Este presente trabalho teve como objetivo a investigação do desempenho de um biopolímero experimental à base de cálcio, desenvolvido e fornecido por uma empresa americana, na coagulação, floculação e sedimentação da vinhaça bruta como tratamento físico-químico na remoção de carga orgânica e na concentração de compostos fertilizantes no lodo. O estudo do tratamento da vinhaça por meio da aplicação deste biopolímero possibilitaria, hipoteticamente, uma redução significativa da carga orgânica como tratamento inicial da vinhaça, além de concentrar os nutrientes presentes na vinhaça no lodo gerado para uso fertilizante. Foram realizados ensaios com coagulantes convencionais (sulfato ferroso, cloreto férrico e óxido de cálcio) para efeito de comparação entre estes e o biopolímero. Os ensaios de coagulação, floculação e sedimentação foram realizados em escala de laboratório com uso do equipamento Jar Test. Os ensaios foram divididos em três etapas. Na primeira etapa foram realizados ensaios aplicando-se determinadas dosagens de biopolímero e variando-se os tempos de coagulação, velocidades de rotação, além de realizar ou não a mistura lenta após a etapa de coagulação, a fim de verificar se estes parâmetros poderiam otimizar o processo de tratamento com o aplicação do biopolímero. Para segunda etapa do procedimento experimental foram realizados ensaios com os outros coagulantes: óxido de cálcio, sulfato férrico e cloreto férrico. Os ensaios com o cloreto férrico e o sulfato férrico foram realizados nas seguintes condições: velocidade de mistura rápida de 200 rpm por um período de tempo de 30 segundos e velocidade de mistura lenta de 80 rpm por um período de 20 minutos. Já os ensaios com óxido de cálcio foram realizados com apenas velocidade de mistura rápida de 200 rpm variando os períodos de tempo em 1, 5 e 10 minutos. O tempo de sedimentação para separação dos flocos formados foi de 2 horas para todas as etapas. O tratamento com biopolímero experimental apresentou resultados de remoção de matéria orgânica abaixo dos valores esperados, que era na faixa de 60% a 80%. Os resultados limitaram-se a valores de 10% a 35% de remoção de DQO. Porém, a remoção de turbidez atingiu valores elevados, próximos a 90%. Para os compostos relacionados à fertilização NPK (nitrogênio, fósforo e potássio), o tratamento com biopolímero experimental obteve as melhores eficiências de remoção de fósforo (48,3%) e de NTK (17,2%) em relação aos demais coagulantes, porém não apresentou remoção de potássio. Não houve diferença significativa na eficiência de remoção de DQO quando se alteram as condições operacionais de velocidade de agitação. Já o aumento no tempo de agitação diminui a eficiência de remoção de DQO. / This work aimed to investigate the performance of an experimental biopolymer calcium-based, developed and supplied by an American company, on gross vinasse coagulation, flocculation and sedimentation as a physical chemical treatment on organic load removal and on fertilizer compounds concentration in sludge. The study of the vinasse treatment through the application of this biopolymer would allow, hypothetically a significant reduction of the organic load as vinasse initial treatment, besides concentrating the vinasse found nutrients in the sludge created for fertilizer use. Assays were performed with conventional coagulants (ferrous sulfate, ferric chloride and calcium oxide) for comparison between them and the biopolymer. Tests of coagulation, flocculation and sedimentation were carried out in laboratory scale using Jar Test equipment. The experiments were divided in three stages. In the first stage assays were performed applying certain dosages of biopolymer and varying the clotting time, rotational speeds in addition to performing or not performing the slow mixture after the clotting stage in order to check if these parameters could optimize the treatment process with the biopolymer application. For the second stage of the experimental procedure tests were developed with other coagulants: calcium oxide, ferric sulphate and ferric chloride. Tests with ferric chloride and ferric sulphate were performed under the following conditions: fast mixing speed of 200 rpm for a period of 30 seconds and slow mixing speed of 80 rpm for a period of 20 minutes. Considering the assays with calcium oxide, they were carried out using only rapid mixing speed of 200 rpm by varying the time periods at 1, 5 and 10 minutes. The sedimentation time to the formed flakes separation was two hours for all stages. Treatment with experimental biopolymer presented results of removal of organic matter below the expected values, which was in the range 60% to80%. The results limited to values of 10% to 35% of COD clearance. However, the removal of turbidity reached high values near 90%. For compounds related to NPK (nitrogen, phosphorus and potassium) fertilization, the treatment with experimental biopolymer obtained the best efficiency of phosphorus removal (48,3) and TKN removal (17.2%) in comparison with the other coagulants, but showed no removal of potassium. There was no significant difference in COD removal efficiency when the operating conditions of agitation speed are changed. Regarding to the increase in the agitation time, it reduces the efficiency of COD removal.

O objetivo principal desta pesquisa foi comparar o desempenho de dois reatores anaeróbios híbridos de biomassa imobilizada (RAHBI), em escala de laboratório, no processamento da vinhaça de cana-de-açúcar. Um (reator 1) recebendo vinhaça sem tratamento prévio e outro (reator 2) processando vinhaça previamente submetida à coagulação, utilizando-se de um biopolímero experimental a base de cálcio. Os reatores foram construídos em acrílico, com volume de 1,5 litros cada, provido de sistema de recirculação com razão igual a 3. A operação dos reatores foi dividida em duas etapas: a primeira, com duração de 69 dias, teve seu fim caracterizado por um colapso apresentado pelo reator 2. A segunda fase, com duração de 37 dias, onde se observou outro colapso. O principal parâmetro de controle no monitoramento dos reatores foi a quantificação de matéria orgânica, em termos de Demanda Química de Oxigênio (DQO). Durante a Fase I, o reator 1 apresentou eficiência de remoção média de 82,9 ± 4,4% , e o reator 2 de 72,2 ± 18,1%. A carga orgânica volumétrica (COV) média aplicada para o reator 1, durante esta fase, foi de 5,3 ± 1,3 kg DQO/\'M POT.3\'d, e para o reator 2 foi de 5,3 ± 1,6 kg DQO/\'M POT.3\'d. O colapso ocorrido no reator 2 foi evidenciada pelo decréscimo acentuado da eficiência de remoção, chegando a 33,7%. Durante a Fase II, o reator 1 apresentou eficiência de remoção média de 77,5 ± 9,4% , e o reator 2 de 79,2 ± 9,7%. A carga orgânica volumétrica (COV) média aplicada para o reator 1, durante esta fase, foi de 5,1 ± 2,4 kg DQO/\'M POT.3\'d, e para o reator 2 foi de 5,0 ± 2,3 kg DQO/\'M POT.3\'. Ao final desta fase o reator 1 apresentou eficiência de remoção de 80,9%, e o reator 2 65.8%. Foram analisados, também, alcalinidade e produção de metano (\'CH IND.4\'). Durante todas as fases, a alcalinidade dos dois reatores esteve acima de 1000 mg \'CA\'CO IND.3\'/l, indicando estabilidade, em relação a este parâmetro, dos reatores. A produção de \'CH IND.4\' do reator 1 foi de 0,0507 ± 0,0232 l \'CH IND.4\'/h e 0,0838 ± 0,0326 l \'CH IND.4\'/h nas fases I e II, respectivamente. Para o reator 2, esta produção foi de 0,0307 ± 0,0137 l \'CH IND.4\'/h e 0,0800 ± 0,0297 l \'CH IND.4\'/h, para as fases I e II, respectivamente. Foram feitos ensaios de resistência mecânica dos grânulos, análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV), Espectrometria de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS) e análise da comunidade microbiana, empregando técnicas de biologia molecular. Os testes de resistência mecânica dos grânulos indicam que os grânulos contidos no inóculo, reatores 1 e 2 possuem resistência à desintegração. As análises de MEV e EDS indicam a presença do elemento cálcio com aproximadamente 22% para o inóculo, 39% para o reator 1 e 50% para o reator 2, na massa dos elementos analisados das amostras de grânulos. As análises de biologia molecular indicaram similaridades entre os reatores 1 e 2 de 66,5 e 58%, para os domínios Bacteria e Archea, respectivamente. Desta forma, supõe-se que esta diferença da biota entre os reatores não estaria contribuindo para a falha conferida no reator 2. / This research aimed at compare the performance of two hybrid anaerobic immobilized biomass (HAIB), in laboratory scale, processing vinasse from sugar cane alcohol destilery. Reactor 1 received vinasse without pre-treatment. Reactor 2 processed coagulated vinasse using a calcium-based biopolymer as coagulant. The two reactors were built in acrylic, with a volume of 1,5 liters each. The recirculation flow rate was 3. The operation of the reactors was divided in two phases: first, lasting 69 days, came to an end characterized by a failure (collapse) presented by the reactor 2. The second phase, lasting 37 days, came to an end characterized by another collapse. The main control parameter in the monitoring of the reactors was the quantification of organic matter in terms of COD. During Phase I, the reactor 1 showed average removal efficiency of 82,9 ± 4,4%, and the reactor 2 72,2 ± 18,1%. The organic loading rate (VOC) average applied to reactor 1, during this phase, was 5,3 ± 1,3 kg DQO/\'M POT.3\'d, and 5,3 ± 1,6 kg DQO/\'M POT.3\'d for the reactor 2. The failure occurred in the reactor 2 was evidenced by the sharp decrease of removal efficiency, reaching 33.7%. During Phase II, the reactor 1 showed average removal efficiency of 77,5 ± 9,4%, and the reactor 2 79,2 ± 9,7%. The average VOC applied to reactor 1, during this phase, was 5,1 ± 2,4 kg DQO/\'M POT.3\'d, and 5,0 ± 2,3 kg DQO/\'M POT.3\'d for reactor 2. At the end of this phase, the reactor 1 showed a removal efficiency of 80.9%, and the reactor 2 65.8%. Has also been analyzed, alkalinity and methane (\'CH IND.4\'). During all the phases, the alkalinity of both reactors was above 1000 mg \'CA\'CO IND.3\'/l, indicating stability in the reactors. The production of \'CH IND.4\' was 0.0507 ± 0.0232 l \'CH IND.4\'/h and 0.0326 ± 0.0838 l \'CH IND.4\'/h in phases I and II, respectively. For the reactor 2, the production of \'CH IND.4\' was 0,0307 ± 0,0137 l \'CH IND.4\'/h e 0,0800 ± 0,0297 l \'CH IND.4\'/h for the phases I and II, respectively. Assays were performed in mechanical granules strength, analysis of scanning electron microscopy (SEM), Energy Dispersive Spectroscopy X-ray (EDS) and analysis of the microbial community, using molecular biology techniques. The tests of mechanical of granules strength indicate that the granules contained in the inoculum, reactors 1 and 2 are resistant to disintegration. The SEM and EDS analysis indicated the presence of calcium element with approximately 22% inoculum, 39% for reactor 1 and 50% for reactor 2, in the mass of the elements analyzed samples of granules. The microbial community analyzes indicated molecular similarity between the first and second reactor of 66.5 and 58% for Bacteria and Archea domain, respectively. Thus, it is assumed that the difference between the biota of the reactors would not be contributing to the failure given in the reactor 2.

A proposta deste trabalho foi utilizar quatro diferentes coagulantes - sulfato de alumínio, cloreto férrico, hidroxicloreto de aluminio e sulfato ferrico; construir os diagramas de coagulação; e assimilar as regiões de maior ou menor eficiência da remoção de turbidez ou da cor. Para permitir uma avaliação de custos na utilização dos coagulantes, observo-se nos diagramas as regiões onde os valores de turbidez remanescente são aproximadamente iguais para diferentes coagulantes. Com essa consideração, foi stabelecida a relação entre consumo e custo dos produtos quimícos utilizados. Os coagulantes que apresentaram particularidades para as águas estudadas foram: o cloreto ferrico que mostrou melhor desempenho para valores de ph baixos; o sulfato ferrico que mostrou-se mais economico; e o hidroxicloreto de aluminio que atua numa grande faixa de ph. Na conclusão dos estudos, verifica-se que cada água a ser tratada deve ser analisada através de diagramas de coagulação, visando a otimização dos parâmetros de ph versus dosagem e buscando o melhor coagulante pelo menor custo. / The purpose of this study was to use four different coagulants - aluminum sulphate, iron chloride, polyaluminum hidroxichloride and ferric sulphate; to build the coagulation diagrams; and to mark the regions of higher or lower efficiency in the removal of turbidity or color. To allow a cost appraisal in the use of the coagulants, the region where the values of remaining turbidity, which are approximately the same for different coagulants, was examined in the diagrams. This being taken into consideration, the relation between consumption and cost of the chemical products was established. The coagulants that presented certain peculiarities for the studied waters were: iron chloride, that showed better performance for low pH values; the ferric sulphate, that showed itself as more economical; and the polyaluminum hidroxichloride, that functions in a large interval of pH. In the conclusion of the study, it was observed that each type of water to be treated must be analyzed through coagulation diagrams, aiming at the optimization of pH parameters versus dosages and looking for the best coagulant with lower cost.

Orientadores: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi, Rodrigo Nogueira Angerami / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T02:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orsi_FernandaLoureirodeAndrade_D.pdf: 6021232 bytes, checksum: e409b42632a9af01efbd442e6f2db91f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os casos de dengue são classificados em dengue clássica (DC) e febre hemorrágica da dengue (FHD). Embora a DC seja considerada uma manifestação não grave da dengue, algumas complicações clínicas podem ser encontradas neste grupo, em particular as complicações hemorrágicas. Entretanto, as causas de sangramentos na DC não estão esclarecidas. Desta forma, o objetivo deste estudo foi realizar uma avaliação abrangente dos possíveis mecanismos fisiopatológicos que podem contribuir para a tendência hemorrágica da dengue. Este é um estudo de caso-controle que incluiu adultos com dengue durante o período de defervescência da doença e controles saudáveis. Foram avaliadas as células do sangue periférico, os marcadores da resposta inflamatória, da permeabilidade microvascular, da ativação de células endoteliais e da fibrinólise e a geração de trombina nos pacientes e controles. Foram incluídos 26 adultos com DC e sangramento, 33 adultos com DC sem complicações, 8 adultos com FHD e 67 controles saudáveis. A gravidade e extensão dos sangramentos foram semelhantes entre os pacientes classificados como DC e os classificados como FHD. Pacientes com DC com sangramento e FHD tinham menor contagem de plaquetas em comparação aos com DC sem sangramento. Fator de necrose tumoral (TNF-?), trombomodulina (TM) e fator de von Willebrand (FVW) estavam aumentados nos grupos de dengue em relação aos controles. A atividade e antígeno da ADAMTS 13 estavam diminuídos, em particular nos pacientes com DC não complicada. Houve tendência ao aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF-A) apenas nos pacientes com FHD, mas a diferença não foi estatisticamente significativa. Houve, porém, alterações significativas dos receptores solúveis do VEGF-A (sVEGF-R1 e sVEG-R2). Os níveis plasmáticos do sVEGF-R1 estavam aumentados e de sVEGF-R2 estavam diminuídos nos pacientes, principalmente nos com FHD. A relação VEGF-A/VEGF-R2 estava significativamente elevada nos casos de FHD em relação aos controles e aos outros grupos de dengue. Os níveis plasmáticos do ativador tecidual do plasminogênio (tPA) e dímero-D (DD) estavam significativamente elevados em pacientes com DC e sangramento e nos com FHD; sendo que os níveis séricos de PAI-1 não diferiram entre os grupos. Os pacientes com DC com sangramento e FHD apresentaram também menor geração de trombina. Estes resultados permitem concluir que a DC pode manifestar-se com hemorragias espontâneas associadas a diversos distúrbios da hemostasia, na ausência de sinais clínicos ou laboratoriais de aumento da permeabilidade vascular. Os principais distúrbios da hemostasia encontrados foram trombocitopenia, hiperfibrinólise e hipocoagulabilidade. Desta forma, a DC compreende um grupo heterogêneo de doentes que podem apresentar uma coagulopatia complexa e potencialmente grave / Abstract: Dengue has been classified according to disease severity into dengue fever (DF) and dengue hemorrhagic fever (DHF). Although DF is considered a non-severe manifestation of dengue, it represents a heterogeneous group of patients with varied clinical complications, particularly, bleeding complications. However, the causes of bleedings in DF have not been fully addressed. Thus, the aim of this study was to perform a comprehensive evaluation of possible pathophysiological mechanisms that could contribute to the bleeding tendency in DF and DHF. This is a case-control study that enrolled adults with DF without bleeding, DF and bleeding complications and DHF during the defervescence period. Healthy controls were also included. Peripheral blood counts, inflammatory, microvascular permeability, fibrinolysis, endothelial cell activation markers, and thrombin generation were evaluated in patients and controls. We included 26 adults with DF and bleeding, 33 adults with DF without complications, 8 adults with DHF and 67 healthy controls. The severities of the bleeding episodes were similar between patients with DC and DHF. Patients with DF with bleedings and DHF had lower platelet counts than DF without bleeding. Levels of the tumoral necrosis factor (TNF)-?, thrombomodulin (TM) and von Willebrand factor (VWF) were significantly increased in dengue groups than in healthy controls, but similar among patients. Plasma levels of the soluble receptor 1 of the vascular endothelial growth factor (sVEGR-R1) were increased and plasma levels of sVEGF-R2 were decreased in patients with DF and bleedings and in patients with DHF. In DHF patients presented a non-significant increased in vascular endothelial growth factor (VEGF-A) serum levels and a significantly higher VEGF/sVEGF-R2 ratio. Plasma levels of tissue plasminogen activator (tPA) and D-dimer (DD) were significantly increased in patients with bleedings, regardless of the dengue classification, while PAI-1 was similar between groups. Patients with DHF and DF with bleeding complications had reduced thrombin formation. In conclusion, DF can manifest with spontaneous bleedings without clinical and laboratory signs of increased vascular permeability. Spontaneous bleeding was associated with thrombocytopenia, excessive fibrinolysis and reduced thrombin in both DF with bleeding and DHF groups. These coagulopaties were not significantly present in DF without bleeding. DF is a heterogeneous group of patients that may present with a complex and potentially severe coagulation disorders / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientador: José Euclides Stipp Paterniani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:54:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_GabrielaKurokawae_M.pdf: 4064663 bytes, checksum: efbd782b012dc54eda697fca32638d9f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O acesso à água com padrões de qualidade adequados ao consumo humano tem sido tema de muitos estudos que visam desenvolver novas tecnologias ou aprimorar tecnologias já existentes para possibilitar o uso dessa água para abastecimento público. Como muitas tecnologias dependem de elevados investimentos e mão-de-obra qualificada, uma alternativa mais acessível para população de pequenas comunidades ou com menor poder aquisitivo é a utilização de coagulantes naturais. Um deles é o coagulante à base de sementes de Moringa oleifera. Alguns pesquisadores verificaram que a proteína presente nas sementes é responsável pelo processo de coagulação e que o material excedente das mesmas pode comprometer o tratamento de água. O presente trabalho visou desenvolver nova tecnologia de aplicação desse coagulante. Foi desenvolvido um sachê contendo o pó das sementes de Moringa oleifera que libera a proteína responsável pelo efeito coagulante das sementes. Após a determinação do material para confecção dos sachês, foram testadas 3 massas de pó adicionadas ao interior dos sachês (0,6 g, 0,8 g e 1,0 g) em ensaios para clarificação de água com turbidez sintética, sendo feita a comparação do desempenho dos sachês com o coagulante líquido. Utilizando-se equipamento Jar-Test, os ensaios consistiram na dissolução da proteína dos sachês na água com turbidez sintética, incluindo as operações unitárias de coagulação e floculação em alguns ensaios e em outros não e, por fim, foi feita a sedimentação por 60 minutos. Nos ensaios de clarificação com coagulação e floculação, as dosagens de 0,8 g e 1,0 g obtiveram eficiências de clarificação bastante próximas do coagulante líquido. Nos ensaios com coagulação e floculação, observou-se eficiência de redução de turbidez dos sachês variando de 85,5% a 97,4%, respectivamente para 0,6 g e 1,0 g, sendo que o coagulante líquido apresentou eficiência de 97,9%. Já quando não houve a realização dessas etapas, 50,6%, 89,92% e 94,8%, respectivamente. Com relação à cor aparente, essas eficiências foram 88,7%, 97,8% e 99,0% quando houve coagulação e floculação e 56,1%. 91,3% e 96,3% quando não houve. Concluiu-se que quando houve a realização da coagulação e sedimentação as amostras ficaram mais homogêneas, além de resultarem maiores valores de eficiência de redução de turbidez e cor aparente. Assim, conclui-se que a utilização dos sachês é um processo eficiente quando comparado com a aplicação do coagulante de Moringa oleifera na forma de solução / Abstract: The access to water with good quality to human consumption has been the subject of many studies which the main goal is the development of new technologies or the improvement of the existing structures used to provide water to public supply. As many technologies depends on high investments and qualified labor, the most accessible alternative to small communities or people with less purchasing is to use natural coagulants. One of them is the seed-based coagulant of Moringa oleifera. Some researches find that the protein on the seeds is the responsible by the coagulation and that the surplus material of them may compromise the water treatment. This objective of this paperwork presents a new technology of application of this coagulant. It was developed a sachet with Moringa oleifera powder seeds that releases the protein responsible for the coagulant effects of seeds. After determining the material to manufacture the sachets, 3 different levels of powder in the sachets (0,6 g, 0,8 g and 1,0 g) were tested for water clarification with synthetic turbidity, subsequently the comparison of the performance of the sachets with the liquid coagulant. Using an equipment Jar-Test, the tests consisted in the dissolution of the protein of the sachets on water with synthetic turbidity, including the unit operations of coagulation and flocculation on some tests and not in the others, finally it was made the sedimentation for 60 minutes. In the tests of clarification with the coagulation and flocculation steps, the dosages 0,8 g and 1,0 g obtained efficient results in clarification similar with the liquid coagulant. In the tests with coagulation and flocculation, we can see the efficiency of turbidity reduction of the sachets ranging from 85,5% to 97,4%, respectively to 0,6 g to 1,0 g, and considering that the liquid coagulant showed 97,9% of efficient. About the apparent color, this efficiencies were 88,7%, 97,8% and 90,0% when there was coagulation and flocculation, and 56,1%, 91,3% and 96,3% when there wasn't. The final results found show us that when the coagulation and flocculation were used, the samples were more homogenous and presented improved values of efficiency of turbidity and apparent color reduction. Thus, it was concluded that the use of sachets is a process efficient compared with the application of Moringa oleifera coagulant as a solution / Mestrado / Saneamento e Ambiente / Mestre em Engenharia Civil

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação ( mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T23:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Minaya_MagalyAlejandraBrousett_M.pdf: 1843449 bytes, checksum: 708051f59ddc90ca5b185a088f8d589d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os venenos de serpentes contêm uma variedade de proteínas que são estudadas no mundo pela importância biológica e farmacológica. Dentro de sua complexa composição, o veneno apresenta enzimas proteases, como as metaloproteases e serinoproteases que estão envolvidas em distúrbios hemostáticos e coagulantes, interferindo na agregação plaquetária. O presente trabalho teve como objetivo purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar as atividades farmacológicas de uma serinoprotease com atividade coagulante, do veneno de Bothrops barnetti nomeada TLBbar. A purificação envolveu dois passos cromatográficos, exclusão molecular em Sephadex G-75 e HPLC de fase reversa em coluna analítica Supelco C8, obtendo-se um alto grau de pureza e homogeneidade, revelado com SDSPAGE e com Mr ~ 28,5 kDa. TLBbar mostrou homlogia sequêncial com outras serinoproteases de veneno de serpentes, evidenciado através de espectrometria de massas MS/MS, como a trombina-like denominada Calobin, isolada e caracterizada a partir de Agkistrodon caliginosus (Korean Viper), Crotalase (Crotalus adamanteus), flavoxobin (Trimeresurus flavoviridis) entre outras. Observa-se na homologia que as serinoproteases, com as quais foi comparada a TLBbar, apresentam os aminoácidos conservados do sítio catalítico (His57, Asp102, Ser195), já na sequencia da TLBbar demonstra-se a presença do aminoácido histidina na posição 57 da tríada catalítica. Este resultado em conjunto com as atividades enzimáticas e biológicas, confirmam que TLBbar pertence ao grupo de enzimas serinoproteases com atividade trombina-like. A enzima apresenta sua maior atividade proteolítica a 37oC e em pH 8, sendo essa alterada na presença de íons divalentes por interações eletrostáticas entre enzima e substrato. TLBbar apresenta um comportamento michaeliano segundo os estudos cinéticos realizados com o substrato BApNA, revelando um Vmax e Km de 0,42nmol/min e 0,433mM, respectivamente. Em presença de heparina mantem 80% de sua atividade, e apresenta relativa estabilidade frente a SBT-I e agentes quelantes como EDTA e EGTA. TLBbar tem atividade coagulante sobre fibrinogênio bovino (atividade fibrigenolítica), formando um coágulo semi-rígido, pois não ativa o fator XIII da cascata de coagulação como faz a trombina que resulta na formação de um coágulo consistente. Sua atividade fibrigenolítica foi evidenciada pela liberação dos fibrinopeptídios A, pela degradação da cadeia A? do fibrinogênio, a qual foi inibida por PMSF e Leupeptina, confirmando sua classificação no grupo das serinoproteases. A eficiência desta atividade fibrigenolítica foi observada entre 30 oC e 40oC durante 2 horas de incubação e alterada em presença de íons divalentes como cálcio, magnésio e bário, ressaltando a maior atividade fibrigenolítica com o cálcio. A enzima purificada TLBbar foi capaz de agregar plaquetas e em concentração de 2,5?g evidenciou comportamento semelhante à trombina. Interessante que TLBbar estimula a agregação plaquetária assim como também retarda dita atividade no tempo quando comparado com o controle (trombina). Este fato é devido a sua mudança de conformação estrutural que corresponde à ativação plaquetaria a qual ocorre com mais lentidão (nos primeiros minutos), em comparação a transformação causada pela trombina, tendo como conseqüência a liberação mais lenta de agentes como ADP e tromboxanos A2, necessários para alcançar a adesão plaquetária. A serinoprotease TLBbar não apresenta toxicidade, pois não possui atividades edematogênica, hemorrágica e miotóxica in vivo. Por outro lado, TLBbar evidencia capacidade de dissolver o coágulo de fibrina gerado pela trombina após 36 horas de incubação a 37oC, esta atividade foi inibida com PMSF nas mesmas condições, estes dados sugerem a presença de atividade fibrinolítica / Abstract: The snake venoms contain variety of proteins and are studied in the world for biological and pharmacological importance, within their complex composition of the venom protease enzymes present, as metalloproteases and serineproteases that cause hemostatic disorders, coagulantes and platelet aggregation. The present dissertation aimed to purify, biochemically characterize and evaluate the pharmacological activities of a serine protease with coagulant activity named TLBbar from Bothrops barnetti. Its purification involved two chromatographic steps, molecular exclusion in Sephadex G-75 and reversedphase HPLC with a Supelco C8 analytical column, obtaining high purity and homogeneity revealed by SDS-PAGE with Mr ~ 28.5 kDa. The enzyme has its highest proteolytic activity at 37 °C and at pH 8, which is altered in the presence of divalent ions by electrostatic interactions between enzyme and substrate. TLBbar presents a Michaelis-Menten behavior according the kinetic studies revealing a Km and Vmax of 0.433 mM and 0.42 nmol/min, respectively. TLBbar in the presence of heparin maintains its activity around 80%, although has relative stability compared with SBT-I and chelating agents such as EDTA and EGTA. TLBbar has coagulant activity on bovine fibrinogen, forming a clot semi-rigid, different the action of thrombin that results in the formation of a clot consistent. Its fibrigenolytic activity was evidenced by the release of fibrinopeptides A, by degradation of fibrinogen A? chain, which was inhibited by PMSF and Leupeptin, confirming its classification in the group of serineproteases. The efficiency of this activity was observed between 30 and 40 °C during 2 hours of incubation and changed in the presence of divalents ions such as calcium, magnesium and barium, brings out the greatest fibrigenolytic activity with calcium. The purified enzyme TLBbar was capable of aggregating platelets; 2.5?g of concentration evidence similar behavior to thrombin, TLBbar interesting stimulates platelet aggregation as well as delay time in such activity when compared with control (thrombin). We suggest that structural process of platelet activation occurs over a longer period of time with TLBbar as a result of release of ADP and thromboxane A2 agents that happen that occur with less speed to achieve platelet adhesion compared with thrombin. This enzyme not showed edematogenic-activity when compared with the activity caused by B. Barnetti snake venom, did not induce hemorrhagic nor myotoxic effect in vivo. On the other hand, TLBbar had proteolytic activity similar to thrombin, proven in the fibrigenolytic activity on bovine fibrinogen as measured in the release of fibrinopeptides in times of release similar to the control, the proteolytic activity was also evidenced by the ability to dissolve fibrin clot generated by Thrombin after 36 hours of incubation at 37 °C, the activity was inhibited with PMSF under the same conditions, these data suggest the presence of fibrinolytic activity / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Benito Pereira Damasceno, Valder Roberval Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T22:17:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Voetsch_Barbara_D.pdf: 55176396 bytes, checksum: f274efe61664e0541b7ed17b893440eb (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Introdução e Objetivo: A etiologia de acidentes vasculares cerebrais isquêmicos (AVCi) em pacientes jovens permanece desconhecida em um terço dos casos, justificando a procura por novos fatores de risco protrombóticos. Causas comuns de trombofilia hereditária incluem o fator V de Leiden, a mutação G20210A no gene da protrombina, e hiperhomocisteinemia moderada secundária à variante termolábil da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR-T). A atividade da paroxonase (PON1), uma esterase associada a lipoproteínas de alta densidade (HDL) com propriedades antioxidantes e antiaterogênicas, é determinada pelos polimorfismos Q192R e L55M da região codificadora e pelas substituições C(-107)T e G(-824)A no promotor do seu gene. A correlação destes fatores genéticos com o risco de AVCi é controversa. Além disso, foi recentemente descrita em crianças com AVCi uma deficiência hereditária de glutationa peroxidase plasmática (GPx-3), uma enzima com função de inativar espécies reativas de oxigênio que limitam a biodisponibilidade e os efeitos antiplaquetários do óxido nítrico. Porém, a base molecular dessa alteração ainda não foi identificada. Métodos: Analisamos e 118 a 167 pacientes jovens (< 45 anos) com AVCi não-fatal de etiologia indeterminada e um número equivalente de controles pareados por sexo e idade quanto à presença de fatores de risco protrombóticos. O fator V de Leiden, a variante da protrombina, homozigose para MTHFR-T, e as substituições Q192R, L55M e G(-824)A no gene da PON1 foram determinados através de PCR e digestão com enzimas de restrição. O polimorfismo PON1 C(-1O7)T foi detectado através de análise por single-strand conformational polymorphism (SSCP). Rastreamento do gene da GPx-3 foi realizado através de análise por SSCP, seguido de seqüenciamento de fragmentos com shift eletroforético. Resultados: A prevalência do genótipo 192RR da PON1 foi significativamente mais elevada em pacientes jovens com AVCi que controles (P=0.006), sendo o fator de risco que demonstrou a associação mais forte com AVCi de todos os fatores genéticos estudados (OR=4.1, 95% CI, 1.14 to 14.73). A presença isolada do alelo de baixa expressão -107T causou um aumento modesto no risco de AVCi, porém demonstrou ação sinergística com o genótipo 192RR, elevando a estimativa de risco de AVCi em portadores de ambas as variantes para 17 (95% CI, 1.74 to 166.35; P=0.015). Através de rastreamento do gene da GPx-3 por SSCP, identificamos quatro polimorfismos novos, ligados, no promotor do gene, associados ao risco de AVCi: A(-68)T, A(-622)T, T(-688)C e A(-703)C. Portadores do haplótipo combinando os nucleotídeos -622T, -688C e -703C foram significativamente mais prevalentes entre pacientes que controles (27.6% vs. 15.4%; P=0.020) e tiveram um risco de AVCi duas vezes maior quando comparado a não-portadores (OR=2.09, 95% CI, 1.12 to 3.92). O risco de AVCi associado ao genótipo PON1 192RR e aos polimorfismos do promotor da GPx-3 foi potenciado em indivíduos simultaneamente expostos a fatores de risco vasculares convencionais. Nenhuma diferença significativa na prevalência de fator V de Leiden, da variante da protrombina, ou homozigose para MTHFR-T foi encontrada entre pacientes e controles, com exceção de uma freqüência elevada de MTHFR-T em um grupo pequeno de indivíduos de origem negróide (OR=5.9, 95% CI, 0.88 to 49.2). Conclusões: Estes dados demonstram que variantes genéticas em enzimas antioxidantes predispõem ao desenvolvimento precoce de AVCi e sugerem um novo mecanismo para trombose arterial que envolve a biodisponibilidade diminuída de óxido nítrico. Além disso, a interação dos fatores genéticos com fatores de risco convencionais concordam com o conceito atual de que as doenças aterotrombóticas, incluindo AVCi em jovens, têm etiologia multifatorial / Abstract: Background and Purpose: The etiology of arterial ischemic stroke (AIS) in the young remains unknown in up to one-third of patients, warranting the search for novel prothrombotic risk factors. Common causes of inherited thrombophilia inc1ude factor V Leiden, the prothrombin G20210A mutation, and mild hyperhomocysteinemia due to the thermolabile variant ofmethylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR-T). Activity levels of paraoxonase (PON1), an antioxidant and antiatherogenic HDL-bound esterase, are determined by the Q192R and L55M coding region polymorphisms and the C(-107)T and G(-824)A substitutions in the gene promoter. The correlation of these genetic factors with the risk of AIS is controversial. In addition, a heritable deficiency of plasma glutathione peroxidase (GPx-3), a reactive oxygen species scavenger that protects the bioavailability and antiplatelet effects of nitric oxide (NO), was recently described in association with childhood stroke, yet a molecular basis for this defect has not been identified. Methods: We analyzed up to 167 young patients (< 45 years ofage) with non-fatal AIS of undetermined etiology and an equivalent number of age- and gender-matched controls for the presence of inherited prothrombotic risk factors. Factor V Leiden, the prothrombin variant, homozygosity for MTHFR-T, and the Q192R, L55M, and G(-824)A substitutions in the PON1 gene were determined by PCR amplification and restriction digestion. The PON1 C(-107)T polymorphism was detected by single-strand conformational polymorphism (SSCP) analysis. Screening ofthe GPx-3 gene for genetic abnormalities was performed by SSCP, followed by sequencing offtagments with electrophoretic shifts. Results: The prevalence of the PONl 192RR genotype was significantly higher among patients than controls (P=0.006),showing the strongest independent association with the risk of AIS among all the genetic risk factors studied (OR=4.1, 95% CI, 1.14 to 14.73). The presence of the low expressor PON1 -107T allele was only modest1yassociated with AIS when ana1yzed alone, yet further increased the risk conferred by the 192RR genotype, yielding an adjusted risk estimate of 17 in carriers ofboth variants (95% CI, 1.74 to 166.35; P=0.015). By SSCP screening of the GPx-3 gene we identified four novel linked polymorphisms in the promoter associated with the risk of AIS: A(-68)T, A(-622)T, T(-688)C, and A(-703)C. Carriers ofthe haplotype combining nucleotides -622T, -688C, and -703C were significantly more frequent among patients than controls (27.6% vs. 15.4%; P=0.020) and had twice the risk of AIS as compared to non-carriers (OR=2.09, 95% CI, 1.12 to 3.92). The risk associated with the PON1 192RR genotype and the GPx-3 promoter polymorphisms was potentiated in individuaIs simultaneously exposed to conventional vascular risk factors. No significant difference in the prevalence of factor V Leiden, the prothrombin variant, and homozygosity for MTHFR-T was found between patients and controls, with the exceptio~ of a higher frequency of MTHFR-T in a small group ofindividuals of African descent (OR=5.9, 95% CI, 0.88 to 49.2). Conclusions: These data indicate that genetic variants in antioxidant enzymes predispose to the early development of AIS and support a novel mechanism for arterial thrombosis that involves reduced bioavailablity ofNO. In addition, the interaction ofthese genetic markers with conventional vascular risk factors support the current concept that atherothrombotic disease is a complex trait and multifactorial in nature / Doutorado / Neurologia / Doutor em Ciências Médicas

Orientador : Ricardo de Lima Isaac / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Civil / Made available in DSpace on 2018-08-03T00:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeSalvo_MaraTeresa_M.pdf: 13281475 bytes, checksum: c09a73d45bd78fa391ab66e34ccbae5d (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Em 1974, pesquisadores holandeses e norte-americanos documentaram a formação de trihalometanos (THMs), após a cloração de águas de abastecimento, em presença de precursores orgânicos. Estudos realizados pela United States Environmental Protection Agency (USEP A) comprovaram o caráter mutagênico e carcinogênico dos THMs em animais de laboratório, suspeitando-se que o mesmo possa ocorrer com o Homem. O padrão de potabilidade vigente no Brasil estabelece o valor máximo permitido dos THMs em 100 µg/L. O Sistema Alto Cotia, por ser um manancial protegido e ter muita cobertura vegetal no em tomo, apresenta problemas na formação dos trihalometanos. As tecnologias alternativas para o controle dos THMs incluem a remoção dos precursores orgânicos por coagulação otimizada, com o uso de sulfato de alumínio e cloreto férrico como coagulantes. Nesta pesquisa, foram estudadas as regiões de adsorção necessária à filtração direta e de varredura usada para o tratamento convencional através de ensaios de coagulação, em aparelho de Jar Test, verificando-se a dosagem ótima dos coagulantes e o pH ótimo de coagulação. Os resultados indicaram que, no mecanismo de adsorção, obteve-se remoções de até 90% da cor, quando se usou sulfato de alumínio e até 100% da cor, quando se usou cloreto férrico. No mecanismo de varredura, obtiveram-se 100% de remoção da cor para ambos os coagulantes. Os parâmetros substitutos utilizados na determinação dos precursores (cor, UV-254, COD e AUVE) mostraram-se válidos para a água estudada, na qual predominam substâncias húmicas presentes na matéria orgânica natural (MON). Conclui-se que a Estação de Tratamento de Água do Alto Cotia, na RMSP, onde foi realizado o estudo, pode operar por filtração direta em determinados períodos do ano, como alternativa ao tratamento convencional / Abstract: By 1974, North American and Hollander researchers documented the trihalomethanes (THMs) formation, after the ch1orination of drinking water, with organic precursors being present. Studies conducted by the United States Environmental Protection Agency (USEP A) confirmed the mutagenic and carcinogenic character of THMs in laboratory animals, with the suspicion that the same would happen to humans. The potability standards in force in Brazil establish the maximum permitted value of THMs to be 100 µg/L. As a protected with much vegetal cover environmental, the Alto Cotia System presents problems in trihalomethanes formation Alternative technologies to control THMs include remotion of organic precursors by optimized coagulation, using aluminum sulphate and ferric ch1oride like coagulants. In this research regions of adsorption needed for direct filtration and sweeping used for conventional treatment by experiments of coagulation were studied, with Jar Test machine, verifying the optimum dosage of coagulants and the optimum coagulation pH. Results indicate that, in adsorption mechanism, remotions of up to 90% of color with the use of aluminum sulphate and until 100% of color with ferric ch1oride were achieved. In the sweeping mechanism, 100% of remotion was obtained with both coagulants. Substitute parameters used to determine precursors (color, UV-254, DOC and SUV A) seem valid for the studied water, in which humic substances are present in natural organic matter (NOM). The conclusion is that the water plant of Alto Cotia, in RMSP, Brazil, where this study was completed may operate with direct filtration during determined periods of the year, as an alternative to conventional treatment / Mestrado / Saneamento e Ambiente / Mestre em Engenharia Civil

Neste trabalho estudou-se a purificação de fator VIII de coagulação (FVIII) e da Proteína C (PC) por cromatografia. Em coluna ANX Sepharose FF como primeira etapa de purificação do plasma permite a eluição do FVIII e da PC com bom fator de purificação, mas não a separação destas. Propomos a separação de FVIII e PC empregando cromatografia de afinidade a metal (IMAC) empregando Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+ e dessorção empregando imidazol, cloreto de amônio e variação de pH. Em colunas de Fe3+ e Ni2+ as proteínas praticamente não se ligaram à resina. Em IMAC-Co2+, a PC não é adsorvida pela resina enquanto o FVIII pode ser eluído com imidazol 100 mM. Em IMAC-Cu2+ a PC eluiu com imidazol 10mM e o FVIII com 200mM. Não foi possível eluir as proteínas nem com NH4Cl 1M nem quando o pH foi abaixado até 4,0. Em IMAC-Zn2+ a PC não é adsorvida e o FVIII eluiu com imidazol 200mM ou NH4Cl 1M. Diminuindo-se o pH, a recuperação da atividade do FVIII foi baixa. Concluímos que IMAC-Co2+ apresentou os melhores rendimentos e melhores fatores de purificação para as 2 protéinas. / In this work purification methods for the coagulation factor VIII (FVIII) and Protein C (PC) by chromatography was studied. The use of ANX Sepharose FF column as the first purification step allows the elution of FVIII and PC with good purification factors, but not its separation. We propose the separation of FVIII and PC using immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) using Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+ and desorption employing imidazole, ammonium chloride and pH variation. In the columns containing Fe3+ and Ni2+ metal ions, proteins did not adsorb to the resin. In IMAC-Co2+, PC was not adsorbed to the resin, while FVIII could be eluted with 100 mM imidazole. In IMAC-Cu2+ PC could be eluted with 10 mM imidazole and FVIII with 200 mM. It was not possible to elute the proteins from IMAC-Cu2+ column with either 1M NH4Cl or when pH was descreased to 4,0. In IMAC-Zn2+, PC was not adsorbed and FVIII could be eluted with 200 mM imidazole or 1 M NH4Cl. We conclude that IMAC-Co2+ presented the best yield and purification factors for the 2 proteins.

A utilização de células humanas para a produção do fator VIII de coagulação recombinante (rFVIII) visa obter padrões de glicosilação equivalentes aos encontrados na proteína normal. O objetivo do trabalho foi obter um processo de produção do rFVIII em biorreator em perfusão, devido à sua labilidade térmica. Foram realizados estudos preliminares em Spinner e biorreator utilizando uma linhagem de rHeLa, cujos resultados embasaram os estudos com a linhagem produtora rSkHep. Foram utilizados microcarregadores nos cultivos com esta linhagem devido à dificuldade de adaptação da mesma à suspensão. Ensaios preliminares identificaram a melhor condição de cultivo com 3 g/L Mic e 1 cel/mic e, a partir destes valores, realizou-se um ensaio em perfusão, com tempo de residência de 24 h, no qual as variáveis controladas foram mantidas constantes durante três tempos de residência. A concentração de rFVIII obtida foi semelhante 2 UI/ mL. / The interest in using human cells for the recombinant coagulation factor VIII (rFVIII) lies in obtaining glycosylation patterns similar to the ones found in the normal protein. The objective of this work was to obtain a process for rFVIII production in bioreactor, in perfusion mode, due to the thermal lability of the protein. Using a recombinant HeLa cell line adapted to suspension growth a group of studies in a bioreactor in batch mode were performed. These results were the basis for the studies performed with the producing cell line rSkHep. Microcarriers (micc) were used due to the harshness to adapt the cell line to suspension and to serum-free medium. Preliminary tests identified the best culture condition with 3 g micc/L and 3 cell/micc and, from its values, it was performed a bioreactor study in perfusion mode, with a residence time of 24 hours. The controlled variables were kept constant for three residence times. The maximum rFVIII concentration obtained was 2 UI/mL.