OGATA, Miriam Camargo Guarnieri, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: GUARNIERI, Miriam Camargo / Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:11:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T19:23:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T19:23:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CAPES / Crotalus durissus cascavella é uma subespécie endêmica da região Nordeste do Brasil, cuja peçonha difere das demais subespécies do país pela ausência de crotamina e alta concentração de fosfolipases A₂ (PLA₂) ácidas. Neste estudo, duas novas PLA₂s ácidas, denominadas Cdca-I-PLA₂ e Cdca-II-PLA₂, foram purificadas da peçonha de C. d. cascavella através de duas e três etapas cromatográficas, respectivamente. A pureza e homogeneidade de ambas fosfolipases foram determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massa, apresentando uma banda única e massa de 14.247 Da (Cdca-IPLA₂) e 14.418 Da (Cdca-II-PLA₂). Ambas fosfolipases foram ativas sobre 4-nitro-3- ácido octanoil benzóico, apresentando atividade específica de 11,51 ± 0,50 U/mg e 26,75 ± 0,15 U/mg, Km = 0,2280 mM e 0,3993 mM e Vmax = 13,15 nmol×min⁻¹mg⁻¹ e 39,68 nmol×min⁻¹mg⁻¹, respectivamente. Ambas não apresentaram atividade sobre BApNA. A Cdca-I-PLA₂ apresentou atividade hemaglutinante na dose de 15 μM, enquanto a Cdca- II-PLA₂ apresentou atividade sobre substrato fluorogênico de trombina nas doses de 15 μM e 30 μM. As Cdca-I-PLA₂ e Cdca-II-PLA₂ reduziram a agregação plaquetária induzida por colágeno, adrenalina e ácido araquidônico, porém as duas enzimas (20 μM) não reduziram a agregação quando ADP foi utilizado como agonista. Cdca-I-PLA₂ apresentou atividade dose resposta como agonista de agregação em plaquetas lavadas e reduziu significativamente a atividade agregante plaquetária da trombina. Cdca-I-PLA₂ apresentou maior atividade anticoagulante, prolongando os tempos de protrombina (TP; 30 μM; R = 22) e tromploplastina parcial ativada (TTPa; 30 μM; R = 10), porém não promoveu alteração do tempo de trombina (TT) na dose de 10 μM. Cdca-II-PLA₂ prolongou discretamente o TP (30 μM; R = 2) e TTPa (30 μM; R = 1,5) e significativamente o TT (20 μM; R = 7). Desta forma, nossos resultados sugerem que a Cdca-I-PLA₂ é uma quimerolectina anticoagulante com importante atividade sobre agregação plaquetária, enquanto Cdca-II-PLA₂ possui alta atividade enzimática, inibe tanto a agregação plaquetária quanto a coagulação, agindo como inibidor de trombina por meio da sua ligação com o fibrinogênio. / Crotalus durissus cascavella is ana endemic subspecie from Northeast region of Brazil, whose venom differs from the other subspecies of the country due to the absence of crotamine and high concentration of acidic phospholipase A₂ (PLA₂). In this study, two new acidic PLA₂s, named Cdca-I-PLA₂ and Cdca-II-PLA₂, were purified from C. d. cascavella venom by two and three chromatographic steps, respectively. The purity and homogeneity of both phospholipases were determined by SDS-PAGE and mass spectrometry, showing a single band and molecular mass of 14.247 Da (Cdca-I-PLA₂) and 14.418 Da (Cdca-II-PLA₂). Both PLA₂s were active on 4-Nitro-3-(octanoyloxy) benzoic, presenting specific activity of 11,51 ± 0,50 U/mg and 26,75 ± 0,15 U/mg, Km = 0,2280 mM and 0,3993 mM and Vmax = 13,15 nmol×min⁻¹mg⁻¹ and 39,68 nmol×min⁻¹mg⁻¹, respectively. Both had no activity on BApNA. The Cdca-I-PLA₂ showed hemagglutinating activity at the dose of 15 μM, while Cdca-II-PLA₂ showed activity on fluorogenic thrombin substrate at the doses of 15 μM e 30 μM. The Cdca-I-PLA₂ and Cdca-II-PLA₂ reduced platelet aggregation induced by collagen, adrenaline and arachidonic acid, but the two enzymes (20 μM) did not reduce aggregation when ADP was used as an agonist. Cdca-I-PLA₂ showed dose response activity as agonist of aggregation in washed platelets and significantly reduced thrombin platelet aggregation activity. Cdca-I-PLA₂ presented higher anticoagulant activity, prolonging prothrombin time (PT; 30 μM; R = 22) and activated partial thromboplastin time (aPTT; 30 μM; R = 10), but did not promote a change in thrombin time (TT) at a dose of 10 μM. Cdca-IIPLA₂ prolonged discreetly the PT (30 μM; R = 2) and the aPTT (30 μM; R = 1.5) and significantly prolonged the TT (20 μM; R = 7). Thus, our results suggest that Cdca IPLA₂ is an anticoagulant chimerolectin with important activity on platelet aggregation, while Cdca-II-PLA₂ has high enzymatic activity, inhibit both platelet aggregation and cloagulation, acting as thrombin inhibitor through its biding to fibrinogen.

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T18:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_M.pdf: 13631091 bytes, checksum: 614bd6add75c50691b0684d8afeade9b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Peçonhas de serpentes contêm enzimas que quebram ligações fosfáticas (ATPases, 5'-nucleotidases, fosfatases e fosfodiesterases ou PDE) e que agem sobre ácidos nucléicos (PDE, DNase e RNase). Nesse trabalho, purificou-se e caracterizou-se a PDE da peçonha de Bothrops alternatus. A PDE foi isolada da peçonha, usando-se uma combinação de cromatografias de gel filtração e troca iônica. Em SDS-PAGE, a enzima é constituída de uma única cadeia polipeptídica com uma massa molecular de 105 kDa, a qual foi inalterada pela presença do ß- mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A enzima foi reconhecida por anti-soro botrópico comercial, tanto no ELlSA como no immunoblotting. A enzima purificada era desprovida de nucleotidase, fosfatase alcalina e atividade proteolítica. O pH ótimo da PDE foi de 7.5 a 9.5, com temperatura ótima de 60°C. Houve perda rápida de atividade, após 1 minuto a 70°C. O Kmda enzima foi de 2.69 mM. A atividade da PDE foi potencializada pelo cobalto e, em grau menor pelo cálcio, enquanto que o cobre, manganês, zinco, EDTA and ß-mercaptoetanol foram inibitórios. Esses resultados mostram que esta enzima é pertence à família de proteínas da PDE isoladas de outras peçonhas ofídicas / Abstract: A phosphodiesterase was purified from the venom of the snake Bothrops alternatus by a combination of gel filtration and ion exchange chromatographies. In SDS-PAGE, the enzyme gave a single band with a molecular mass of 105 kDa which was unaltered in the presence of ß -mercaptoethanol, indicating that the protein contained no subunits. There were no contaminating 5'-nucleotidase, alkaline phosphatase and protease activities. The enzyme was recognized by commercial bothropic antiserum and gave a single band in immunoblotting. The enzyme had a pH optimum in the range of 7.5-9.5 and the optimum temperature was 60°C, with activity being rapidly lost within 1 min at 70°C. The Kmof the enzyme was 2.69 mM. PDE activity was potentiated by cobalt and, to a lesser extent, by calcium, whereas copper, manganese, zinc, EDTA and ß-mercaptoethanol were inhibitory. These properties show that this enzyme is very similar to that isolated from other snake venoms.4 / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:22:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CarolineRibeirodeBorja_D.pdf: 22434258 bytes, checksum: 1032d29d7d3da47c988623e5cd6780bc (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Os efeitos neuromusculares do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis foram estudados através de preparações biventer cervicis de pintainho e nervo frênico-diafragma de camundongo. Em preparação de ave, o veneno produziu bloqueio irreversível e dependente da concentração das contrações musculares em resposta à estimulação elétrica indireta. Com 1-20 µgde veneno/ml, as respostas ao KCI (13,4 mM) foram parcialmente ou completamente inibidas, enquanto que as respostas à ACh (110 M)não foram afetadas. Com 50 µg/ml,as respostas à ACh, ao KCI e à estimulação direta foram inibidas. O veneno induziu também contraturas dependentes da concentração a partir de 10 µg/ml. À 20-24°C, o veneno (50 µg/ml)produziu somente um bloqueio parcial (30,7 ± 8,0%, média ± SEM; p < 0,05; n = 3) após 120 min sem afetar as respostas à ACh e ao KCI. Em preparação de camundongo, 50 µg de veneno/ml causaram bloqueio total das respostas à estimulação indireta e direta, e, quando o Ca2+(1,8 mM) da solução nutritiva foi substituído pelo sr2+ (4.0 mM), somente um bloqueio parcial da resposta à estimulação indireta foi obtido (40.3 ±7.8%; P < 0,05; n = 3) após 120 min de incubação. Estes resultados indicam que o veneno de B. n. pauloensis é neurotóxico, atua preferencialmente em sítios pré-sinápticos, e que sua atividade farmacológica está relacionada a sua atividade enzimática. O veneno foi fracionado por HPLC de exclusão molecular e sua atividade neuromuscular foi recuperada no primeiro, segundo e terceiro picos (pico 1, pico 2 e pico 3, respectivamente) do perfil cromatográfico. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Snakes of the genus Bothrops are the most important cause of snakebites in Brazil. The main complications in lethal cases are acute renal failure, shock, acute respiratory failure and sepsis. The neuromuscular effects of Bothrops neuwiedi pauloensis (jararaca-pintada) venom were studied in chick biventer cervicis and mouse phrenic nerve-diaphragm preparations. In chick preparations, venom concentrations of 5-50 µg/ml produced an initial inhibition and a secondary augmentation of the twitches evoked indirectly followed by a progressive concentration-dependent and irreversible neuromuscular blockade. At venom concentrations of 1-20 µg/ml, the responses to KCI (13.4 mM) were partially or completely inhibited whereas those to acetylcholine (110 µg/Mw) ere unaffected. At venom concentrations higher than 50 µg/ml, there was pronounced muscle contracture with inhibition of the responses to acetylcholine, KCI and direct stimulation. At 20-24°C, the venom (50 µg/ml)produced only partial neuromuscular blockade (30.7± 8.0% blockade, mean:t SEM; p < 0.05; n = 3) atter 120 min and the initial inhibition and the secondary augmentation of the twitch responses caused by the venom were prolonged and pronounced and the response to KCI was unaltered. In mouse preparation, At 20 µg/ml,the venom irreversibly inhibited (60 ±10% inhibition, mean ± SEM; p< 0.05; n = 6) indirectly evoked twitches. At 50 µg/ml, the venom blocked the indirectly (n = 5) and directly (n = 6) evoked twitches in mouse hemidiaphragms. In the absence of Ca2+, at 50 µg/ml,only partiaI blockade (40.3v ± 7.8% inhibition; p < 0.05; n = 3) was observed atter a 120 min incubation.These results indicated that B. n. pauloensís venom was neurotoxic, acting primarily at presynaptic sites, and that enzymatic activity could be involved in that pharmacological action. The venom was fractionated by HPLC molecular exclusion (Protein Pack 300SW column). The neuromuscular activity of the venom was recovered in the first, second and third peaks (peak 1, peak 2 and peak 3, respectively) of the elution profile.Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T13:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kassab_BaykiHussein_M.pdf: 2921430 bytes, checksum: ce6acbd70d8b56f04ccb974ccdfe3c4f (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: As lectinas são proteínas ou glicoproteínas com a capacidade de aglutinar eritrócitos e outras células, precipitar polissacarídeos e outras glicoproteínas por possuírem um (ou mais) centro de ligação, específico e reversível, a carboidratos. As lectinas podem ser encontradas em animais, vegetais e microorganismos. BMooL é uma lectina específica para galactosídeos, e foi purificada do veneno da serpente Bothrops moojeni através da cromatografia de afinidade em D-Iactose. O perfil eletroforético (SDS-P AGE) mostrou que BMooL é um homodímero com subunidades de 14 kDa. A proteína apresentou reação positiva quando submetida a coloração para carboidrato, sendo portanto uma glicoproteína. Dentre os eritrócitos testados, BMooL apresentou maior afinidade por eritrócitos humanos tripsinizados do tipo A, B e O, em concentrações mínimas respectivas de 0,50 ug/ml, 0,96 /. ug/ml e 0,96 ug/ml. Eritrócitos tripsinizados de cavalo e pato não foram aglutinados na presença desta lectina. A atividade hemaglutinante com 2,0 ug/ml de BMooL sobre eritrócitos humanos tripsinizados do tipo A é inibida com 0,8 mM de lactose, 1,56 mM de galactose e 1,56 mM de rafinose. A atividade hemaglutinante de BMooL demonstrou ser dependente de Ca²+, pois foi inibida na presença de EDT A e EGT A. A associação das subunidades é uma condição fundamental para a atividade hemaglutinante de BMooL, pois quando reduzida com DTT, a lectina não mantém tal atividade. A composição de aminoácidos da lectina permitiu verificar que BMooL é uma proteína que contém em maior proporção resíduos de aminoácidos hidrofílicos como Asx (14%), Glx (13%) e Lys (8,0%) e aminoácidos não polares como Leu (8,1%). Em testes de agregação plaquetária com plasma humano, na presença de colágeno como agonista das agregações, a lectina não demonstrou nenhuma modulação significante nas plaquetas em concentrações de até 40,0 ug/ml. A função das lectinas em venenos ofidicos ainda não está bem esclarecida, a atividade hemaglutinante não reflete diretamente o papel dessas proteínas. O estudo da estrutura e de outras atividades biológicas que as lectinas apresentam, faz-se necessário para um melhor entendimento das interações lectina-carboidrato, que participam da grande maioria das interações biológicas existentes / Abstract: Lectins are proteins or glycoproteins which agglutinate erythrocytes and other cells and polysaccharides, since they have one or more specific carbohydrate-binding sites. Lectins are widely distributed in plants, as well as in animaIs and microorganisms. They have also been found in the venom of snakes. A lactose-specific lectin, BMooL, was purified from the crude venom of Bothrops moojeni by affinity chromatography on an immobilized D-Iactose column. The SDS-P AGE, under reduction conditions, showed that BMooL is a homodimer of 14kDa subunits. The protein appeared to be a glycoprotein once it showed a positive reaction to the Schiff' s reagent. Among the assayed erythrocytes, BMooL had more affinity to trypsined A, B and O types of human erythrocytes with end points of approximately 0.50 ug/ml, 0.96 ug/ml and 0.96 ug/ml, respectively. On the other hand, trypsined erythrocytes from horses and ducks did not agglutinate in the presence of this lectin. The hemagglutination of trypsined A type human erythrocytes induced by 2.0 ug/ml of BMooL was inhibited specifically in the presence of 0.8 mM lactose, 1.56 mM galactose and 1,56 mM raffinose. BMooL activity is a Ca²+dependence since EDTA and EGTA inactivated the lectin induced hemagglutination. Subunits association is a fundamental condiction for the hem agglutination activity of the lectin, since when reduced by DTT, BMooL have no effect on trypsined human erythrocytes. The detennination of BMooL aminoacid composition showed that it have a high content of acidic residues such as Asx (14%), Glx (13%) and Lys (8%) and non-polar amino acids as Leu (8,1 %). On collagen-induced platelet aggregation assays with human plasma, 40,0 ug/ml lectin showed no significant modulation in the platelet. The role of these lectins in the snake venoms remains unc1ear, the hemagglutination activity does not direct reflect the function of these proteins. Strucutural and other biological activities studies are needed for a more detailed understanding about the carbohydrate-Iectin interactions, which take part in the majority of the biological interactions described up to now / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T04:47:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CarolineRibeirodeBorja_M.pdf: 5449096 bytes, checksum: 7eb8220b0b381160bd94216b8f82b5fd (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O objetivo desta pesquisa foi comparar a neurotoxicidade de dezesseis lotes de venenos de B. neuwiedi, sendo sete procedentes de São Paulo, oito do Rio Grande do Sul e um de Minas Gerais, visando verificar a existência de um lote de veneno mais ativo, do qual se isolaria parcialmente o componente neurotóxico. Para avaliar a atividade neurotóxica dos vários venenos estudados, foi realizado um 'screening', utiljzando-se a preparação biventer cervicis de pintainho sob estimulação elétrica indireta. Avaliou-se também o efeito do veneno mais ativo sobre o músculo de ave sob estimulação elétrica direta, bem como sobre a preparação nervo frênico-diafragma de camundongo submetida a estimulação direta e indireta. Nesses casos a preparação foi previamente curarizada. Os diversos lotes de veneno foram comparados também por meio de eletroforese (PAGE-básica). O lote que apresentou efeito neuromuscular mais acentuado foi fracionado por meio de cromatografia líquida. Realizou-se, em seguida, o ensaio das frações resultantes nas preparações neuromu..sculares de ave e camundongo. Os venenos de B. neuwiedi exibiram diferenças notáveis quanto a sua atividade bloqueadora neuromuscular e, de modo geral, os venenos procedentes do Estado de São Paulo e o de Minas Gerais mostraram-se mais ativos que as amostras oriundas do Rio Grande do Sul. Apesar da diversidade demonstrada (2 o que indicou sua miotoxicidade. Quatorze entre os dezesseis lotes preservaram a resposta contraturante à ACh em doses inferiores a 50 ~g/ml (10 e 20 ~g/ml), ainda que na eminência do bloqueio, indicando a integridade dos receptores nicotínicos pós-sinápticos. Os padrões eletroforéticos de 5 entre os 6 venenos mais ativos apresentaram uma banda de caráter básico que não estava presente nos demais venenos. O veneno mais potente também foi eficaz em inibir a resposta contrátil a estímulo elétrico direto e indireto do músculo de camundongo, bem como a contração a estímulo elétrico direto em músculo de ave. Seu efeito bloqueador foi significantemente diminuído a 24°C ou na ausência de cálcio; nessa condição, não houve inibição da resposta ao 1<. Sob estimulação indireta, a preparação de pintainho foi mais sensível à ação do veneno do que a de camundongo; na exposição à estimulação direta, observou-se o inverso. Após o fracionamento, a atividade neuromuscular foi recuperada nos picos 2 e 3 do perfil cromatográfico. Essas frações causaram bloqueio mais intenso do que o produzido pelo veneno bruto, com total manutenção da resposta ao agonista. Enquanto o pico 2 bloqueou totalmente a contratura à adição de 1<, o pico 3 causou somente uma inibição parcial da mesma, sugerindo que a miotoxicidade esteja mais concentrada no pico 2. Em temperatura ambiente (24°C), a atividade neuromuscular de ambas as frações ativas foi reduzida e seu efeito inibidor sobre a resposta ao ~ foi abolida. Os resultados apresentados corroboram as suposições de que o veneno de B. neuwiedi age preferencialmente em sítios pré-sinápticos, além de possuir atividade sobre a membrana muscular, e que essas ações estão relacionadas com sua atividade enzimática. Sugere-se ainda que essas ações podem variar de acordo com a procedência do veneno e que são devidas a componente( s) neurotóxico(s) e/ou miotóxico(s) / Abstract: The venoms showed notable differences regarding their neuromuscular The objective of this research was to compare the neurotoxicity of B. neuwiedi venoms from São Paulo, Rio Grande do Sul and Minas Gerais States, aiming to the partia I isolation of the neurotoxic component from the more active crude venom. To evaluate the neurotoxic activity of the studied venoms we carried out a screening using the indirectly stimulated chick biventer cervicis preparation. We evaluated also the effect of. the more active venom on directly stimulated chick muscle and on the directly and indirectly stimulated mouse phrenic nerve diaphragm preparation. In these cases, the muscle was previally curarized. The various crude venoms were also compared by electrophoresis. The more active venom was fractionated by molecular exclusion. Afterwards, we carried out the assay of the resulting fractions in chick biventer cervicis preparation. blocking activity and the venoms from São Paulo and Minas Gerais States were more active than those from Rio Grande do Sul. In spite of the evident diversity (2 90% of blockade at 20 llg/ml), ali the venoms induced dose-dependent and irreversible blockade, besides contractures, and inhibited the response to KCI. Fourteen out of sixteen venoms preserved ACh response at concentrations up to 20 llg/ml, after 120 min of incubation, even when blockade persisted. The Our results confirm the previous assumption that B. neuwiedi venom acts electrophoretic patterns showed a band that was present only in some of the six more active crude venoms. The other venoms didn't showed that bando The more potent venom inhibited the directly and indirectly stimulated mouse muscle as well as the directly stimulated chick muscle. At room temperature or in the absence of Ca++, the effect on evoked twitch-tension and KCI response was significantly reduced. Under indirect stimulation, chick muscles were more sensitive to venom activity than mouse preparations; under direct stimulation, mouse muscle was more sensitive. After fractionation, the neuromuscular activity was recovered in fractions P2 and P3, corresponding to p~aks 2 and 3 of the elution profile. These fractions induced a higher and faster twitch-tension blockade than crude venom, with total maintenance of ACh response. While P2 blocked totally the contracture to K", P3 caused a partia I blockade. At room temperature, the effect of both active fractions on twitch-tension and KCI response were reduced preferably at presynaptic sites, and at muscle cells. These actions are probably related to its enzimatic activity and they can vary according to the venom origino The venom neuromuscular activity is presumely due to one or more neurotoxic components that correspond to peaks 2 and 3 of the elution profile / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: Lucilene Delazani dos Santos / Banca: Carlos Antônio Caramori / Banca: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Resumo: INTRODUÇÃO: A cirrose é o estágio final da doença hepática. Causada principalmente pelas hepatites virais e ingestão de álcool, o único tratamento específico atual é o transplante O projeto Global Burden of Disease (GBD) publicou recentemente na BMC Medicine uma nova avaliação da mortalidade pela cirrose. Vários métodos e fontes de dados levaram a estimativa global de pouco mais de um milhão de mortes em 2010, cerca de 2% de todas as mortes. Nos últimos anos, as pesquisas biotecnológicas favoreceram a descoberta da terapia alternativa para cirrose usando células tronco. Estas geraram grande expectativa na regeneração tecidual e sua aplicação no tratamento. Um dos grandes desafios enfrentados foi sua reduzida fixação das células no fígado, com dispersão para todo organismo e sem a efetividade esperada. As metodologias ainda não encontraram uma maneira eficaz de impedir que estas células difundam para os outros órgãos diminuindo sua eficácia pretendida. OBJETIVO: Avaliar o selante de fibrina derivado da peçonha de serpente (SFDPS) como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) em fígados cirróticos. MÉTODOS: O modelo de cirrose experimental em ratos foi induzido pela tioacetamida (C2H5NS), aplicada duas vezes por semana por via intraperitoneal (i.v.) na dose de 200mg/kg. A coleta de sangue foi realizada uma vez por mês para as analises bioquímicas. O isolamento das células tronco foi realizado de acordo com Gasparotto et al., 2014. A marcação para citometria foi realizada em segunda passagem com os marcadores RT1 AW2 FITC, CLASS RT1 PE, CD11b, CD44, CD90, CD34, CD105, CD73, CD45, ICAM. A biomarcação da serinoprotease, um dos componentes do selante, foi realizada com o kit Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (A30006v). A cirurgia foi realizada sob anestesia inalatória com isoflurano; os animais foram selecionados aleatoriamente em três grupos os quais receberam o tratamento especificado. Na... / Abstract: Introduction: Cirrhosis is the final stage of liver disease mainly caused by viral hepatitis, alcohol intake, and currently it can only be reversed by liver transplantation. In a new assessment of mortality of liver cirrhosis by design Global Burden of Disease (GBD) in the BMC Medicine, a variety of methods and data sources has led to an overall estimate of just over a million deaths in 2010, which was about 2% of all deaths. In recent years, research has intensified on biotech issues, favoring therapeutic discovery of stem cells to cirrhosis, which have generated great expectations in tissue regeneration of the liver and its application. However, a major problem faced was its low setting in cirrhotic liver, with spread to the whole body and without the expected effectiveness. The investigations have not yet found a way to effectively prevent stem cells spread to other organs reducing their effectiveness regeneration. AIM: Evaluate the fibrin glue derived from snake venom (SFDPS) as a scaffold for stem cells in cirrhotic livers. Methods: The model of experimental cirrhosis in rats was induced by Thioacetamide (C2H5NS), twice per week intraperitoneally (iv) at 200 mg / kg. The of blood collection was performed for biochemical analysis in B200 equipment. Isolation of stem cells was performed according Gasparotto et al. 2014. The markup for cytometry was performed on the second pass with markers RT1 AW2 FITC, CLASS RT1 PE, CD11b, CD44, CD90, CD34, CD105, CD73, CD45, ICAM. The biomarker of serine protease was performed with Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (A30006v) kit. The surgery has been realized with inhalational anesthesia, the animals were separated into three groups where they received the treatment selected. Histology of 5μm sections were hematoxylin and eosin for staining (HE) and Picrosirius. Immunostaining was performed according to kit Click-it ® Imaging kits EdU. RESULTS: The development of cirrhosis was macroscopically ... / Mestre

Resumo: O veneno de Bothrops jararaca é constituído de misturas complexas de toxinas e entre os principais componentes estão as lectinas, metaloproteinases, serinoproteinases, desintegrinas, fosfolipases e os peptídeos. Esta composição pode variar de acordo com a idade, o sexo e a região da serpente. Este trabalho avaliou a variação individual do veneno de Bothrops jararaca da região de Botucatu - São Paulo, por meio da sua caracterização enzimática, bioquímica e farmacológica. Foram utilizados testes in vitro e ensaios biológicos. As atividades dos venenos foram comparadas ao Veneno Referência Nacional. A dosagem protéica apresentou variações entre os grupos de serpentes adultas (80% proteínas) e filhotes (40% proteínas). O perfil eletroforético apresentou perfis similares, geralmente com massas moleculares de 50 a 25 kDa, porém com variações intraespecíficas. O RP-HPLC revelou variações na concentração das proteínas. Na atividade coagulante não houve variação entre os grupos formados por adultos, no entanto, houve uma grande variação entre os grupos de filhotes e Veneno Referência Nacional, sendo estes mais coagulantes. A atividade hemorrágica mostrou maior atividade nos venenos de animais adultos, principalmente em machos recém chegados da natureza. Entretanto, os filhotes mantidos em regime de cativeiro apresentaram valores elevados, ficando muito próximos aos valores obtidos de machos adultos. Na atividade edematogênica, verificou-se um aumento do edema em todos os grupos de estudo não sendo possível avaliar se houve uma variação ontogenética entre os grupos estudados. Na dose letal média (DL50) houve uma grande variação de toxicidade em relação aos venenos, sendo as fêmeas cativas, três vezes mais tóxicas comparadas aos filhotes. Os resultados deste estudo ilustram a complexidade intra e interespecífica presentes em venenos de serpentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops jararaca venom comprises a complex mixture of toxins. Among its main components are: lectins, metalloproteinases, serine proteinases, disintegrins, phospholipases, and peptides. The venom composition can be present age, sex and region variation. This present study evaluated the individual variation of Bothrops jararaca venom in Botucatu region, São Paulo state, through enzymatic, biochemical and pharmacological characterizations of snake venoms which employed in vitro techniques and in vivo analysis. Venoms actions were compared with those of the National Venom Reference. Protein dosage varied between adult (80% proteins) and newborn (40% proteins). The electrophoretic profiles were similar, usually presenting molecular masses from 25 to 50 kDa; however, intraspecies variations were present. Due to the complexity of the technique, it was not possible to detect the individual chromatographic variations by means of RP-HPLC revealed individual protein variations on venom composition. There was no variation in the coagulant activity among adult groups; however, a great variation was observed between newborn groups and the National Venom Reference, the latter showing higher coagulant activity. Venoms from adult animals revealed greater hemorrhagic activity, mainly in newly captured males. Nevertheless, newborn kept in captivity also presented elevated hemorrhagic activity, close to that of adult males. Regarding the edematous activity, there was edema increase in all studied groups, therefore, it was not possible to evaluate if ontogenetic variations were present among studied animals. Concerning the median lethal dose (LD50), a great variation in venom toxicity was observed and captive females were three times more toxic when compared to newborn. Our findings showed the intraand interspecies complexity of snake venoms possibly represented by ontogenetic, sexual and environmental... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Rui Seabra Ferreira Júnior / Coorientador: Andreimar Martins Soares / Banca: Daniel Carvalho Pimenta / Banca: Patrick Jack Spencer / Mestre

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Adélia Cristina Oliveira Cintra / Banca: Jose Ramon Abrego / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: Um certo número de proteínas do veneno foram purificadas, caracterizadas e as suas estruturas foram determinadas para delinear as suas especialidades. (a) A LAAO de Bothrops jararacussu indicou uma maior especialidade para os resíduos hidrófobos, devido a uma substituição de Trp430por lle. O FAD ligado estava em uma conformação diferente do relatado em outros estudos. (b) O domínio rico em cisteína da metaloproteinase (MP III) de Bothrops moojeni pode adotar diferentes orientações relativas. (c) O local de distribuição de carga de serino proteinases é fundamental para determinar a especificidade da enzima. (d) A conformação tetramérica da Lys49 PLA2 de Bothrops brazili indica coexistência de dois estados diméricas. (e) A adição de uma segunda ponte dissulfeto estabiliza o loop catalítico e Trp 230 adota uma conformação diferente na ligação do substrato. Estes resultados contribuem para melhorar a nossa compreensão do modo de ação e função dessas proteínas / Abstract: A number of venom proteins were purified, characterized and their structures were determined to delineate their specificities. (a) The LAAO from Bothrops jararacussu indicated a higher specifity for hydrophobic residues due to a substitution of Trp430 by lle. The bound FAD was in a diferente conformation to that reported in other studies. (b) The cysteine rich domain of the metalloproteinase (MP III) from Bothrops moojeni can adopt different relative orientations. (c) The local charge distribution of serine proteinases is instrumental in determining enzyme specificity. (d) The tetrameric conformation of the Lys49 PLA2 from Bothrops brazili indicates coexistence of two dimeric states. (e) The addition of a second disulphide bridge stabilizes the catalytic loop and Trp 230 adopts a different conformation on substrate binding. These results contribute to improve our understanding of the mode of action and function of these proteins / Doutor

Orientador: Márcia Gallacci / Banca: Selma Maria Michelin Matheus / Banca: Yoko Yoshima-Franco / Resumo: Os acidentes botrópicos representam cerca de 87% dos envenenamentos ofídicos registrados no Brasil e se destacam pelas graves seqüelas que limitam a vida do acidentado. O principal efeito tóxico local destes é a mionecrose, que pode levar à perda tecidual permanente e à amputação. A mionecrose pode ser decorrente da isquemia do tecido muscular, causada por fatores hemorrágicos presentes nestes venenos (metaloproteases), ou da presença de miotoxinas (PLA2s) que afetam diretamente o tecido muscular. O método mais eficaz para o tratamento dos envenenamentos ofídicos é a soroterapia passiva. No entanto, esta é limitada devido à relativa ineficácia do soro em neutralizar a mionecrose dos venenos botrópicos, além de muitas comunidades não terem acesso à soroterapia. Estes fatores conduzem a busca de métodos alternativos, como o uso de extratos vegetais. Evidências mostram que o extrato aquoso da Casearia sylvestris, conhecida popularmente como "guaçatonga, é capaz de neutralizar efeitos tóxicos de venenos brutos e de suas miotoxinas isoladas. A Casearia sylvestris apresenta diversos outros efeitos terapêuticos como: anti-séptico, antiinflamatório, anestésico local, anti-tumoral, anti-úlcera e cicatrizante. Devido à escassez de estudos experimentais para avaliar a eficácia de extratos vegetais na redução dos danos locais ocasionados pelo envenenamento botrópico, torna-se importante avaliar a potencial atividade antiofídica da Casearia sylvestris. O presente estudo teve por objetivo investigar o uso do extrato aquoso da Casearia sylvestris, como terapêutica tópica dos efeitos locais do envenenamento botrópico experimental em camundongos. Foi avaliada a capacidade do extrato bruto da planta em neutralizar a mionecrose induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu e/ou acelerar o processo de regeneração... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops accidents represent about 87% of snakebites recorded in Brazil and account for serious the consequences that affect the life of the victim with social and economic repercussions. Its main toxic effect is myonecrosis, which can lead to permanent tissue loss and amputation. Myonecrosis may result from muscle tissue ischemia, hemorrhage caused by factors present in these venoms (metalloproteases), or the presence of myotoxins (PLA2s) that directly affect muscle tissue. The most effective treatment is passive serotherapy. However, this is limited due the relative ineffectiveness of the serum to neutralize the myonecrosis of Bothrops venoms and the lack of access to serotherapy by many communities. These factors lead to alternative methods such as the use of plant extracts. Evidence shows that the aqueous extract of Casearia sylvestris, known popularly as "guaçatonga", is able to neutralize the toxic effects of venom and their crude myotoxins isolated. Casearia sylvestris presents several other therapeutic effects such as, antiseptic, antiinflammatory, local anesthetic, anti-tumor, anti-ulcer and wound healing. Due to the scarcity of experimental studies to evaluate the efficacy of plant extracts in reducing the harm caused by Bothrops envenomation, it is important to evaluate the potential activity of antiophidic Casearia sylvestris as a complement to conventional serum therapy. The present study aimed to investigate the use of aqueous extract of Casearia sylvestris, topical therapy as complementary to local effects of Bothrops envenomation in experimental mice. We evaluated the ability of the crude extract of the plant to neutralize myonecrosis induced by the venom of Bothrops jararacussu and / or accelerate the process of muscle regeneration. The onset of myonecrosis and the regenerative process... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) é constituído pelas toxinas: Crotoxina, Crotamina, Giroxina e Convulxina. A crotamina possui ação miotóxica, sendo que esta toxina pode ser expressa ou não por animais de uma mesma região. Variações bioquímicas, enzimáticas e farmacológicas dos venenos, podem estar associadas a fatores geográficos, clima, sexo, idade, dieta, bem como tempo decorrido de cativeiro e entre extrações. Esta pesquisa teve como objetivo caracterizar o veneno de C.d.t, da micro-região de Botucatu (São Paulo) pela determinação de suas propriedades bioquímicas, farmacológicas e enzimáticas. Para isto, foi realizada a comparação de venenos de serpentes recém capturadas da natureza com o de cativeiro, para verificar a influência da variação sexual, ambiental (tempo de cativeiro) e ontogenética na sua composição. Foram utilizadas técnicas de dosagem protéica, eletroforese (SDS-PAGE), perfil cromatográfico (HPLC-RP), atividade coagulante e índice de coagulação, atividade proteolítica sobre a caseína, tóxica(DL50) e atividade da crotamina. As atividades das 93 amostras de veneno foram comparadas com as do Veneno Referência Nacional. A dosagem protéica não evidenciou variação entre os grupos formados por adultos (75%), mas mostrou diferença quando comparada a do grupo de filhotes (60%). A análise eletroforética (SDS-PAGE 15%) evidenciou que a variação da presença da crotamina não teve relação com a distribuição dos grupos, sendo que 65% das amostras foram crotaminanegativa. O perfil cromatográfico corroborou os resultados da eletroforese, a respeito da variação da crotamina, mostrando grandes variações nas concentrações das proteínas, além de evidenciar grande quantidade de isoformas de crotoxina. Na caracterização coagulante dos venenos, não houve variação entre os grupos formados por adultos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) venom is composed by the following toxins: crotoxin, crotamine, gyroxin and convulxin. Crotamine possess a myotoxic action that can be expressed or not by snakes from the same region. Biochemical, enzymatic and pharmacological variations of venoms may be associated with geographic factors, climate, gender, age, and diet as well as length of captivity and venom extractions. The present study was carried out in order to characterize the C.d.t. venom of Botucatu micro-region, São Paulo State, by defining its biochemical, pharmacological and enzymatic properties. A comparative characterization of venoms from newly captured snakes and already-captured animals was performed to verify the sexual, environmental (length of captivity) and ontogenetic variations that influence the venom composition. Protein concentration, electrophoresis (SDS-PAGE), chromatographic profile (RPHPLC), coagulant activity and coagulation index, proteolytic activity upon casein, toxic (LD50) and crotamine activity were employed. The venom activities of 93 samples were compared with the National Reference Venom. Protein concentrations did not evidence a variation among the groups of adults (75%), but revealed some difference when compared with newborn groups (60%). The electrophoresis analysis (SDS-PAGE 15%) presented a crotamine variation that had no relation with the distribution of groups, which showed that 65% of the samples were crotamine negative. The chromatographic profile confirmed the results of electrophoresis regarding crotamine variation, and also showed great variation in the protein concentration, besides revealing a high quantity of crotoxin isoforms. Concerning coagulant characterization, there was no variation among adult groups; however, the National Reference Venom and newborn groups presented higher coagulant activities. Toxic (LD 50) and proteolytic activicties... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Coorientador: Andreimar Martins Soares / Banca: Daniel Carvalho Pimenta / Banca: Patrick Kack Spencer / Mestre