by Chan Po Kwok. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1997. / Includes bibliographical references (leaves 132-140). / Abstract --- p.i / Acknowledgement --- p.iii / Publication --- p.iv / Abbreviations --- p.v / Table of Contents --- p.vi / Chapter Chapter 1 --- Introduction / Chapter Section a --- Blood Coagulation --- p.1 / Chapter Section b --- The role of factor XII --- p.4 / Chapter Section c --- Genomic organisation of the human factor XII gene --- p.8 / Chapter Section d --- Protein structure of the human factor XII --- p.12 / Chapter Section e --- Mutations in factor XII --- p.16 / Chapter Section f --- Methods to detect mutations --- p.25 / Chapter Section g --- About the patient with factor XII deficiency --- p.29 / Chapter Section h --- Strategies used in this study --- p.30 / Chapter Chapter 2 --- Methods and Materials / Chapter Section a --- Genomic DNA extraction --- p.33 / Chapter Section b --- Polymerase chain reaction amplification --- p.34 / Chapter Section c --- Cycle sequencing --- p.35 / Chapter Section d --- Restriction enzyme digestion and cloning of PCR products --- p.36 / Chapter Section e --- Reverse transcription and polymerase chain reaction of factor XII ectopic transcript --- p.36 / Chapter Section f --- Subcloning of 95-bp novel fragment --- p.38 / Chapter Section g --- Gel mobility shift assay --- p.39 / Chapter Chapter 3 --- Results / Chapter Section a --- Analysis of the catalytic region of the human factor XII --- p.41 / Chapter Section b --- Ectopic transcript of factor XII in peripheral blood lymphocytes --- p.65 / Chapter Section c --- Analysis of 3'end untranslated region of factor XII gene --- p.70 / Chapter Section d --- Analysis of 5' flanking region of factor XII gene --- p.75 / Chapter Section e --- Analysis of intron B --- p.94 / Chapter Section f --- Analysis of 5'-b PCR product --- p.98 / Chapter Chapter 4 --- Discussions / Chapter Section a --- Mutations in the coding sequence of factor XII gene --- p.107 / Chapter Section b --- Ectopic transcript of factor XII in lymphocytes --- p.113 / Chapter Section c --- The 3'untranslated region of factor XII gene --- p.116 / Chapter Section d --- The 5'flanking region of factor XII gene --- p.117 / Chapter Section e --- Other possible explanations of undetectable factor XII mRNA --- p.120 / Chapter Section f --- The 95-bp novel sequence in ´5ة flanking region --- p.123 / Chapter Section g --- Technical difficulties --- p.126 / Chapter Section h --- Future study --- p.130 / Chapter Chapter 5 --- References --- p.132 / List of Tables --- p.137 / List of Figures --- p.138

Thesis (M.Sc. (Physiology)) -- University of Limpopo, 1993. / Refer to the document / University of Limpopo Research Office

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2003. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 5 uppsatser.

Les propriétés des latex, produits aux larges applications industrielles, dépendent d’un grand nombre de facteurs : le type de monomère, les stabilisants, les initiateurs ou encore la taille des particules. Les procédés comme les formulations utilisés sont nombreux. La répartition des particules – taille moyenne, écart moyen, polydispersité – est souvent gérée par une étape de coagulation qui suit la nucléation, menée dans un post réacteur. La maîtrise de la coagulation nécessite un contrôle parfait du procédé. Ces travaux de thèse, réalisés dans le cadre de l’ANR SCALE-UP, ont pour objectif d’étudier la coagulation de latex acryliques dans un procédé continu de taille millimétrique opérant en régime laminaire. Les mécanismes de coagulation sont mis en évidence dans des conditions physico-chimiques et hydrodynamiques contrôlées, et l’influence des différents paramètres sur la cinétique de coagulation est quantifiée. Une méthodologie à l’interface de plusieurs domaines (génie des procédés, physico-chimie, numérique) est adoptée. Dans un premier temps, les bases essentielles à la compréhension du phénomène de coagulation sont introduites. Cette étude permet de distinguer deux types de coagulation : péricinétique (liée au mouvement Brownien), et orthocinétique (reliée au cisaillement). Les modèles associés sont présentés, et l’influence du procédé discutée. La déstabilisation des latex par coagulation Brownienne est ensuite examinée. Après avoir introduit les principales techniques analytiques existantes et caractérisé les latex étudiés, une étude physico-chimique est menée. Un modèle permettant d’estimer le temps de coagulation en fonction des conditions de pH, force ionique et concentration du milieu est proposé, basé sur des mesures de mobilité électrophorétiques. La troisième partie consiste en l’étude hydrodynamique par CFD de deux réacteurs millimétriques : un tube enroulé et un réacteur intensifié (Dean-Hex), comparés à un tube droit. Le régime visé est le régime laminaire. La coagulation orthocinétique dépendant des taux de cisaillement dans le réacteur, l’objectif est d’observer l’écoulement ainsi que les distributions de ces taux dans le réacteur, afin d’anticiper l’influence du changement de géométrie sur la coagulation. Des informations locales sur l’écoulement sont obtenues par suivi lagrangien de particules. La répartition des taux de cisaillement comme les temps passés dans les zones aux plus forts taux sont très différents selon le réacteur, laissant présager des résultats différents en termes de mécanismes de coagulation et de taille finale des agrégats. Le quatrième chapitre présente les résultats expérimentaux obtenus en milliréacteur. Un pilote a été développé, permettant la mise en écoulement des fluides par pressurisation de réservoirs. La coagulation de latex de trois tailles initiale différente y est menée. Les échantillons prélevés le long du réacteur sont analysés par diffraction laser (Mastersizer 2000). Outre les distributions de taille, des informations sur la dimension fractale des agrégats sont extraites. Dans le cas de réacteurs tubulaires enroulés, des résultats en fonction de la concentration, du pH et du débit sont obtenus, permettant de déterminer l’influence de ces paramètres sur la cinétique. Des informations sur l’équilibre agrégation-rupture sont également disponibles à partir des expériences réalisées sur un des latex. Le régime d’écoulement laminaire, impliquant un mode de collision balistique, permet d’obtenir des agrégats de forme pratiquement sphérique. Une discussion concernant les conditions de travail en milliréacteur est menée, afin de cerner l’applicabilité de ce procédé. Dans une dernière partie, une méthode d’estimation de noyaux cinétiques, par Quadrature des Moments est présentée et appliquée à des résultats obtenus en réacteur de Taylor-Couette. De par le contrôle de l’hydrodynamique qu’il propose, un tel réacteur est parfaitement adapté à cette application. / Due to their large applicability, latexes are widely used in industries. Their properties depend on many parameters including the monomer, stabilizers and initiators used, and also the particle size. The particle size distribution of these suspensions is often regulated by a coagulation step, occurring after nucleation in a reactor. Coagulation control thus means perfect process control. This thesis, led in the framework of the project ANR SCALE-UP, aims at studying acrylic latex coagulation in millimetric-scale reactors in laminar flow. Coagulation mechanisms are highlighted in controlled physico-chemical and hydrodynamic conditions, and the influence of the various parameters on coagulation kinetics is quantified. A scientific methodology based on chemical engineering, physical-chemistry and fluid mechanics is employed. The first part of the thesis aims at presenting the theoretical basis of this work, where by the differences between perikinetic coagulation (driven by Brownian motion) and orthokinetic coagulation (related to shear) are distinguished. Models related to coagulation and rupture of aggregates are presented. As the reactor geometry is expected to have a significant impact on coagulation due to its sensitivity to shear, the influence of the geometry is also discussed. The second part of the work focuses on the stability of latex, which is related to Brownian coagulation. The main analysis techniques related to the size determination of aggregates are firstly discussed and a complete characterization of the latex used is presented. A physical-chemical study is then performed, resulting in the proposition of a model that allows the calculation of a coagulation time as a function of the properties of the latex suspension, namely pH, concentration and ionic strength. The third part presents a CFD study of two millimetric-scale reactors – a coiled tube and a meandering channel (Dean-Hex) reactor – and compares them with a straight tubular reactor. This work aims at studying the flow properties and shear rates produced inside these reactors in order to better understand their influence on the coagulation process. At equal flow rates, the Dean-Hex reactor proposes a narrower shear rate distribution compared with the tubular geometries, however very high shear rates are also generated and these are likely to modify the particle size distribution by breaking the aggregates. The fourth part of the thesis details the experimental results of the latex coagulation process in the coiled tube. A pilot-scale set-up was designed and constructed allowing the reactant feeds to be regulated and product sampling at eight points such that coagulation could be monitored with residence time. Samples were analyzed using dynamic light scattering (Mastersizer 2000), which enable the fractal dimension of aggregates to be obtained. The results of aggregate growth as a function of pH, flowrate and latex concentration are presented and provide information on the aggregation kinetics. A more concentrated latex is used to gain insight on aggregation-rupture equilibrium. Considering the fractal dimension of the larger aggregates, the equilibrium size was found to linearly decrease with the average shear rate. Also, laminar flow was found to result in more spherical aggregates than what is obtained in a batch reactor due to the ballistic collision mode involved. A discussion on the effects of experimental conditions (concentration, pH and flow rates) and the limitations of millimetric-scale equipment for latex aggregation is initiated. The final part of the work aims at introducing a population balance model for the aggregation process using the Quadrature Method of Moments (QMOM) and results obtained in a Taylor-Couette reactor. This device offers good control of hydrodynamics and it istherefore well suited to the determination of aggregation and rupture kernels.

Les adénovirus humains (HAdV) provoquent un large spectre de maladies cliniques chez les patients immunodéprimés et immunocompétents et sont également des outils polyvalents pour le transfert de gènes et la vaccination. L’immunité humorale acquise peut être en partie responsable des réactions indésirables envers les vecteurs AdV révélées dans plusieurs essais cliniques de vaccination. De plus, plusieurs protéines de l'hôte comme le facteur X de coagulation de la souris (FX) ou les immunoglobulines de type G se lient aux HAdV et exacerbent la réponse pro-inflammatoire. L’évaluation des risques précliniques se fait souvent chez la souris, même s’il existe plusieurs différences entre les humains et les souris dans l'interaction avec les HAdV. La liaison de FX aux HAdV active une réponse pro-inflammatoire chez la souris par l'intermédiaire des récepteurs Toll-like 4. Dans un autre scénario clinique pertinent, le complexe immun HAdV (IC-HAdV-C5) induit une activation plus forte de l’inflammasome dans les phagocytes humains que l’HAdV-C5 non complexé, mais par un mécanisme inconnu. Dans ce contexte, j’ai participé à deux études. Premièrement, nous avons étudié le rôle potentiel de FX et de TLR4 dans la réponse innée à l ‘HAdV-C5 en utilisant uniquement des cellules et des protéines d’origine humaine. Nous avons constaté qu'il n'y a pas d’activation de la voie de signalisation via TLR4 chez l’homme en présence de FX-HAdV. De plus, le FX n'a pas affecté la forte réponse immunitaire innée induite par IC-HAdV-C5 dans les phagocytes humains. Deuxièmement, nous avons abordé le mécanisme sous-jacent de l'inflammation induite par IC-HAdV-C5. Nous avons démontré que l‘IC-HAdV-C5 induit la formation de l’inflammasome dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes et cela dépend de l’échappement endosomal dépendant de la protéine VI et de l'activation des récepteurs cytosoliques de l’inflammasome. Nos résultats nous aident à mieux comprendre les différences entre les tests précliniques réalisés chez la souris et les essais cliniques réalisés chez l'homme. De plus, cela nous permet de mieux comprendre comment l’immunité préexistante façonne la réponse immunitaire innée face aux HAdV, afin d’améliorer le traitement des maladies liées aux HAdV ainsi que l’efficacité des vecteurs HAdV. / Human adenoviruses (HAdV) cause a broad spectrum of clinical diseases in immunocompromised and –competent patients and are also versatile tools for gene transfer and vaccination. Pre-existing humoral immunity may be in part responsible for the adverse responses towards AdV vectors seen in several clinical vaccine trials. Furthermore, a variety of host proteins like mouse coagulation factor X (FX) or immunoglobulin G bind HAdV exacerbate the pro-inflammatory response. Pre-clinical risk assessment is often done in mice, albeit there are multiple differences between human and mice in the interaction with HAdV. The binding of FX to HAdV activates a pro-inflammatory response in mouse via Toll-like receptor 4. In another clinical relevant scenario, immune complexed-HAdV (IC-HAdV-C5) induces more inflammasome activation in human phagocytes than HAdV-C5 alone but by unknown mechanism. In this regard, I participated in two studies. First, we investigated a potential role of FX and TLR4 in the innate response to HAdV-C5 by using only human components. We found that there is no detectable FX-HAdV-TLR4 axis in human and FX did not affect the innate immune response elevated by IC-HAdV-C5 in human phagocytes.Second, we addressed the underlying mechanism of IC-HAdV-C5-induced inflammation. We found that IC-HAdV-C5 induces inflammasome formation in monocyte-derived dendritic cells and this is dependent on pVI-mediated endosomal escape and activation of cytosolic inflammasome sensors. Our findings help us to better understand the differences in preclinical testing in mice and clinical use in humans and how pre-existing immunity shapes the innate immune response to HAdV to improve treatment for HAdV diseases and HAdV vector effectiveness.

Les anticoagulants anti-vitamines K (AVK) sont des inhibiteurs du mécanisme de régénération de la vitamine K. Celle-ci est impliquée dans l'activation post-traductionnelle par gamma-carboxylation de nombreuses protéines, et notamment de quatre protéines essentielles à la coagulation. L'apport alimentaire en vitamine K n'étant pas suffisant pour remplacer le cycle de régénération, un cycle efficace de régénération de la vitamine K est nécessaire. Les AVK bloquant ce cycle, la gammacarboxylation des facteurs de la coagulation n'est plus assurée, ainsi, la production de facteurs de la coagulation utilisables est fortement diminuée, ce qui affecte, par conséquent, le potentiel de la coagulation sanguine. Une inhibition importante du cycle de régénération peut entraîner la mort par hémorragies, c'est dans ce but que sont utilisés les AVK dans la lutte contre les rongeurs. Depuis une trentaine d'années, il a été remarqué que les rats femelles étaient moins sensibles aux AVK que les rats mâles. Plusieurs hypothèses pourraient expliquer cette différence : (i) une activité microsomale responsable de la régénération de la vitamine K plus efficace chez les femelles; (ii) une élimination plus rapide des AVK par les rats femelles; (iii) des concentrations basales et des demi-vies des facteurs de la coagulation vitamine K dépendants plus élevées chez les femelles. Le but principal de ce travail est de déterminer l'origine de la différence de sensibilité des rats femelles aux AVK.Les résultats mettent en évidence des différences significatives entre les mâles et les femelles concernant les niveaux basaux et les cinétiques d'évolution certains facteurs de la coagulation, pouvant expliquer la plus faible sensibilité des femelles aux AVK / Vitamin K antagonists (VKA) are inhibitors of the recycling mechanism of vitamin K. Vitamin K is involved in the post-translational activation by gamma-carboxylation of vitamin K dependant proteins, and in particular four proteins essential to coagulation. Food intake of vitamin K is insufficient to substitute the recycling mechanism, an efficient cycle is necessary. If VKA block the recycling mechanism, gamma-caboxylation of vitamin K dependant clotting factors becomes is not done, thus the production of the active form of these clotting factors is diminished. Consequently, the blood coagulability is affected. An important inhibition of the recycling mechanism can kill by haemorrhage, it’s with this aim that VKA are used in rodent management. Over the past three decades, a slight resistance to VKA has been observed in female rats beside male rats. Some hypothesis can explain this difference: (i) a more efficient activity of female microsomes which are responsible of the vitamin K regeneration; (ii) a faster elimination of VKA in female rats; (iii) basal concentrations and half-lives of vitamin K dependant clotting factors are higher in female rats. The main purpose of this work is to identify the origin of the resistance of female rats to VKA.Our results pinpoint significant differencies between females and males concerning the basal levels and the evolution kinetics of some vitamin K dependant clotting factors. This might explain the weaker sensibility of female rats to VKA

Le rôle du fibrinogène dans les coagulopathies par hémorragie a fait récemment l'objet de travaux importants, la plupart hors du champ obstétrical. L'adaptation de la coagulation et du fibrinogène au cours de la grossesse est méconnue même si sa mise en jeu paraît indispensable à l'hémostase utérine lors de la délivrance. Nous avons donc étudié les modifications gestationnelles du fibrinogène et analysé leurs impacts sur la coagulation et l'hémorragie de la délivrance (HDD). Nous avons montré que le fibrinogène augmentait progressivement pendant la grossesse pour atteindre [3,5-6,5 g/L] (5ème-95ème p.) au 3ème trimestre. L'étude en thromboélastométrie (TEM) a révélé une élévation progressive du "potentiel coagulant" et de la fermeté du caillot chez la femme enceinte. Nous avons ensuite analysé le lien entre le taux initial de fibrinogène lors d'une HDD et le risque d'aggravation (Etude PITHAGORE 6). Le taux de fibrinogène était le meilleur marqueur du risque d'évolution grave. Des seuils de fibrinogène inférieurs à 2 et 3 g/L étaient associés à un risque accru d'aggravation par rapport aux femmes avec un taux > 3 g/L (respectivement OR=11,99 ; IC95% [2,56-56,06] et OR=1.90; IC95% [1,16-3,09]. Enfin l'étude en TEM a montré que les paramètres précoces CA5- et CA15-FIBTEM étaient étroitement corrélés aux taux de fibrinogène lors des HDD permettant l'optimisation du monitorage de la coagulation. Nos résultats nous conduisent à proposer deux scores de coagulopathie obstétricale prenant en compte les spécificités de la grossesse. Des essais seront nécessaires pour valider la pertinence de ces scores et pour évaluer le bénéfice de la compensation précoce en fibrinogène dans les HDD / The role of fibrinogen in haemorrhage-induced coagulopathies has recently been the subject of important work, most of it outside the field of obstetrics. The changes in coagulation and fibrinogen during pregnancy are poorly understood, even though its involvement is essential for uterine haemostasis during the afterbirth. We thus studied the course of fibrinogen levels during pregnancy and analysed their effects on coagulation and postpartum (third-stage) haemorrhage (PPH). We showed that fibrinogen increases progressively during pregnancy, reaching [3.5-6.5 g/L] (5th-95th p.) during the 3rd trimester. The thromboelastometry (TEM) study revealed a progressive increase in the coagulant potential and firmness of clots in pregnant women. We then analysed the association between the initial fibrinogen level during PPH and the risk of aggravation (in the PITHAGORE 6 study). A woman's fibrinogen level was the best marker of the risk that her condition would worsen. Thresholds below 2 and 3 g/L were associated with higher risks of aggravation than in women with fibrinogen concentrations >3g/L (respectively OR=11.99 ; 95% CI [2.56-56.06] and OR=1.90; 95% CI [1.16-3.09]. Finally the TEM study showed that FIBTEM assessment of the early indicators, clot amplitude at 5 and 15 minutes (CA5 and CA15), was closely correlated with fibrinogen levels during PPH and thus helped to optimise coagulation monitoring. Our results lead us to suggest two obstetric coagulopathy scores that take the specificities of pregnancy into account. Trials will be necessary to validate their relevance and to assess the benefits of early fibrinogen replacement in PPH

En réponse à l'activation et/ou une apoptose, les cellules endothéliales (CE) libèrent dans le milieu environnant des microparticules endothéliales (MPE). Les microparticules sont des vésicules de petite taille résultant d'évènements membranaires liés à une perte de l'asymétrie des phospholipides. Peu de travaux concernent l'étude des mécanismes de génération des MPE et l'influence du territoire vasculaire sur la capacité de vésiculation des CE n'est pas connue. Nous avons montré que la thrombine induit la génération de MPE par un mécanisme complexe impliquant un lien entre coagulation et inflammation sur les CE macro et microvasculaires. A partir de l'étude du transcriptome, nous avons mis en évidence l'implication de TRAIL dans la génération des MPE procoagulantes par la thrombine. A l'état basal, les CE issues de différents territoires vasculaires présentent des capacités différentes de vésiculation, les CE microvasculaires présentant une plus grande capacité à libérer des MPE. L'étude du transcriptome a permis de déterminer des signatures moléculaires représentatives des territoires macro et microvasculaires. Nos travaux mettent en évidence une génération différentielle de MPE en fonction du calibre des vaisseaux et les signatures spécifiques pourraient permettre une meilleure caractérisation du territoire endothélial lésé. / In response to activation and/or apoptosis, endothelial cells (EC) release endothelial microparticles (EMP) in the extracellular space. Microparticles are small-sized vesicles resulting from membrane events leading to a loss of phospholipid asymmetry. Few works have documented the mechanisms underlying EMP generation and the influence of vascular bed on EMP release remains largely unknown. Our works showed that thrombin induced EMP generation through a complex mechanism involving a cross-talk between coagulation and inflammation in macro and microvascular EC. Using a global gene expression study, we have evidenced the involvement of TRAIL in the procoagulant EMP generation induced by thrombin. In a basal state, EC from various vascular beds showed different capacities of EMP release, with microvascular EC displaying the highest capacity. Gene expression study identified molecular signatures representative of EC from macro and microvascular beds. Our works highlight the role of the vascular beds in the capacity of EC to generate EMP according to the vessel caliber. The specific gene signatures could improve our knowledge the endothelial dysfunction and a better characterization of the damaged vascular beds.

Notre équipe s’intéresse à la relation structure-fonction d’une protéine, l’antithrombine (AT), un inhibiteur physiologique de la coagulation, en vue d’un développement thérapeutique. Cette protéine anticoagulante, capable de lier un motif pentasaccharidique sur les dérivés hépariniques, possède en outre, à fortes concentrations (500%), des propriétés anti-inflammatoires médiées par sa liaison aux héparan-sulfates cellulaires. Ce profil a mené à l’évaluation de l’AT dans des situations associant un emballement de la coagulation et de l’inflammation, comme c’est le cas au cours du sepsis sévère et d’autres situations d’ischémie-reperfusion (I/R). Cependant, les fortes concentrations utilisées dans les études précliniques nécessiteraient d’administrer des doses d’AT incompatibles avec le profil de sécurité de cette protéine anticoagulante.Dans ce contexte, nous avons, au cours de ce travail, caractérisé un variant d’AT (AT-N135Q-Pro394) dépourvu d’activité anticoagulante et doué d’une affinité augmentée pour l’héparine. Ce variant est capable de piéger des dérivés hépariniques et apparait comme un candidat idéal pour une utilisation comme antidote en cas de surdosage en héparine non fractionnée (HNF), héparines de bas poids moléculaire (HBPM) ou fondaparinux. Par ailleurs, ce variant pourrait être utilisé à des doses cytoprotectrices, sans risque hémorragique.Afin de tester cette dernière hypothèse, nous avons développé un modèle d’I/R rénale chez la souris, qui s’accompagne d’une augmentation significative de marqueurs de dysfonction rénale (Urée, Créatinine, Kim-1) et de l’inflammation (expression tissulaire de cxcl-1, il-6). L’AT avait déjà été montrée protectrice (Mizutani et al, Blood 2003) dans un modèle murin comparable. De façon surprenante, nous n’avons observé aucun des effets protecteurs décrits, ni sur l’inflammation ni sur la fonction rénale, et que ce soit avec de l’AT plasmatique, de l’AT recombinante ou encore avec un mélange équimolaire d’AT latente et native. Ce même modèle nous a pourtant permis de mettre en évidence les effets nephroprotecteurs et anti-inflammatoires d’une autre protéine anticoagulante, la protéine C activée. Ces résultats décevants font écho à la rétractation pour fraude de l’article de Mizutani et al. en 2013. Le travail approfondi que nous avons mené nous permet de clarifier la littérature et d’affirmer que l’AT, d’origine plasmatique ou recombinante, ne possèdent pas d’effet protecteur dans l’I/R rénale chez la souris. Dans ces conditions, le variant AT-N135Q-Pro394 n’a pas été testé.Concernant la seconde indication, l’AT-N135Q-Pro394 avait déjà été évaluée in vivo comme antidote aux dérivés hépariniques, HNF, HBPM et fondaparinux, avec d’excellents résultats. Néanmoins, cet effet antidote a été exploré spécifiquement par mesure de l’activité anti-facteur Xa alors que l’AT inhibe plusieurs enzymes de la cascade de coagulation tel que les facteurs VIIa, IXa et IIa. Nous avons donc exploré cet effet antidote dans un test plus global de la coagulation, le test de génération de thrombine (TGT) pour pouvoir le comparer aux autres stratégies non spécifiques utilisées pour antagoniser les dérivés hépariniques (facteur VII activé recombinant, concentré de complexes prothrombiques activés ou protamine). De façon intéressante, dans un plasma mimant un surdosage, notre variant présente un effet antidote supérieur aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine vis-à-vis du fondaparinux et des HBPMs, respectivement, et équivalent au sulfate de protamine vis-à-vis de l’HNF. Enfin, dans du plasma en l’absence d’anticoagulant, l’AT-N135Q-Pro394 ne montre aucun effet sur la génération de thrombine contrairement aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine qui, ajoutés seuls dans du plasma, modifient significativement le profil des TGT / Our team topic focuses on the structural-function relationship of a natural anticoagulant, antithrombin (AT), in order to develop potential therapeutic agents. AT inhibits several serine proteases of the coagulation cascade and its inhibitory activity is increased when AT binds to a pentasaccharidic motif contained within in the heparin derivatives. At high concentrations (500%), AT also exerts anti-inflammatory and cytoprotective properties through its binding to heparan sulfate proteoglycans, making it a good candidate for supportive therapy in clinical settings associating inflammation and coagulation activation. Indeed, AT has already been evaluated in vivo in various models of ischemia-reperfusion injury (IRI) and AT even reached a large-scale clinical trial in severe sepsis. However, the high concentrations of AT that are needed to exert anti-inflammatory properties are inconsistent with the safety profile of this anticoagulant protein.In this context we have further characterized an AT variant (AT-N135Q-Pro394) with increased affinity to heparin but devoid of anticoagulant activity. Indeed, this variant was described to be able to trap heparin derivatives and our work was to pursue the characterization of this variant as an antidote toward heparin derivatives in clinical situations of overdosing. In addition, this AT variant binds to heparan sulfate proteoglycans with higher affinity, as compared to native AT, and appears as a promising cytoprotective agent whose administration would not be associated with any bleeding risk.To test the latter hypothesis, we developed a murine model of renal IRI in which the renal function was severely impaired, as attested by increased kidney injury markers (urea, creatinine, kim-1) and local kidney inflammation (renal gene expression of il-6 and cxcl-1). Indeed, in 2003, Mizutani et al. reported a protective effect of AT in a similar murine model of renal IRI. Surprisingly, we observed none of the described protective effects, neither on inflammation nor renal function, with plasma AT, recombinant AT and an equimolar mixture of native and latent AT. Nevertheless, the same model enabled us to highlight the nephroprotective and anti-inflammatory properties of another anticoagulant protein, activated protein C (APC), as previously reported. These disappointing results coincided with the withdrawal in 2013 of the study of Mizutani et al., and our work allowed us to clarify the literature and to claim that neither recombinant nor plasma-derived native nor latent forms of AT exhibit a protective effect in renal IRI in mice. Under these conditions, AT-N135Q-Pro394 variant has not been tested in our model.AT-N135Q-Pro394 has also been previously shown to efficiently neutralise the anticoagulant activity of heparin derivatives, including unfractionated heparin (UFH), low molecular weight heparins (LMWH) and fondaparinux in vivo. Nevertheless, this reversal effect was only explored by anti-factor Xa assays whereas AT inhibits a number of coagulation proteases, including factors VIIa, IXa and IIa. Therefore, we explored AT-N135Q-Pro394 variant in a more global coagulation assay, the thrombin-generation assay (TGA), in order to compare its activity with non-specific reversal agents used toward heparin derivative overdose (recombinant-activated factor VII, activated prothrombin-complex concentrate or protamine). Interestingly, in plasma mimicking an overdose, our variant demonstrated greater reversal efficiency as compared to hemostatic agents and protamine sulfate toward fondaparinux and LMWH, respectively, and was as efficient as protamine sulfate toward UFH. Finally, when added to native plasma (in the absence of heparin derivative), AT-N135Q-Pro394 showed no effect on thrombin generation unlike hemostatics and protamine sulfate that all significantly affect the TGA profile