Entwicklung der Vaskularisierung und des Fasergehaltes im Knochenmark von CML-Patienten während der Behandlung mit Imatinib Gesteigerte Gefäßneubildung und retikuläre Fibrose sind zwei morphologische Veränderungen im Knochenmark von CML-Patienten, welche mit einem schlechteren Krankheitsverlauf assoziiert sind. Imatinib, ein selektiver Tyrosinkinaseinhibitor, hemmt die angiogenen und fibrogenen Substanzen VEGF und PDGF. Diese Dissertation untersuchte den Einfluss von Imatinib auf die Vaskularisierung und den retikulären Fasergehalt im Knochenmark von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML). Es wurden 67 repräsentative Knochenmarkbiopsien von insgesamt 19 Patienten, behandelt in Multicenter-Studien an der Universitätsklinik Leipzig, eingeschlossen. Davon waren zehn Patienten bereits mit IFN-α + Cytarabin vorbehandelt worden. Neun Patienten mit neudiagnostizierter CML erhielten Imatinib als Ersttherapie. Knochenmarkbiopsien zu den Zeitpunkten t0 (vor Therapiebeginn), t1 (6-15 Monate) und t2 (21-36 Monate) nach Behandlungsstart mit Imatinib wurden untersucht. Weiter wurde eine Kontrollgruppe aus 19 KM-Biopsien gebildet, welche ohne pathologischen Befund waren. Während der Behandlung mit Imatinib kam es bei der Mehrzahl der Patienten zu einer Normalisierung der Gefäßdichte im Knochenmark. Der Fasergehalt im Knochenmark der CML-Patienten sank bei allen Patienten auf Normwerte ab. Dies zeigt den positiven Einfluss von Imatinib auf die morphologischen Veränderungen Vaskularisierung und Faserdichte im Knochenmark von CML-Patienten. Ein Einfluss der Vorbehandlung mit IFN-α + Cytarabin auf die Dynamik der morphologischen Parameter während der Behandlung mit Imatinib war nicht nachweisbar.

Die vorliegende Arbeit handelt von einer in vitro Untersuchung der Stoffwechselveränderun-gen durch die Expression von BCR/ABL bei BaF3-Zellen, einer murinen, IL-3-abhängigen B-Zelllinie. Die Zellen wurden in nährstoffreichem Standard- und in durch Titrationen ermittel-tem nährstoffarmem Minimalmedium auf unterschiedliche Stoffwechselaktivität in Abhän-gigkeit von BCR/ABL-Expression untersucht sowie auf die zusätzliche Beeinflussbarkeit durch IL-3. Danach wurden vergleichend zwischen den 2 Zelllinien (BaF3 und BaF3-BCR/ABL) im Minimalmedium und im Standardmedium Metabolite wie Glukose, Laktat und Aminosäuren bestimmt, wobei BaF3-BCR/ABL sowohl mit als auch ohne IL-3 kultiviert wur-de. Um den Einfluss von Nährstoffrestriktion auf die Therapie zu zeigen, wurden anschlie-ßend vergleichend in den beiden Medien die Tyrosinkinaseinhibitoren Imatinib und Nilotinib titriert. Die Ergebnisse zeigen, dass BaF3-BCR/ABL einen Wachstumsvorteil im Minimalmedium hat, welcher im Standardmedium nicht vorliegt. Während die bereits bekannte Verstärkung der Glukoseaufnahme durch BCR/ABL im Standardmedium bestätigt wurde, konnte im Minimal-medium Gegenteiliges gezeigt werden. Zudem wurde ein Unterschied im Aminosäurestoff-wechsel zwischen BaF3 + IL-3 und BaF3-BCR/ABL + IL-3 im Minimalmedium deutlich. Die therapeutische Relevanz des gezeigten Einflusses der Nährstoffrestriktion konnte anschlie-ßend in der Tyrosinkinaseinhibitortitration dargestellt werden, da die Medikamente in Abhän-gigkeit vom Medium unterschiedliche Wirkungen zeigen. Insgesamt bieten die Ergebnisse einen metabolischen Erklärungsansatz für das Überleben von Tumorstammzellen in nährstoffarmen Arealen des Knochenmarks unter Therapie und Raum für neue Therapieansätze.

Entwicklung der Vaskularisierung und des Fasergehaltes im Knochenmark von CML-Patienten während der Behandlung mit Imatinib Gesteigerte Gefäßneubildung und retikuläre Fibrose sind zwei morphologische Veränderungen im Knochenmark von CML-Patienten, welche mit einem schlechteren Krankheitsverlauf assoziiert sind. Imatinib, ein selektiver Tyrosinkinaseinhibitor, hemmt die angiogenen und fibrogenen Substanzen VEGF und PDGF. Diese Dissertation untersuchte den Einfluss von Imatinib auf die Vaskularisierung und den retikulären Fasergehalt im Knochenmark von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML). Es wurden 67 repräsentative Knochenmarkbiopsien von insgesamt 19 Patienten, behandelt in Multicenter-Studien an der Universitätsklinik Leipzig, eingeschlossen. Davon waren zehn Patienten bereits mit IFN-α + Cytarabin vorbehandelt worden. Neun Patienten mit neudiagnostizierter CML erhielten Imatinib als Ersttherapie. Knochenmarkbiopsien zu den Zeitpunkten t0 (vor Therapiebeginn), t1 (6-15 Monate) und t2 (21-36 Monate) nach Behandlungsstart mit Imatinib wurden untersucht. Weiter wurde eine Kontrollgruppe aus 19 KM-Biopsien gebildet, welche ohne pathologischen Befund waren. Während der Behandlung mit Imatinib kam es bei der Mehrzahl der Patienten zu einer Normalisierung der Gefäßdichte im Knochenmark. Der Fasergehalt im Knochenmark der CML-Patienten sank bei allen Patienten auf Normwerte ab. Dies zeigt den positiven Einfluss von Imatinib auf die morphologischen Veränderungen Vaskularisierung und Faserdichte im Knochenmark von CML-Patienten. Ein Einfluss der Vorbehandlung mit IFN-α + Cytarabin auf die Dynamik der morphologischen Parameter während der Behandlung mit Imatinib war nicht nachweisbar.

Retrospektive Untersuchung des gemischten Chimerismus der Megakaryopoese im Rahmen der chronisch myeloischen Leukämie vor und nach allogener gegengeschlechtlicher Knochenmarktransplantation

Item response theory models (IRT) are increasingly becoming established in social science research, particularly in the analysis of performance or attitudinal data in psychology, education, medicine, marketing and other fields where testing is relevant. We propose the R package eRm (extended Rasch modeling) for computing Rasch models and several extensions. A main characteristic of some IRT models, the Rasch model being the most prominent, concerns the separation of two kinds of parameters, one that describes qualities of the subject under investigation, and the other relates to qualities of the situation under which the response of a subject is observed. Using conditional maximum likelihood (CML) estimation both types of parameters may be estimated independently from each other. IRT models are well suited to cope with dichotomous and polytomous responses, where the response categories may be unordered as well as ordered. The incorporation of linear structures allows for modeling the effects of covariates and enables the analysis of repeated categorical measurements. The eRm package fits the following models: the Rasch model, the rating scale model (RSM), and the partial credit model (PCM) as well as linear reparameterizations through covariate structures like the linear logistic test model (LLTM), the linear rating scale model (LRSM), and the linear partial credit model (LPCM). We use an unitary, efficient CML approach to estimate the item parameters and their standard errors. Graphical and numeric tools for assessing goodness-of-fit are provided. (authors' abstract)

Item response theory models (IRT) are increasingly becoming established in social science research, particularly in the analysis of performance or attitudinal data in psychology, education, medicine, marketing and other fields where testing is relevant. We propose the R package eRm (extended Rasch modeling) for computing Rasch models and several extensions. A main characteristic of some IRT models, the Rasch model being the most prominent, concerns the separation of two kinds of parameters, one that describes qualities of the subject under investigation, and the other relates to qualities of the situation under which the response of a subject is observed. Using conditional maximum likelihood (CML) estimation both types of parameters may be estimated independently from each other. IRT models are well suited to cope with dichotomous and polytomous responses, where the response categories may be unordered as well as ordered. The incorporation of linear structures allows for modeling the effects of covariates and enables the analysis of repeated categorical measurements. The eRm package fits the following models: the Rasch model, the rating scale model (RSM), and the partial credit model (PCM) as well as linear reparameterizations through covariate structures like the linear logistic test model (LLTM), the linear rating scale model (LRSM), and the linear partial credit model (LPCM). We use an unitary, efficient CML approach to estimate the item parameters and their standard errors. Graphical and numeric tools for assessing goodness-of-fit are provided. (author's abstract) / Series: Research Report Series / Department of Statistics and Mathematics

<div>Cancer treatment was revolutionized when imatinib, a protein kinase inhibitor, was approved for the treatment of chronic myeloid leukemia (CML) in 2001. Imatinib increased the five-year survival rate of CML to over 90%. Imatinib is successful because it can selectively target BCR-ABL1, the mutant kinase driver to CML. Since then, there have been over 50 small molecules approved by the FDA to treat various cancers, which are driven by aberrantly expressed or mutated protein kinases. These kinase inhibitors (KIs) target kinases such as KIT (to treat gastrointestinal stromal tumors), EGFR (to treat lung cancer), and MEK (to treat melanoma) and often inhibit the kinases by binding to the ATP binding site or an allosteric site. Despite the successes seen with these approved KIs, responses are often transient. Most patients relapse after only a few months of responding to first and second generation KIs due to mutations to the kinases and/or upregulation of compensatory pathways. For cancer-driver kinases such as BCR-ABL1 or FLT3-ITD, which are oncogenic due to a fusion protein (BCR fused to ABL1) or internal tandem duplication within the juxtamembrane domain (FLT3), relapse can also occur due to the emergence of additional mutations in the kinase domain (a phenomenon termed secondary mutation). For example, secondary mutation (T315I or E255K) in BCR-ABL1 leads to imatinib resistance whereas secondary mutation (F691L or D835Y/V/H) in FLT3-ITD leads to resistance to many first- and second-generation FLT3 inhibitors. Gilteritinib, a recently approved FLT3 inhibitor drug for acute myeloid leukemia (AML) is not effective against AML harboring FLT3-ITD (F691L). Thus, there is a clinical need for novel chemotypes that inhibit drug-resistant kinases, especially those containing secondary mutations.</div><div>Many of the FDA-approved kinase inhibitors contain common heterocycles such as quinolines, indazoles, quinazolines, quinazolinones, quinoxalines, and oxindole. The majority of KIs also contain groups that enhance aqueous solubility, such as morpholine and piperazine rings. Additionally, many KIs contain halogen substituents (mainly Cl and F). This thesis introduces novel kinase inhibitors, which contain the less explored isoquinolines, naphthyridines, and pyrido[3,4-b]pyrazine cores. These newly introduced kinase inhibitors potently inhibit drug-resistant ABL1 and FLT3 kinases, harboring secondary mutations, and have the potential for clinical translation against relapsed leukemia.</div>

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HINTERGRUND: Der selektive Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib inhibiert das Wachstum von bcr/abl positiven Zellen und stellt somit eine neue Therapieoption in der Behandlung der CML dar. Mittlerweile sind verschiedene Mutationen innerhalb der abl Sequenz beschrieben worden, die eine adäquate Imatinibbindung verhindern und zu einer zellulären Resistenz der CML Zellen führen. METHODE: Wir untersuchten 69 Patienten unter Behandlung mit Imatinib im Rahmen von laufenden klinischen Studien. Bei Studieneinschluss waren 37 Patienten in chronischer Phase, 21 Patienten in akzelerierter Phase und 11 Patienten in Blastenkrise. Mittels Real-time PCR wurden bcr/abl, WT1, MDR1 und AGP RNA Traskripte aus peripheren Leukozyten quantifiziert. AGP Proteinlevel wurden turbidimetrisch bestimmt. Ausserdem entwickelten wir eine neue, hochsensitive Technik zur Detektion bekannter Mutationen innerhalb der bcr/abl Domäne, indem wir das DNA-Clamping mittels Peptidnukleinsäure (PNA) mit einem Hybridisationssonden-Assay kombinierten. ERGEBNISSE: 1. Unsere Resultate bestätigen die hämatologische Effizienz von Imatinib in Übereinstimmung mit bereits publizierten Daten. 2. Eine komplette molekulare Remission konnte bei einem Patienten erzielt werden. 3. Wir konnten die bcr/abl Mutationen Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His mit hoher Sensivität nachweisen. In einem Falle konnte die Gly255Lys Mutation vor der Behandlung detektiert werden. SCHLUSSFOLGERUNG: Bcr/abl und WT1 mRNA stellen in der Behandlung der CML Verlaufs- und Prognosemarker dar. Ein Zusammenhang zwischen MDR1 mRNA bzw. AGP mRNA und einer Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib konnte nicht bestätigt werden. Durch den PNA-Clamping Assay konnten präexistente und sich entwickelnde bcr/abl Mutationen mit ungünstiger Prognose sicher und frühzeitig detektiert werden. Diese Tatsache ermöglicht eventuell eine Risikostratifizierung der CML und könnte als Model zum individuellen molekularen Monitoring und zur therapeutischen Strategie in anderen malignen Erkrankungen dienen. / BACKROUND: The selective tyrosine kinase inhibitor imatinib inhibits growth of bcr/abl positive cells and, thus, has become a novel therapeutic option for the treatment of Ph+ leukaemic patients. Various mutations within the abl sequence have been described that prevent adequate imatinib binding to bcr/abl resulting in cellular resistance of CML cells. METHODS: We investigated 69 CML patients under treatment with imatinib as part of an ongoing clinical trial. At recruitment 37 patients were in chronic phase, 21 patients in accelerated phase and 11 patients in blast crisis. Bcr/abl, WT1, MDR1and AGP RNA transcripts were quantified in peripheral leucocytes by real time PCR. AGP protein levels in plasma were measured by turbidimetric analysis. By combining peptide nucleic acid (PNA) based DNA clamping with a fluorescence hybridisation probe assay we developed a new and highly sensitive technique for the detection of known mutations within the bcr/abl kinase domain. RESULTS: 1. Our results demonstrate efficacy of imatinib on the haematological level in accordance with previously published data. 2. Complete molecular remission could be achieved in one patient. 3. We could effectively enhance the detection sensitivity (0,2%) for the BCR/ABL mutations Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His. In one case the Gly255Lys mutation was detectable before treatment. CONCLUSION: Bcr/abl and WT1 mRNA are predictive marker in the treatment of CML. Our investigation could not confirm any relation between MDR1 mRNA nor AGP mRNA and a resistance to imatinib. By the PNA clamping assay pre-existing and evolving bcr/abl mutations associated with an unfavorable prognosis could be safely detected. This may facilitate risk stratification in CML and may serve as a model for individualized molecular monitoring and therapeutic strategies in other malignant diseases.

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. / Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.