fixing process by the different species of plants. The availability of a few efficient chloroplast transformation protocols for all cultivars also directs attempts to manipulate the larger and small subunit of RuBisCO. In plants, this protein consists of coding form eight smaller subunits encoding the rbcS gene and 8 larger subunits of the rbcL gene respectively located in the nucleus and chloroplasts. Using two rbcL-synthetic genes, with an alanine (Ala) 378 substituting a valine (Val) (A378V) and another one without the replacement were used in the construction of pTT629, pTT630, pTT632 and pTT633 vectors, which were used in the method of biolistic to driving these transgenes into the chloroplast genome of tobacco. A total of 35 transplastomic plants were grown under selection of antibiotics spectinomycin (500mg/ L) and streptomycin (500mg/ L) and the molecular analysis using restriction sites AccI, EcoRI, NdeI and NsiI from the amplified fragments of atpB::rbcL:: aadA:: accD sequence displayed the rbcL-synthetic genes integrated into the plastome of the 11 transplastomic lines. The F1 seeds of these plants were shown to be homoplasmic from germinating in the presence of the antibiotic spectinomycin (500mg / L). The physiology analyzes of photosynthesis (A), stomatal conductance (gs) and transpiration (E) rates of these transplastomic lines (A378V) plants kept in green-house produced the highest and significant values when when compared to the control plants without the mutation and non-transgenic control. The increase of the photosynthesis rate form transplastomic lines indicates the possibility of increasing the catalytic activity of RuBisCO. The understanding of the photosynthetic interaction with photorespiration activity may allow explore more the potential benefits, such as increased productivity in crops of agronomic interest.

O déficit hídrico é o principal fator limitante na produtividade das culturas agrícolas. Com a crescente expansão da cultura canavieira rumo a regiões de marcantes déficits hídricos, torna-se essencial o desenvolvimento de variedades tolerantes a este tipo de estresse. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do déficit hídrico, em 20 variedades de cana-de-açúcar, visando identificar características para auxiliar o programa de melhoramento da cultura. O conteúdo relativo de clorofila, a eficiência quântica potencial do fotossistema II (Fv/Fm), o teor relativo de água (TRA), o incremento em altura dos colmos (IAC) foram utilizados como parâmetros fisiológicos além das características tecnológicas da matéria prima Brix e Pol. O déficit hídrico foi imposto pela suspensão da irrigação durante 3, 10 e 20 dias. O déficit hídrico reduziu o conteúdo relativo de clorofila, TRA, Fv/Fm, IAC e Pol para a maioria das variedades analisadas enquanto o teor de sólidos solúveis, mensurada através do Brix, não foi afetado. O período de suspensão de rega de 03 dias não foi suficiente para induzir déficit hídrico e, as melhores respostas para identificação de diferenças fisiológicas dentro de variedades foi obtida aos 20 dias. Não foi observado padrão de resposta que possa ser relacionado com o nível de tolerância das variedades para o resultado dos parâmetros IAC, TRA, Brix e Pol. Contudo constatou-se que os parâmetros Fv/Fm e conteúdo relativo de clorofila mostraram-se eficientes para diferenciar variedades de cana-de-açúcar tolerantes e sensíveis à deficiência hídrica. / Drought is a major limitation to crop productivity worldwide. The sugarcane is a crop in expansion towards areas of marked water deficit and it is essential the development of drought tolerant varieties. The aim of this work was to study the effects of drought in 20 sugarcane genotypes to identify parameters to improve the genotype screening in the breeding program. The relative chlorophyll content, potential quantum efficiency of photosystem II (Fv/Fm), the relative water content (TRA), the increase in height of stalks (IAC) were evaluated as physiological parameters in addition to the technological parameters Brix and Pol. The water deficit was imposed by withholding irrigation for 3, 10 and 20 days. The water deficit reduced the relative chlorophyll content, TRA, Fv/Fm, Pol and IAC for most varieties evaluated while the soluble solids content, measured by ° Brix, was unaffected. The withhold treatment of 03 days was not sufficient to induce water deficit and the best results to identify physiological differences within genotypes were obtained with 20 days. The IAC, TRA, Brix and Pol results were not related to the level of tolerance of genotypes. However, Fv/Fm and relative chlorophyll content traits were effective to distinguish between drought tolerant and susceptible sugarcane genotypes subjected to water stress.

Na célula eucariota, os processos metabólicos estão compartimentalizados em organelas e proteínas sintetizadas no citosol são endereçadas para elas por meio de sistema celular específico. Devido a sobreposições funcionais entre organelas, uma dada proteína pode ser requerida em mais de um compartimento. É o caso de proteínas com duplo direcionamento, em que um gene nuclear é capaz de gerar produtos protéicos direcionados para mais de uma organela. Cerca de 60 proteínas de plantas já tiveram seu duplo direcionamento demonstrado, a maioria para mitocôndrias e cloroplastos, portanto um fenômeno não tão raro como imaginado. Estudos recentes procuram esclarecer os mecanismos que permitem esse duplo direcionamento, mesmo existindo fatores celulares que garantem a especificidade do transporte para cada organela. O presente trabalho está dividido em três partes. Na primeira, foram investigados aspectos evolutivos do duplo direcionamento. Na análise comparativa de famílias gênicas com membros cujos produtos protéicos apresentam duplo direcionamento, em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, foi demonstrada a conservação do duplo direcionamento de monodeidroascorbato redutase, metionina aminopeptidase e, provavelmente, de THI1 (enzima da biossíntese de tiazol), entre as duas espécies. Os dados sugeriram um mesmo padrão de evolução em famílias incluindo membros com duplo direcionamento. Na segunda parte, o foco foi a seqüência de duplo direcionamento. Documentado o duplo direcionamento, para mitocôndrias e cloroplastos, de proteínas de ligação ao RNA, RBP1a, RBP1b e RPS19, mutações sítiodirigidas foram introduzidas na seqüência de direcionamento de RBP1b. A importância de aminoácidos positivos para o direcionamento de proteínas para mitocôndrias foi confirmada. Demonstrou-se que a mutação da alanina na posição 2, conservada em seqüências de direcionamento ambíguas para mitocôdrias e cloroplastos, não afeta o duplo direcionamento de RBP1b. A informação para o duplo direcionamento foi localizada entre os 17 primeiros aminoácidos da região amino-terminal. Os sinais de direcionamento para cloroplastos se distribuíram ao longo da seqüência. Enquanto a metade amino-terminal da seqüência foi suficiente para determinar o duplo direcionamento, a seqüência compreendendo os 13 aminoácidos seguintes afetaram a eficiência do transporte. Nessas análises, mostrou-se a adequação de método quantitativo na medida dos sinais de fluorescência da GFP, para ser aplicado em estudos quantitativos do direcionamento de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos, in vivo. Na terceira parte, o foco foi o mecanismo traducional do duplo direcionamento de THI1, em A. thaliana. Entretanto, não foi possível testar a hipótese da presença de um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) no mRNA de thi1, pois não se encontrou um sistema de expressão transiente capaz de reproduzir dados da literatura que mostraram o duplo direcionamento de THI1. Nos sistemas testados, a proteína foi encontrada somente em cloroplastos, o que inviabilizou o prosseguimento da investigação. / Compartimentalization of the metabolic processes in organelles, each one having a characteristic protein pool and distinct functions, is a property of eukaryote cells. A highly specific cellular system directs proteins, which are synthesized in the cytosol, to the proper organelles. However, due to functional overlaps between organelles, a given protein may be needed in different compartments. This is the case of dual-targeted proteins, which are the product of single nuclear genes, but are somehow directed to different organelles. About 60 plant proteins have had their dual targeting demonstrated, most of them to mitochondria and cloroplasts, the phenomenon being not so rare as previously supposed. Investigations have focused on the mechanisms, which enable protein dual targeting, even in the presence of other cell mechanisms that guarantee the specific protein transport to each organelle. The present work on the subject can be divided in three parts. In the first part, evolutionary aspects of dual targeting were investigated. A comparative analysis of gene families that included members encoding dual-targeted proteins in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa demonstrated that the dual targeting of monodehidro-ascorbate reductase, methyonine aminopeptidase and, problably, of the thiazole biosynthetic enzyme THI1 was evolutionary conserved between the two species. In addition, the data suggested the same pattern of evolution for families with members presenting dual targeting. The focus of the second part was the ambiguous sequence for dual targeting. After showing that the RNA-binding proteins RBP1a, RBP1b and RPS19 were dual-targeted to mitochondria and cloroplasts, sitedirected mutations were introduced in the targeting sequence of RBP1b. The importance of positive-charged amino acids for directing the protein to mitochondria was confirmed. Mutation of alanine at position 2, which is conserved in ambiguous sequences, was shown not to affect RBP1b dual targeting. Information for dual targeting was localized among the 17 first amino acids in the amino-terminal region. The signals for directing the protein to cloroplasts appeared distributed along the targeting sequence. While the amino-terminal half of the sequence was sufficient for RBP1b dual targeting, the sequence comprising the next 13 amino acids appeared to affect the efficiency of the transport. In these analyses, a quantitative method to measure the intensity of fluorescent signals of GFP had its efficacy demonstrated to be adopted for in vivo quantitative analysis of dual targeting to mitochondria and cloroplasts. In the third part, the focus was the translational mechanism enabling THI1 dual targeting to mitochondria and cloroplasts, in A. thaliana. It was hypothesized that an internal ribosomal entry site (IRES) was present in thi1 mRNA. However, a transient expression system could not be found that reproduced the literature data demonstrating THI1 dual targeting. In the tested systems the protein was addressed solely to cloroplasts, thus preventing the objective to be pursued.

Orientador: Wanderley José de Melo / Coorientador: Renato de Mello Prado / Banca: Fábio Olivieri de Nóbile / Banca: Fábio Luiz Checchio Mingotte / Resumo: O experimento foi conduzido em casa de vegetação na FCAV/UNESP. Objetivou-se avaliar a caracterização os sintomas visuais de deficiência de micronutrientes em folhas; e avaliar os efeitos desses micronutrientes no estado nutricional do maracujazeiro amarelo. No experimento foi utilizado solução nutritiva, como substrato vermiculita em extrato úmido. Foram utilizadas mudas de maracujá (Passiflora edulis Sims.) do híbrido comercial BRS Gigante Amarelo do Cerrado. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado; com oito tratamentos (solução completa (Controle), omissão de B, omissão de Cu, omissão de Fe, omissão de Mn, omissão de Mo, omissão de Zn, solução completa + Ni); e 5 repetições. Utilizou-se como unidade experimental; vasos com 8 dm-3 de substrato com 1 planta/vaso e 2 vasos por unidade experimental. Após 60 dias do plantio, foi avaliada a matéria seca de cada tratamento, foi feito diagnóstico visual das deficiências nutricionais em folhas. Semanalmente foi avaliado o teor de clorofila para estabelecer regressão linear ou quadrática, entre os teores de clorofila e as deficiências nutricionais de cada tratamento; uma avaliação de variáveis fisiológicas como a transpiração, fotossíntese, condutância estomática e concentração interna e externa de CO2. Avaliaram-se características morfológicas como desenvolvimentos de pêlos radiculares e alterações no mesofilo foliar. A ordem de manifestação das deficiências no experimento foram as seguintes: Fe>Mn>Zn>Cu>Mo>B; a to... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The experiment was conducted in a greenhouse at FCAV / UNESP. The objective was to evaluate the characterization of the visual symptoms of micronutrient deficiency in leaves; And to evaluate the effects of these micronutrients on the nutritional status of yellow passion fruit. In the experiment, a nutrient solution was used, with vermiculite as a substrate in a humid extract. Passion fruit (Passiflora edulis Sims.) Seedlings of commercial hybrid BRS Gigante Amarelo do Cerrado were used. The experimental design was completely randomized; With eight treatments (complete solution (Witness), omission of B, omission of Cu, omission of Fe, omission of Mn, omission of Mo, omission of Zn, complete solution + Ni); And 5 replicates. It was used as experimental unit; Vessels with 8 dm-3 of substrate with 1 plant / pot and 2 pots per experimental unit. After 60 days of planting, the dry matter of each treatment was evaluated, and the nutritional deficiencies were evaluated in leaves. The chlorophyll content was evaluated weekly to establish linear or quadratic regression between chlorophyll levels and nutritional deficiencies of each treatment; besides an evaluation of physiological variables such as transpiration, photosynthesis, stomatal conductance and internal and external CO2 concentration. Morphological characteristics were evaluated by means of optical microscope as were the development of root hair and by means of transmission electron microscopy, changes in leaf mesophyll. The o... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre