Orientador: William Dias Belangero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:27:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LinoJunior_Waldo_M.pdf: 6533027 bytes, checksum: 2141370856b382ccf5dcdeb120023dd2 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os autores estudaram os efeitos do laser Hóhnio:Ítrio-Alumínio-Granada (Ho:Y AO) sobre as dimensões do tendão (comprimento e largura proximal e dista!) e sobre a celularidade e arranjo das fibras de colágeno em 20 ratos adultos, machos, brancos (Rattus Novergicus) da variedade Wistar. Os animais foram divididos em dois grupos de acordo com o tempo de seguimento (12 e 24 semanas) e de acordo com a forma de aplicação do laser (contínua e em dois pontos). Utilizou-se aparelho de Laser de Hóhnio (pulsá til, estado sólido, com ondas de 2,1 microns, com potência de 40 Watts, ponteira OmniTip de 30<]. Após o sacrificio, foram comparadas, por meio de testes não paramétricos (considerando p = 0,05), as medidas do comprimento e da largura (proximal e dista!) dos tendões do lado operado e do lado não operado. A medida do comprimento do lado operado foi significativamente maior nos dois grupos de seguimento, quando comparada com o lado não operado, porém, não houve diferença significativa dessas medidas em função do tipo de aplicação do laser. Do mesmo modo, a medida da largura, tanto na região proximal quanto distal, foram significativamente maiores no lado operado nos dois grupos de seguimento, sem apresentar diferença significativa em função do tipo de aplicação. Quando se compararam as medidas nos dois grupos de seguimento, o comprimento e a largura dista tenderam a ser maiores após 24 semanas, enquanto que a largura, na região proximal, foi significativamente maior nesse grupo. Quanto à avaliação microscópica subjetiva, tanto nos cortes longitudinais como transversais, pôde-se verificar aumento do número de fibroblastos, principalmente no tendões não operados. Na região entre os fascículos, o tecido conjuntivo era exuberante no grupo com 12 semanas, com neoformação vascular evidente. À microscopia de luz polarizada, no grupo com 12 semanas;, foram encontradas regiões onde as fibras de colágeno apresentavam hialinização, mescladas com regiões onde as fibras estavam regeneradas, dispostas de forma não paralela com o longo eixo dos tendões. No grupo de 24 semanas, as fibras de colágeno se apresentavam com disposição regular e paralela ao longo eixo do tendão / Abstract: The authors have studied the effects of Holmium:Yatriurn-Alurninum-Grenade (Ho:Y AO) laser on tendon sizes (proximal and distal length and width) and on the cellularity and arrangement of collagen fibers in 20 Wistar variety, male, white, adult rats (Rattus Novergicus). The animaIs have been divided into two groups, according to the follow-up time (12 and 24 weeks) and pursuant to the for form of laser application (continuous or two-point). A Holmiurn laser (pulsed, solid state, 2.1 micron waves, 40 watts, OmniTip 30° tip) apparatus was used. Afier the animaIs were sacrificed, the proximal and distallength and width ofthe operated size of such rats were compared to those ofthe non-operated size by means ofnon-parametric testing (considering p = 0,05). The length in the operated size was significant1y bigger for both follow-up groups, when compared to the length of the non-operated size, however there was no significant difference in such measures in function of the type of laser application. In the same manner, the width, both in the proximal and distal regions, was significant1y bigger in the operated size in both follow-up groups, without showing any significant difference whatsoever in function of the type of application. When the measures in both follow-up groups were compared, distallength and width showed a trend to become bigger afier 24 weeks, while width in the proximal region was significant1y bigger in this group. As for the subjective microscopic evaluation, both in longitudinal and cross sections, it was possible to observe an increase in the number of fibroblasts, mainly in the 12-week group. The average fibroblast concentration in the tendon with 24-week follow-up was deemed to be intermediate between the 12-week group and non-operated tendon. The conjunctive tissue was exuberant in the region amidst the fasciculi for the 12-week group, with evident vascular neoformation. At the examination with po1arized microscope, in the 12-week group, regions were found where collagen fibers showed hyalinization, mixed with regions where fibers were regenerated, arrange in a non-parallel pattem in relation to the long tendon axIe. In the 24-week group, collagen fibers were regularly arranged, parallel to the tendon axIe / Mestrado / Cirurgia / Mestre em Cirurgia

Orientador: Maria Lucia Furlan Wada / Texto em ingles e portugues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T20:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Haas_VeradaRosa_M.pdf: 5069943 bytes, checksum: 4bd884484141aaef6d2214bdb72ce74a (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: As células Vero, uma linhagem estabelecida a partir de células renais de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops), foram mantidas utilizando a técnica de cultivo em sanduíche. Dois tipos de sanduíche foram utilizados vidro/colágeno e colágeno/colágeno, com 10% e 20% de soro feta! bovino (SFB), com o objetivo de se verificar o comportamento das células Vero neste método de cultivo. As células foram avaliadas quanto a morfologia utilizando-se a coloração com hematoxilina-eosina (HE), citoquimicamente por meio de azul de toluidina pH 4,0 (A T) e xylidine Ponceau pH 2,5 (XP), e imunocitoquimicamente com anticorpos anti-colágeno IV e anti-Iaminina. As células cultivadas durante um período de 7 dias, no sanduíche vidro-colágeno com 10% e 20% de SFB cresceram em ambos os substratos. As células que permaneceram sobre o vidro apresentaram morfologia variada com predomínio de células alongadas, sendo que em vários locais as lamínulas não apresentavam células mostrando que as mesmas foram capazes de migrar contra a força da gravidade em direção à matriz colagênica. Essas células que migraram para o colágeno I apresentaram formato alongado ou arredondado, sendo que este último predominou quando houve infiltração para o interior do gel colagênico. Observou-se também a contração do mesmo, ou seja, a redução do tamanho e a formação de dobras no gel de colágeno. Nas regiões onde as células não infiltraram, estas cresceram formando uma lâmina basal. No cultivo com a técnica de sanduíche colágeno/colágeno as células aderiram, proliferaram e infiltraram no colágeno existente abaixo e sobre as células, apresentando alterações na forma celular, caracterizando um processo de diferenciação induzido pelo substrato. O colágeno apresentou contração nas duas camadas do sanduíche. Nas regiões em que não houve infiltração das células Vero para o interior do gel, houve a formação de um tecido com características semelhantes as de um epitélio, com produção de uma lâmina basal, sendo este resultado igual ao observado no sanduíche vidro/colágeno. Na análise cito química, as células Vero, em ambos os sanduíches, quando coradas com A T mostraram núcleos, nucléolos e citoplasma basófilos e em algumas regiões evidenciou-se grânulos basófilos no meio extracelular. Quando as amostras foram coradas com XP , as células Vero apresentaram intensa coloração vermelho-alaranjado, onde pôde ser visualizada uma região acelular mais intensamente corada, entre as células e o colágeno, representando uma lâmina basal, que em algumas regiões era evidente e em outras não. Nesta região, os resultados imunocitoquímicos confirmaram a presença de uma membrana basal rica em colágeno IV e laminina. Tendo por base estes resultados, conclui-se que as células Vero apresentam comportamento similar quando cultivados sobre o colágeno ou quando cultivadas pela técnica de sanduíche. As células em contato com o colágeno diferenciaram-se e passaram a exibir características de um tecido epitelial, inclusive com a formação de uma lâmina basal, ou se infiltraram para o interior do gel colagênico. O comportamento celular é similar quando se usa 10% ou 20% de SFB no meio de cultivo, sendo que neste último caso, a formação de uma membrana basal foi mais evidente e ocorreu menor infiltração das células para o interior do gel / Abstract: Vero cells were cultured using the sandwich technique. Two sandwich types, the glass/collagen and collagen/coUagen variations, were used with 10% and 20% fetal calf serum (FCS), intending to define Vero cell behavior in these conditions. The cells were morphologically analyzed with hematoxilin-eosin staining, while cytochemical information was obtained with Toluidine blue at pH 4.0 (TB) and xylidine Ponceau at pH 2.5 (XP), and immunocytochemical data with anti-coUagen IV and anti-Iaminin antibodies. Cells cultured in the glass/collagen sandwich with 10% and 20% FCS grew on both substrata after 7 days. The cells on the glass surface had varied shapes but were predominantly elongated. In some regions of the coverslip, there were no ceUs, showing that these were able to migrate against gravity into the collagen covering. The migrated cells were elongated or rounded, with a greater number of rounded cells as they moved into the collagen I gel. The contraction, seen as folding and shrinkage of the collagen gel, was observed in this case. In the regions where cells did not penetrate the collagen layer, a basal lamina was produced. During cultivation in the collagen/collagen sandwich, the cells adhered, proliferated and infiltrated into the upper and lower gels, resulting in altered shapes, typical of substrate induced differentiation. Both collagen substrata contracted. In regions where cells did not penetrate the collagen layer, they formed a separating basal lamina as observed in the glass/collagen sandwich. Cytochemical analysis in both types of sandwich, with TB staining showed basophilic nuclei, nucleoli, and cytoplasm. In some regions, there were also extracellular vbasophilic granules. When the samples were XP stained, the Vero cells were stained strongly orange-red, bordered by a more intensely staining, acellular basallamina, although this layer was not always present. In the basal lamina, the presence of collagen IV and laminin was immunocytochemically confirmed. With these results, it can be concluded that Vero cells behave similarly when cultured on collagen or with the sandwich technique. Vero cells in contact with collagen undergo differentiation, expressing epithelial cell characteristics, including the formation of a basal lamina, or they may infiltrate into the collagen gel. Cell behavior is similar when 10% or 20% FCS is added to the culture medium, although the basal lamina is more evident, and there is less cellular penetration into the collagen in the higher serum concentration / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T21:20:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daltro_DulceMaria_M.pdf: 16766186 bytes, checksum: 0cec58433347baf2ce2f5c5ebeffb473 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: O objetivo do presente trabalho reside no estudo das respostas da matriz extracelular às injeções intradérmicas de colágeno heterologo e avaliação do efeito de pré-tratamentos físicos e químicos dispensados ao material injetável nessas respostas. Para tanto, injetou-se colágeno I bovino em forma de gel, gel formolizado e ainda solução de colágeno liofilizado em camundongos que foram sacrificados após decorridos diversos intervalos de tempo desde a aplicação das injeções, sendo os cortes histológicos submetidos a uma série de técnicas gerais e citoquímicas. A observação microscopica desses cortes permitiu observar que quaisquer que tenham sido os tratamentos prévios, as reações aos implantes se caracterizam inicialmente por invasão de neutrofilos, seguida por macrofagose fibroblastos, apos o que se inicia uma fase de síntese de gllcosaminoglicanas e colágeno, seguida por processos de vascularização dos implantes e remodelação tecidual. Não foram evidenciados quasquer sinais de toxicidade ou reação imunológlica aos implantes dérmicos de colágeno heterólogo. Verificou-se ainda que o colágeno sujeito à radiação e agitação mecânica vigorosa apresenta maior susceptibilidade à degradação, enquanto a ligação com formaldeído confere resistência ao ataque enzimático, embora cause perda de elasticidade do implante. Constatou-se ainda uma elevação do numero de mastócitos nas proximidades dos implantea por volta do 30. dia, sugerindo sua participação no processo de remodelação do tecido neo formado. A nível de organização molecular, foi constatado um aumento de birrefringência com o decorrer do tempo pos-implante, provavelmente devido ao realinhamento das fibras e conjugação de colágeno com glico- saminoglicanas no interior do material implantado / Abstract: In the present work the extracellular matrix responses to intradermic heterologous collagen injections and the evaluation of the effects of the injected material physically and chemically treated were studied. Mice were injected with type 1 bovine collagen (gel, gel formolized and lyophyllized collagen solutions) and sacrificed at different intervals of time thereafter. The histologic preparations were processed and a series of routine and citochemical techniques and microscope observations were performed. The tissue reaction to the implanted material in all treatment cases was outlined by neutrophil lnvasion, followed by the macrophage and fibroblasts, and afterwards by glycosamlnoglycans and collagen synthesis phase, wlth further vascularization process of the implant and tissue remodeling. No toxicity signs or immune reaction to the heterologous collagen dermic implants was verified. The radiation and the vigorous mechanical shaking treatments in the case of lyophyllized collagen resulted in a higher susceptibllity to degradation of collagen. The formaldehyde treatment resulted in enzimatic attack resistent collagen, although the implant elasticity was lost. The increase of mast cells number in the implant surroundings was detected by the 30th. day, suggesting their participation in the remodeling process of the neonate tissue. Regarding the molecular organization, the increase of the implant birefringence was noted, probably due to the fibers realignment and to the collagen glycosaminoglycans hinding in the interior of the implanted material / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Maria Lucia Furlan Wada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T20:56:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria_SilvyaStuchi_M.pdf: 9539697 bytes, checksum: 138a555d1e996f9cc1fcc64a0b22116f (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: O colágeno é amplamente utilizado como substrato para adesão e proliferação de células in vitro. Os substratos à base de colágeno podem ser preparados de formas variadas, podendo-se obter filmes secos de colágeno, gel flutuante ou estruturas tridimensionais. Diversos tipos celulares, quando cultivados em diferentes substratos de colágeno apresentam variações em suas características morfofisiológicas. Assim, não somente a presença de elementos da matriz extracelular mas também sua organização molecular são importantes para que as células expressem seu genótipo.Outro aspecto relevante sobre o comportamento das células durante a cultura é o fato de contraírem o gel de colágeno, tal como ocorre na derme em processos de cicatrização, fibroses e desenvolvimento do tecido conjuntivo. Em nosso trabalho, tivemos por objetivo estudar o padrão de crescimento e alterações morfofisiológicas de células VelO cultivadas sobre gel de colágeno tipo I. Amostras com 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias de cultivo foram fixadas em Kamovsky e incluídas em Paraplast. Cortes de 5f.U1l foram submetidos às colorações de Hematoxilina­eosina (HE), Azul de toluidina pH 4,0 (AT), Xilidine Ponceau (XP) e PAS. Num outro experimento, foram colhidas amostras com 1, 2, 3, 4 e 5 dias de cultura na ausência e presença de soro fetal bovino, tendo-se medido o diâmetro da face superior do gel, para quantificação da contração. Com 1 dia de cultivo, as células aderiram a superfície do gel e formaram uma monocamada, com morfologia inicialmente arredondada e posteriormente fibroblastóide, apresentando coloração nuclear intensa ecitoplasma meta cromático com AT, núcleo e citoplasma corados com XP e citoplasma corado com P AS. Após 5 dias de cultivo várias camadas de células fibroblastóides são observadas na superfície do gel. Alguns focos de infiltração são observados assim como numerosos grânulos meta cromáticos que são depositados no interior do gel. Estes grânulos também se coravam pelo XP e P AS. Nos tempos posteriores de incubação, a proliferação e infiltração para o interior do gel são mais proeminentes e o padrão de coloração pelos AT, XP e P AS foram mantidos. Aos 20 dias de cultivo o gel assemelha-se a um tecido conjuntivo frouxo, representado por uma grande população de células dispersas numa matriz tridimensioanal finamente fibrilar. Aos 25 dias de cultivo observou-se um aumento do pregueamento da superfície do gel e uma reorganização das fibras do gel de colágeno evidenciadas por XP, caracterizando o processo de contração causado pelas células Vero neste substrato. Neste tempo de cultivo, as células da superfície se apresentam com o mesmo padrão de coloração, porém as células que se infiltram no gel apresentam morfologia senescente caracterizada por fragmentação citoplasmática e picnose nuclear que podem ser observadas até 30 dias de cultivo. No experimento de contração, na presença de soro, as células Vero contraíram o gel cerca de 10% após 1 dia de cultivo. Após 5 dias foi observada uma contração de cerca de 50% , sempre em relação ao diâmetro do gel sem células.Na ausência de soro, com 1 dia de cultivo, as células contraíram o gel em cerca de 7% e aos 5 dias, apenas 15% do diâmetro superior do gel foi contraído. Nossos resultados demonstram que as células Vero aderem, proliferam e infiltram-se no substrato de colágeno, apresentando ao longo do cultivo, alterações na forma celular, caracterizando um processo de diferenciação induzido pelo substrato. As propriedades citoquímicas dos grânulos depositados entre as fibras de colágeno permitem sugerir que sejam compostos por glicoproteínas sulfatadas e/ou carboxiladas. os resultados sugerem ainda que estes grânulos constituam-se de elementos da MEC produzidos e secretados pelas células. As células Vero são também capazes de contrair o gel de colágeno num mecanismo dependente da presença de soro fetal bovino / Abstract: Collagen is widely employed as substratum for cell adhesion and proliferation. Collagen-based substrata may be prepared in different ways, as dry films, floating gel or three dimensional structures. Many cell types undergo morphophysiological alterations when placed on different collagen substrata. Not only the presence but also the organization of individual components of the extracellular matrix are important for cells to assume a given phenotype. Another aspect about the behavior of cultured cells is their ability to contract collagen gels, similarly to process occurrings in the dermis during wound healing, in fibrosis, and in connective tissue development .We have here studied the behavior of Vero cells grown on type I collagen gels. Samples were harvested afier 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 days of incubation, fixed in Kamovsky's fixative and embedded in Paraplast Plus. Sections 5 f-tm thick were obtained, dewaxed and stained with either hematoxilin-eosin (HE), toluidine blue at pH 4,0 (AT), xylidine ponceau (XP) or PAS. Parallel experiments were conducted to evaluate the effect of foetal bovine se rum on the cell's ability to contract collagen gels. The cells first adhered to the gel surface and constitute a monolayer afier 24 hours of culturing. The cells were initially rounded but became fibroblast-like and showed intense nuclear and cytoplasmatic metachromasy. Reactivity with XP was observed in the nuclei and cytoplasm and P AS-positive material accumulated in the cytoplasm. Mer 5 days, the cells were fibroblast-like and grew in multiple layers. Foci of cells invading the gel were observed at this time and numerous metachromatic granules were deposited in the gel. These granules were also XP and P AS positive. Longer periods of cell growth resulted in enhanced proliferation and invasion of the gel, but the staining characteristics were preserved. At 20 days, the cells occupied a large extension of the gel, which showed aspects of loose connective tissue. On the 25th. day, the gel surface is highly folded and XP­ stained collagen fibers were mostly aligned featuring the contraction of the gel by Vero cells.showing contraction of the gel by Vero cells. The cells inside the gel presented aspects of senescense, with cytoplasm fragmentation and nuclear picnosis. These aspects were aIs o observed on the 30th.day. In the presence of serum, the cells contracted the gel in 10% and 50% of its previous length after 1 and 5 days, respectively. Without serum the values were 7% and 15% shorter, after 1 and 5 days, respectively.The results demonstrated that Vero cells adhere to, proliferate and invade collagen gels in vitro characterizes a substratum-induced differentiation processo The cytochemical characteristics of the granules entrapped in the gel indicate that they are constituted by sulphated and/or carboxylated extracellular glycoproteins produced and secreted by the cells. It was also shown that the contraction of the gel is a serum-dependent activity of Vero cells / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Resumo não disponível

Orientador: Antonio Carlos Cicogna / Resumo: A obesidade se associa a inúmeros distúrbios modulados pelo sistema renina angiotensina (SRA) e embora exista uma extensa literatura mostrando a relação entre a angiotensina II e o metabolismo do colágeno miocárdico, não encontramos informações relacionando obesidade por dieta hiperlipídica, saturada, colágenos tipos I e III miocárdico e angiotensina-II. Em razão desta constatação e da associação deletéria entre ácidos graxos saturados e sistema cardiovascular, a proposta deste estudo foi testar a hipótese que a obesidade por dieta hiperlipídica saturada, aumenta os colágenos I e III cardíaco via ativação do receptor AT1 do SRA oriundo do excesso de tecido adiposo. Ratos Wistar machos, com 30 dias, foram randomizados em dois grupos: controle(C; n=30) e obeso (Ob; n=30). Os ratos C receberam dieta normolipídica (DN) e os Ob, dieta hiperlipídica (DH), ambas ricas em ácidos graxos saturados por 30 semanas. Após esse período de intervenção dietética, cada grupo foi randomizado em dois subgrupos: DN e DN+Losartan(Los); DH e DH+Los; os subgrupos DN e DH continuaram recebendo as respectivas dietas durante mais 5 semanas e os grupamentos DN+Los e DH+Los, além do suporte nutricional, foram tratados com losartan, um fármaco antagonista de receptores AT1 na dosagem diária de 30 mg/Kg de massa corporal, portanto, o período total do experimento foi de 35 semanas. Foram avaliados os perfis nutricionais e metabólicos. A avaliação cardíaca foi realizada post mortem por análise macroscópica e molecular, esta última através dos níveis proteicos dos colágenos tipos I e III,inibidores teciduais de MMPs (TIMPs) 1 e 2; e receptor AT1,da concentração da angiotensina II, fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) e da atividade da metaloproteinase (MMP)-2 e da enzima conversora de angiotensina II (ECA). Também foi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Obesity is associated with numerous disorders modulated by renin angiotensin system (RAS) and although there is an extensive literature showing the relationship between angiotensin II and the metabolism of myocardial collagen, could not find information relating obesity by saturated high-fat diet, myocardial collagen I and III and angiotensin-II. Because of this finding and the deleterious association between saturated fatty acids and cardiovascular system, the purpose of this study was to test the hypothesis that obesity by saturated high-fat diet increase myocardial type I and III collagen by activation of AT1 receptor of the reninangiotensin system. Thirty-day-old male Wistar rats were randomized into to two groups: control (C; n=30),fed a standard diet and obese (Ob;n=30),fed a high-fat diet rich saturated fatty acids by 30 weeks. After 30 weeks of dietary intervention, each group were randomized into two subgroups: C and C+Losartan(Los); Ob and Ob+Los; the subgroups C and Ob continued to receive their respective diets for over a five week and the C+Los and Ob+Los groups addition of nutritional support, were treated with losartan, an antagonist drug of AT1 receptors in daily dosage of 30mg/kg body weight. After this period of 35 weeks, it was analyzed nutritional and metabolic profiles. It was analyzed systolic blood pressure (SBP) and structural and molecular studies; the hypertrophy was assessed post-death by macroscopic analysis and the molecular, through protein levels of type I and III collagen, inhibitors of MMPs tissue (TIMPs) 1 and 2; and AT1 receptor, the concentration of angiotensin II, beta transforming growth factor (TGF-β) and activity of metalloproteinase (MMP) -2 and angiotensin II converting enzyme (ACE). Angiotensin- II and activity of ACE in the circulation and visceral adipose tissue was also analyzed. Statistical analysis: ANOVA and... (Complete abstract electronic access below) / Doutor

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El corazón está compuesto por varios tipos celulares, de los cuales aproximadamente el 90% corresponde a cardiomiocitos y a fibroblastos. Los fibroblastos representan 2/3 de la población total de células del corazón y están encargados principalmente del recambio de las proteínas de la matriz extracelular. Este tipo celular puede responder frente a una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y expresan sus receptores, indicativo de una respuesta autocrina. Por acción del TGF-β1 se diferencian a un fenotipo celular altamente secretor de colágeno, el miofibroblasto, principal célula encargada del proceso de cicatrización. Por otra parte, existen antecedentes que demuestran que en fibroblastos cardíacos la activación de las vías transduccionales que conducen a un aumento en los niveles de AMPc contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración y la diferenciación a miofibroblasto. Para estos efectos, el AMPc es crítico debido al rol que juegan dos proteínas que se activan cuando aumentan los niveles de éste; estas son Epac (Exchange protein activated by cAMP/ proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina activada por AMPc) y PKA (proteína quinasa A). Anteriormente se estudió el rol desempeñando por la Epac en los procesos de adhesión y migración de fibroblastos y miofibroblastos, en donde se vio que Epac aumenta la adhesión en ambos fenotipos celulares, y con respecto a migración, se vio que los estímulos que aumentan los niveles de AMPc aumentan la migración en fibroblastos, pero no así en miofibroblastos. Con esto surge la interrogante de saber cómo modula la PKA estos procesos. El objetivo de este trabajo fue determinar el rol que juega la PKA en adhesión, migración y expresión de colágeno. Se utilizaron estímulos que aumentan los niveles de AMPc (isoproterenol y forskolina), el agonista de la PKA 6-Bz-AMPc y su inhibidor H-89. Nuestros resultados mostraron que tanto en fibroblastos como en miofibroblastos, hubo un aumento de la adhesión al estimular con isoproterenol y forskolina, pero con 6-Bz-AMPc no se observó un cambio significativo con respecto al control, aunque sí tendió a disminuir lo que indica que la PKA no regula la adhesión celular. En migración no se observa efecto alguno con el agonista de la PKA y en la expresión de colágeno se vio una disminución con isoproterenol, forskolina, 6-Bz-AMPc y Me-AMPc tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. Conclusión: PKA no interviene dentro de los procesos de adhesión y migración, pero sí lo hace en la expresión de colágeno. / The heart is composed by many types of cells, mainly cardiomyocytes and fibroblasts (almost 90% of total cells). Fibroblasts represent two thirds of the whole heart cell population and are responsible for the constant turnover of extracellular matrix proteins. This kind of cells can respond to many cytokines, growth factors and express their receptors indicating an autocrine answer. By the action of TGF-β1, they can be differentiated into a new phenotype called myofibroblasts, highly secreting of collagen and main cell involved into the healing process. Otherwise, there are numerous reports indicating that in cardiac fibroblasts, activation of signal transduction pathways leading to increased cAMP levels contributes to the reduction of cardiac fibrosis by regulating profibrotic processes like adhesion, migration and myofibroblast differentiation. For these effects cAMP is critical due to the role played by two proteins whose activation depends on the increase in the cAMP levels. These proteins are Epac (Exchange protein activated by cAMP) and PKA (protein kinase A). Formerly it was studied the role played by Epac in adhesion and migration of fibroblasts and myofibroblasts. Epac increased cell adhesion in both phenotypes, and about migration, in fibroblasts this phenomenon was increased with all the stimuli that increased the cAMP levels, whereas in myofibroblasts were no effect. So, we can ask about the role lead by PKA in these processes. The objective in this work was determined which role plays PKA in adhesion, migration and collagen expression. We used stimuli that increase cAMP levels (isoproterenol and forskolin), PKA’s agonist 6-ph-cAMP and its inhibitor H-89. Our results showed that both fibroblasts and in myofibroblasts there was an increase in cell adhesion in response to isoproterenol, forskolin and H-89, but with 6-ph-cAMP no significant change was observed respect control but tended to decrease, indicating that PKA is not involved in cell adhesion. In migration no effect was observed with 6-ph-cAMP, and finally in collagen expression these stimuli decreased the expression (we tried with Epac agonist Me-cAMP too) in both phenotypes. Conclusion: PKA does not intervene in adhesion and migration processes, but it does in collagen expression.

Este estudo avaliou o efeito da carbodiimida (EDC) e da clorexidina (CLX) na longevidade da resistência de união (RU) de cimento resino à dentina radicular e na composição química e estrutura do colágeno de dentes submetidos à radioterapia. 120 caninos superiores foram selecionados e distribuídos em 2 grupos: não irradiados (n=60) e irradiados (30 ciclos de 2Gy, totalizando 60Gy) (n=60). Os dentes foram seccionados, sendo as raízes destinadas à análise da RU e os remanescentes coronários à análise química. 40 fragmentos coronários remanescentes, 20 irradiados e 20 não irradiados, foram seccionados, lixados e polidos para obtenção de blocos de dentina intraradicular (3x3x2mm), distribuídos de acordo com o tratamento da dentina (n=10): CLX 2% e EDC 0,5M. A análise foi realizada em espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) no tempo zero (T0) e após 1(T1), 3(T3) e 5(T5) min de imersão nas soluções para análise das bandas de carbonato (C), amida I (AI) e razão entre as bandas amida III e prolina e hidroxiprolina (AIII/PH). As raízes (16mm) foram instrumentadas com Reciproc (R50) e obturadas com AH Plus. Em seguida, as raízes foram preparadas para pino e redistribuídas de acordo com o tratamento da dentina (n=20): soro fisiológico (SF); CLX 2%; e EDC 0,5M. Após secagem do canal, pinos de fibra de vidro foram cimentados com RelyX U200. Em seguida, obteve-se os slices e, em metade dos espécimes de cada subgrupo (n=10), as análises foram realizadas imediatamente; as demais (n=10) foram armazenadas por 10 meses, para análise da longevidade. O slice mais cervical de cada terço foi submetido ao push-out e padrão de falha (n=10), e o slice mais apical submetido à análise da interface adesiva em microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n=5). Os dados de área das bandas e de RU foram submetidos à análise estatística pelos testes de ANOVA e Tukey, já a adaptação da interface adesiva foi submetida aos testes de Kruskal-Wallis e Duns, e o teste qui-quadrado foi utilizado para avaliar o tipo de falha. Não houve diferença estatística para as áreas das bandas de C; para AI houve diferenças entre os tempos experimentais (P<0,0001) independentemente dos fatores radioterapia e tratamento, em que T3 e T5 apresentaram valores maiores que T0 e T1 (P<0,05); já a razão AIII/PH foi reduzida pela radioterapia (P<0,05), sendo que o EDC aumentou os valores de AIII/PH em T1, T3 e T5 em dentes irradiados (P<0,05), sendo esses valores semelhantes aos dentes não irradiados (P>0,05); já para a CLX os valores de AIII/PH foram menores para todos os tempos experimentais tanto em dentes irradiados como não irradiados (P<0,05). Os dentes irradiados apresentaram menores valores de RU (13,8±4,3) comparados aos não irradiados (18,1±3,1)(P<0,001). Para os dentes irradiados, os valores de RU foram menores para o SF e CLX (P<0,001), sendo que o EDC mostrou valores de RU similares aos dentes não irradiados (P=0,215). Para os dentes não irradiados, os valores de RU foram similares para os dentes tratados com SF, CLX e EDC (P>0,05). Ainda, a RU reduziu após 10 meses para o grupo tratado com SF e CLX (P<0,001), sendo que o EDC manteve os valores (P=0,236), de forma que após 10 meses, o EDC apresentou maior RU que a CLX (P<0,001), sendo a CLX superior ao SF (P<0,001). O terço cervical apresentou maior RU quando comparado ao terço médio (P<0,001), que por sua vez foi maior que no terço apical (P<0,001). O padrão de falhas mostrou ocorrência de falhas coesivas na dentina para os espécimes irradiados, e a análise da interface adesiva em MEV mostrou maior desadaptação nos dentes submetidos à radioterapia, além de fraturas e microfraturas na dentina. Em relação aos tratamentos da dentina, observou-se maior adaptação para o EDC. A radioterapia altera a estrutura secundária do colágeno, resultando na redução da RU e maior desadaptação da interface, sendo que o tratamento da dentina com EDC devolveu a integridade do colágeno, se apresentando como melhor alternativa para tratamento da dentina previamente à cimentação de pinos de fibra de vidro em dentes irradiados e não irradiados, uma vez que contribui para a longevidade da interface adesiva / This study evaluated the effect of carbodiimide (EDC) and chlorhexidine (CHX) on the bond strength (BS) of resin cement to root dentin and on the chemical composition and structure of dentin collagen of teeth submitted to radiotherapy. 120 maxillary canines were selected and distributed in 2 groups: non-irradiated (n=60) and irradiated (30 cycles of 2Gy, total 60Gy) (n=60). The teeth were sectioned, and the roots were used for BS analysis while the remaining coronary was subjected to chemical analysis. 40 remaining coronal fragments, 20 non irradiated and 20 irradiated, were sectioned and polished to obtain 40 intraradicular dentin blocks (3x3x2mm), distributed according to the dentin treatment (n=10): CHX and EDC. The analysis was carried out in Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) before treatment (T0) and after 1 (T1), 3 (T3) and 5 (T5) minute immersion in solutions for the analysis of carbonate bands (C), amide I (AI), and ratio between the amide III and proline and hydroxyproline (AIII/PH) bands. The roots (16mm) were instrumented with Reciproc (R50) and filled with AH Plus. The post space was prepared and the samples were redistributed according to dentin treatment (n=20): saline solution (SF); CHX 2%; and EDC 0.5M. After drying the post space, fiberglass posts were cemented with RelyX U200. Then, slices were obtained and, in half of the specimens of each subgroup (n=10) the analyses were performed immediately; the others (n=10) were stored for 10 months before analysis. The most cervical slice of each third was subjected to push-out and failure pattern analysis (n=10), and the most apical slice submitted to the analysis of the adhesive interface in scanning electron microscopy (SEM) (n=5). The band areas and BS data were submitted to statistical analysis by the ANOVA and Tukey tests, the adhesive interface adaptation was submitted to the Kruskal-Wallis and Duns tests, and the chi-square test was used to evaluate the type of failure. There was no statistical difference for the areas of the C bands; for AI, there were differences between the experimental times (P<0.0001) independent of the radiotherapy and treatment factors, in which T3 and T5 presented higher values than T0 and T1 (P<0.05); the AIII/PH ratio was reduced by radiotherapy (P<0.05), and the EDC increased the AIII/PH values in T1, T3 and T5 in irradiated teeth (P<0.05), with similar values in non-irradiated teeth (P>0.05); for CHX, AIII/PH values were lower for all experimental times in both irradiated and non-irradiated (P<0.05) teeth. The irradiated specimens presented lower BS values (13.8±4.3) than non-irradiated specimens (18.1±3.1) (P<0.001). For the irradiated teeth, the BS values were lower for the SF and CHX (P<0.001), while EDC showed similar BS values to the non-irradiated teeth (P=0.215). For non-irradiated teeth, BS values were similar for teeth treated with SF, CHX, and EDC (P>0.05). Also, the BS reduced after 10 months for the group treated with SF and CHX (P<0.001), while EDC maintained the BS values (P=0.236), wherein EDC presented higher BS values than CHX (P<0.001), and CHX presented higher values than SF (P<0.001). The cervical third showed higher BS values when compared to the middle third (P<0.001), which in turn was higher than in the apical third (P<0.001). The failure pattern showed the occurrence of cohesive failures in dentin for the irradiated specimens, and the analysis of the adhesive interface in SEM revealed worse adaptation in teeth submitted to radiotherapy, in addition to fractures and microfractures in dentin. Regarding the dentin treatments, a better adaptation of the adhesive interface was observed with EDC treatment. Radiotherapy alters the secondary structure of collagen, resulting in the reduction of BS values and worse adaptation of the adhesive interface; and the dentin treatment with EDC returned the collagen integrity, and was the best alternative for surface treatment prior to the cementation of glass fiber posts in non-irradiated and irradiated teeth, since it contributed to the longevity of the adhesive interface

A reconstrução de defeitos ósseos é um problema que afeta milhões de pessoas, que a medicina tenta resolver. Uma alternativa para a solução deste problema tem sido o desenvolvimento de biomateriais que atuem no processo de reparação óssea. O colágeno é um polímero de origem natural capaz de promover cicatrização e regeneração óssea e juntamente com a hidroxiapatita são os principais componentes encontrados no tecido ósseo. Vários trabalhos têm sido reportados com matrizes mineralizadas de colágeno tipo I em diferentes formas como em géis, membranas e esponjas, mas a mineralização in vitro de matrizes acelulares obtidas de tecidos biológicos sem a perda da estrutura colagênica não tem sido descrito. Este trabalho teve como objetivo a mineralização in vitro e a caracterização de matrizes de colágeno aniônico obtidas de pele porcina, pericárdio bovino e serosa porcina. Os tecidos foram tratados em temperatura ambiente com solução alcalina por períodos variáveis de 0 à 96h e mineralizados pelo processo de imersão alternada. Os materiais obtidos foram caracterizados pela avaliação preliminar da citotoxicidade in vitro, termogravimetria (TG/DTG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), microscopia eletrônica de varredura (MEV), dispersão de raios X (EDS), difração de raios X (DRX) e absorção no infravermelho (FT-IR). Não foi observada citotoxicidade em nenhuma das matrizes avaliadas, contudo foi necessário um pré-tratamento nas matrizes de pele porcina para remoção de gordura. Os resultados de DSC mostraram a integridade da matriz colagênica após o tratamento alcalino. O aumento no tempo desse tratamento diminui a temperatura de desnaturação sendo observado um efeito maior nas matrizes de pele porcina seguidas por pericárdio bovino e serosa porcina. A mineralização induz a um aumento na temperatura de desnaturação em todos os casos. As curvas TG apresentaram perdas de massa relacionadas à água presente no material, decomposição da proteína e carbonização do material orgânico e um resíduo após 750 °C que foi associado ao material inorgânico presente na forma de hidroxiapatita, sendo as matrizes de serosa porcina as de maior teor de mineralização. As matrizes mineralizadas tendem a um aumento na estabilidade térmica do colágeno quando comparadas com as matrizes hidrolisadas. Os espectros FT-IR mostraram a presença de íons fosfatos e a interação de íons cálcio com o colágeno. As relações Ca/P obtidas por EDS foram aquelas esperadas em comparação com o valor teórico para hidroxiapatita (HA) e resultados de DRX confirmaram a obtenção de HA amorfa como principal produto de mineralização. Pelas fotomicrografias obtidas por MEV pôde-se observar que as fibras de colágeno tornam-se mais desestruturadas quando há um aumento no tempo de hidrolise e que a deposição de sais ocorreu de forma heterogênea, disposta em aglomerados esféricos no formato de agulhas por toda a superfície e interior, exceto para matrizes derivadas de pele porcina que não são mineralizadas internamente devido a sua espessura. Os resultados obtidos demonstraram que é possível a mineralização in vitro de matrizes de colágeno tipo I obtidas de diferentes tecidos biológicos em diferentes tempos de hidrólise, produzindo um material com potencial de uso para regeneração óssea. / The reconstruction of osseous defects is still a problem that affects millions of people and medicine tries to solve it. One alternative to solve these problems has been the development of biomaterials that can be used as inductors in the osseous repair process. Collagen is a natural polymer able to promote healing and bone regeneration, and among hydroxyapatite (HA) is the main component found in bone tissue. Several mineralized collagen scaffolds are described in literature, in the form of gel, membranes and films, however, in vitro mineralization of acellular matrices, obtained from biological tissues without the loss of collagenic structure, has not been reported. The objective of this work was the mineralization and characterization of anionic collagen matrices obtained from porcine skin, bovine pericardium and porcine serosa. Biological tissues were treated at room temperature for 0-96h in alkaline solution and mineralized by alternate soaking method. Materials were characterized by preliminary assay of in vitro cytotoxicity, differential scanning calorimetry (DSC), termogravimetric analysis (TG/DTG), scanning electronic microscopy (SEM), energy dispersive x-ray analysis (EDS), x-ray diffraction (XRD), and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). No cytotoxicity was observed in any of the evaluated matrices; however, a pre-treatment of porcine skin matrices, for fat removal, was necessary. DSC results showed the integrity of collagen matrices after alkaline treatment. Denaturation temperature is dependent of time of alkaline treatment, and this effect is greater for porcine skin matrix, followed by bovine pericardium and porcine serosa. TG/DTG curves showed weight losses associated with release of water, degradation of protein structure and combustion of residual organic components. Residues were obtained at 750°C and associated to hydroxyapatite, being porcine serosa matrix the most mineralized. All mineralized matrices showed an increase in collagen thermal stability when compared to hydrolyzed matrices. FTIR spectra showed the presence of phosphate ions and the interaction of calcium ions with collagen. Ca/P ratios obtained by EDS were as expected when compared with literature values for HA, and RDX results confirmed amorphous HA as the main mineralization product. MEV analysis showed that collagen fibers were more affected for longer hydrolysis times, and that salt deposition was heterogeneous, with crystals grouped in spherical agglomerates in a needle-like shape throughout surface and inner, except for porcine skin derived matrices that were not internally mineralized due their width. Obtained results demonstrated that in vitro mineralization of type I collagen matrices, using different sources of biological tissues and hydrolysis time was possible, producing a material with potential to be used in bone regeneration.

O colágeno possui características que fazem com seja amplamente utilizado como biomaterial. A termo-estabilidade do colágeno está diretamente relacionada a mudanças na sua estrutura (hélice tripla) via de regra quanto mais estável termicamente uma matriz, mais estável biologicamente será. Vários poliálcoois incluindo o glicerol têm apresentado um aumento na estabilidade térmica do colágeno tipo I, embora o tipo de interação não seja evidente. Este trabalho tem como objetivo estudar o efeito da adição de glicerol sobre o colágeno aniônico obtido por tratamento alcalino (24 H) em três diferentes tecidos: pericárdio e tendão bovinos e serosa porcina. Para isto são utilizados a espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), termogravimetria e reologia. Os espectros mostraram que o tratamento alcalino e a adição de glicerol não causam desnaturação da proteína de colágeno. A partir dos resultados das curvas termogravimétricas foi observado que o glicerol aumenta a temperatura de decomposição térmica do colágeno. Os resultados dos ensaios de reologia mais precisamente a varredura de deformação mostrou que as soluções de colágeno apresentam G\' maior que G\'\' independente do tecido de origem, e a adição de glicerol não causa mudanças nesta propriedade das soluções. A varredura de freqüência mostrou que as amostras têm características de um gel, sendo G\' maior que G\'\' nas condições de estudo. O ensaio de escoamento a temperatura constante determinou o comportamento pseudoplástico das soluções, e a adição de glicerol causou aumento na viscosidade das soluções sem alterar tal característica. Os ensaios de escoamento com variação de temperatura permitiram determinar a temperatura de desnaturação do colágeno. A adição de glicerol aumentou apenas a temperatura de desnaturação do colágeno obtido por serosa porcina, sugerindo que esta solução é a mais sensível à adição de glicerol. / Several characteristics make collagen widely applied as a biomaterial. The collagen thermal stability is directly related with its structure changes (triple helix), generally, the better is the thermal stability the better is the biological stability. Several polyols including glycerol, has shown a increasing on type I collagen denaturation. The objective of this work is to study the effect of glycerol when mixed with anionic collagen. Type I anionic collagen was obtained after alkaline treatment (24h) of bovine pericardium, bovine tendon and porcine serosa. FT-IR, thermogravimetry and rheology were used. The results of thermal analysis showed that glycerol indeed increases the collagen decomposition temperature. The reologycal tests, precisely strain sweep, revealed that collagen samples have modulus G\' prevailed on modulus G\'\' independent of tissue origin, and glycerol addiction did not change these. The frequency sweep revealed that collagen and collagen:glycerol samples behave like a gel-like substance since both the storage and loss modulus showed dependence with frequency sweep and G\' > G\'\' in all cases. Flow tests at constant temperature revealed that collagen solution behave like a pseudoplastic substance, and glycerol addiction increase solution viscosity and did not change the pseudoplastic characteristic. Flow tests in function of temperature revealed collagen denaturation temperature, but glycerol addiction alters thermal stability (increase of denaturation temperature) only for collagen obtained from porcine serosa.